编译：微科盟索亚，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
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导读
地下水是一种宝贵的全球资源，而矿井的开采和废水排放严重影响着地下水生态系统。原核生物（细菌和古菌）参与了地下水生态系统的各种生物地球化学循环过程，尤其在地下水碳和养分循环中发挥着重要作用，是维持地下水生态系统功能健康的重要组成部分。地下水污染不仅直接影响地下水质量，而且会导致原核生物群落生物多样性丧失，从而改变各种生物地球化学循环过程。关于地下水原核生物群落对污染的响应一直是本领域研究的重点（碳氢化合物、铀和金属、一般农业/工业污染物和盐度等）。本文通过在潮湿干燥的热带环境中，研究浅沙含水层中原核生物群落组成和预测相关的功能过程。结果表明，矿井水污染物的盐度梯度主要由高浓度的镁（Mg2+）和硫酸盐（SO42-）、常量离子及微量金属元素组成。暴露于矿井水