特定蛋白检测为什么优先选择散射比浊法？

近几年越来越多国内厂家推出基于散射比浊法的特定蛋白检测产品，特别是炎症标志物如C反应蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A（SAA），散射比浊法已成主流。探究个中缘由，除收费以外，也有技术层面的原因。那么，在技术层面上，散射比浊法与透射比浊法相比究竟有何优势？

2021年6月最新发表的《糖尿病肾脏疾病早期预测与诊断专家共识》[1]提到，在尿白蛋白定量检测方法中，免疫散射比浊法灵敏度和特异性均较高，线性范围广，但是需要特种蛋白分析仪；免疫透射比浊法操作简单，多数实验室可开展，但是其灵敏度和特异性不如免疫散射比浊法（图1）。

图1 《糖尿病肾脏疾病早期预测与诊断专家共识》截图编辑

从文献中揭示散射比浊法的优势：

1、灵敏度和测量范围

彭凤等[2]于2012年发表的文章中比较了罗氏cobas6000和西门子BNP常用特定蛋白项目的测量范围（表1），文章认为免疫透射比浊法的检测低限及范围已不亚于免疫散射比浊法。28个项目中，有12个免疫散射比浊法项目的测量范围下限或上限不输于免疫透射比浊法。

根据内部数据，表2对比了深圳市国赛生物技术有限公司（下称“国赛生物”）Aristo（2015年推出）与罗氏cobas6000部分特定蛋白项目（表1）的测量范围。从对比结果可知，在23个特定蛋白项目中，国赛生物有14个项目的检测范围下限等于或低于罗氏cobas6000，19个项目的检测范围上限等于或高于罗氏cobas6000。因此，国赛生物Aristo基于免疫散射比浊法的特定蛋白项目检测灵敏度和检测范围整体上较免疫透射比浊法更有优势。

表2 罗氏cobas6000与国赛生物Aristo特定蛋白项目测量范围对比

2、精密度

段玉东等[3]关于散射比浊法和透射比浊法测定血浆免疫蛋白的比较研究（图2）中，对比了日本OLYMPUS AU640全自动生化仪和贝克曼IMMAGE检测IgA、IgG、IgM和C3、C4的批间精密度和批内精密度。结果显示，散射比浊法的批内精密度和批间精密度明显优于透射比浊法（图2），但准确度方面无显著差异。文中还对透射比浊法测定血浆免疫蛋白的缺陷进行了分析（图2）。

图2 散射比浊法和透射比浊法测定血浆免疫蛋白的比较

李若林等[4]对比研究了透射免疫比浊法和乳胶增强散射比浊法检测不同浓度的ASO、C4的定量结果。结果表明，乳胶增强散射免疫比浊法检测重复性（CV均＜2%）比透射免疫比浊法（CV均＞3%）较好（表3）。

文中对可能的原因分析如下：

（1）两种检测方法的原理不同（图3）。

透射免疫比浊法的基本原理是测定一定体积的溶液通过的光线量(光通量)。当光线通过时，由于溶液中存在抗原一抗体复合物粒子对光线的反射和吸收引起透射光的减少，测定的光通量与抗原、抗体复合物多少呈反比。

散射比浊法是采用指定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原一抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原一抗体复合物颗粒的大小和多少密切相关。

目前利用乳胶颗粒结合散射比浊法，可大大增强血浆蛋白的检测性能，本组对比结果也显示乳胶增强散射免疫比浊法检测重复性比透射免疫比浊法好。

（2）两法的检测线性范围有差别。

乳胶增强散射免疫比浊法所用光源的波长较短，光谱范围广，散射夹角较大，可以适合大小不等的离子和免疫复合物，能检测到较大范围内的散射光。利用微小的乳胶颗粒联接抗体或抗原的技术还可增加检测范围，提高灵敏度。

透射免疫比浊法要求抗原-抗体形成的免疫复合物达到一定的数量，分子颗粒大小较大才能精确测定。它测量的是入射光，因反射吸收后光的衰减，检测器设置在入射光的方向上，故敏感度相对较低。

（3）乳胶增强散射免疫比浊分析仪器有自动稀释和自动重检功能，能获取全部抗原的真实浓度。由于抗原过量，透射比浊法测定时，高值C4浓度测定结果显著低于实际含量。而乳胶增强散射免疫比浊分析仪，会提示应将待测样本进一步稀释，重新进行检测，以获取全部抗原的真实浓度。

张汉园[5]比较了透射比浊法和散射比浊法测定C反应蛋白的结果（表4）。两种方法在CRP低值（1-8mg/L）的测定中相关系数为0.928，较其他CRP水平的相关系数差。分析认为，由于在透射免疫比浊法检测中，如果抗原抗体复合物的数量太少，对光通量的影响不大，在低浓度的C反应蛋白血清测定中会有所影响。而速率散射免疫比浊法是以测定单位时间内抗原抗体反应复合物形成的最快时间段的信号值，产生的散射信号最强，形成最大速率散射信号峰值。理论上讲，该测定不受本底散射信号的干扰，使检测快速，灵敏度高，对检测微量的C反应蛋白比较理想。

此外，检测精密度与试剂原料有密切关系，特别是胶乳微球。因此在试剂研发时选用尺寸高度均一、粒径合适的高品质胶乳微球（图4），有助于提升试剂的精密度、重复性。

图4 国赛生物200nm胶乳微球扫描电子显微镜（SEM）照片 编辑

 3、抗干扰能力

常见的溶血、脂血、黄疸等因素以及类风湿因子（rheumatoid factor，RF）等自身抗体、M蛋白、嗜异性抗体等均会对免疫透射比浊法产生干扰，这些干扰因素可导致待测物的结果出现假性升高或降低。

贾珂珂等[6]研究了常见干扰因素对于免疫比浊法的影响。当尿胆红素浓度为16.85μmol/L（相当于“1+”）时，对免疫透射比浊法的干扰率为22.94%，对免疫散射比浊法的干扰率为15.11%。说明免疫散射比浊法相对于免疫透射比浊法的抗尿胆红素干扰能力更强。

此外，相对于免疫散射比浊法，免疫透射比浊法受M蛋白干扰更明显，其原因可能是免疫散射比浊法在检测前先对样本进行预稀释，降低了M蛋白的干扰。

RF也是目前常见的干扰免疫透射比浊法的内源性干扰物质。RF对免疫透射比浊法的干扰机制主要为RF与试剂2中包被抗体的胶乳颗粒发生非特异聚集反应，造成反应体系的浊度增加。有报道指出，RF可干扰CysC、MMP-3等检测。

嗜异性抗体是由已知或未知抗原刺激人体产生的一类具有足够滴度、能与多个物种的Ig发生相对弱结合的多重特异性Ig。采用免疫学方法的检测试剂使用的抗体大多为动物来源，嗜异性抗体可与多种动物Ig的Fc或Fab表位非特异性结合。在免疫透射比浊法试剂中，一般在试剂2中含有包被检测抗体的胶乳颗粒，嗜异性抗体可结合该检测抗体，发生聚集反应，使浊度升高，对检测造成正干扰。

国赛生物在试剂研发过程中，通过应用封闭剂、抗体定向偶联技术（Antibody Oriented Coating）和HBR主动阻断剂，提高试剂的抗干扰能力。

封闭剂：可有效抑制蛋白质的非特异性吸附，提高胶乳微球及磁珠的胶体分散稳定性，以及偶联物的活性，获得信噪比（S/N比）更高的试剂。

抗体定向偶联技术：利用羧基微球与抗体Fab片段以巯基偶联的方式实现定向偶联，形成抗体微球复合物。该方法能够有效控制抗体与微球连接时的方向，实现定向偶联可以充分保护抗原结合位点活性，减少空间位阻影响，从而提高胶乳增强免疫比浊试剂的灵敏度，并能提高试剂对于类风湿因子(RF)等的抗干扰能力。

主动型阻断剂：能够特异性消除HAMA和RF等异嗜性抗体干扰，使用浓度低，阻断效果强。国赛生物选用高品质HBR主动阻断剂，有效阻断假阳性反应，提高试剂抗干扰能力，有效减少可能的假阳性或假阴性错误检测结果。而传统的被动阻断方法使用非特异性的物质（小鼠IgG、小鼠血清、非特异性单克隆抗体，聚合IgG等）来阻断人异嗜性抗体结合，阻断效果常不够理想。

4、抗原过剩检测和高值样本自动稀释重测

当待测物浓度过高时，免疫散射比浊法和免疫透射比浊法均可能出现检测结果假性降低。钩状效应是影响其结果准确性的一个重要因素。

杨杰等[7]对ASO、mAlb、hs-CRP、β2-微球蛋白、RBP和Cys C 6个项目分别用5种免疫透射比浊法试剂盒进行检测。结果显示，不同试剂盒的抗原过量安全范围差异很大，部分试剂盒受钩状效应影响严重。 大部分国产透射比浊试剂盒并未给出防范钩状效应的有效措施，还遇到按厂家提供的前带检查参数设置检测程序后并不能防止抗原过剩现象的情况，参数的可靠性有待商榷。

杨杰等[8]还对比了5种免疫透射比浊法试剂盒检测特定蛋白钩状效应的性能，结果发现不同厂家免疫透射比浊法试剂盒钩状效应性能不同，很多厂家仅声明了分析测量范围的上限，未对钩状效应的限值作出说明。因此建议实验室在选择试剂盒时对其防范钩状效应性能进行验证很有必要，同时还有必要结合测量程序的优化报警参数。

总的来说，对于透射比浊法，虽然部分中高端生化分析仪也宣称支持抗原过剩检测和自动稀释重测，但一般只能以固定稀释倍数稀释样本，仍有发生抗原过量的风险。此外，市场上生化分析仪品牌、型号众多，医院所用的生化试剂很多为非原厂配套试剂，而生化试剂厂家在抗原过量参数方面的研究也不够充分，造成相关参数缺失，一定程度上限制了抗原过剩功能在透射比浊平台的应用。

国赛生物的Omlipo傲立和Aristo傲瑞全自动特定蛋白分析仪支持抗原过剩检测，结合超过检测范围时的样本自动重测功能，对一些容易出现抗原过剩的项目如尿微量白蛋白（mALB）、尿转铁蛋白（TRU）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）等，可以及时识别和处理，减少因抗原过量而导致检测结果错误低值的情况。

国赛生物Aristo傲瑞的抗原过剩检测具体过程如下：

首先，在预反应中，用全量试剂和部分样本进行反应。

如果超出定义限值的信号显著上升，仪器将使用设置的稀释度自动重测（前提是已设置自动重测功能），样本自动稀释后，将执行一次预反应程序，若此时信号值仍超出定义限值，则报告抗原过剩报警（不报告具体数值）。

若预反应信号值未超过定义限值，则在预反应完成后，加入其余样本并进行后续反应。

【写在最后】

无论是散射比浊法还是透射比浊法，目前都在临床上得到普遍应用。在特定蛋白检测方面，散射比浊法相较于透射比浊法有着天然的方法学优势。但即便如此，不同厂家的试剂性能仍存在相当大的差异，这是因为最终的试剂性能除与仪器设备稳定性、方法学、抗原过剩检测等有关以外，还与试剂胶乳颗粒、抗体、抗干扰能力（阻断剂）、生产工艺、质量控制等因素有密切关系。用户在对比试剂产品时，应综合考虑这些影响因素，选择品牌知名度高，检测方法学先进，仪器功能全面，试剂稳定可靠的产品。

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参考文献

[1]  张俊清, 苏白海, 张捷,等. 糖尿病肾脏疾病早期预测与诊断专家共识[J]. 中华内科杂志, 2021, 60(06):522-532.

[2]  彭凤. 免疫透射比浊测定技术的进展和分析特性[J]. 检验医学, 2012, 27(004):252-256.

[3]  段玉东, 桑俊军, 闫海鹏,等. 散射比浊法和透射比浊法测定血浆免疫蛋白的比较[J]. 中国医药导报, 2008, 005(002):87.

[4]  李若林, 邓雪莲, 徐明辉,等. 两种方法测定ASO,C4结果的可比性研究[J]. 国际检验医学杂志, 2010, 031(002):105-106.

[5]  张汉园. 透射免疫比浊法和速率散射免疫比浊法测定C反应蛋白的比较[J]. 江苏大学学报(医学版), 2004, 14(004):348-348.

[6]  贾珂珂, 孙文苑, 聂睿,等. 免疫透射比浊法常见干扰因素的识别与应对策略[J]. 检验医学, 36(4):7.

[7]  杨杰, 李茂城, 尹小毛,等. 27项特定蛋白项目检测结果分析及钩状效应的防范方法[J]. 检验医学与临床, 2019, v.16(01):14-18.

[8]  杨杰,李玲,张瀚允,张鹏,曾方银.5种免疫透射比浊法试剂盒检测特定蛋白钩状效应的性能评估[J].国际检验医学杂志,2019,40(2):140-143.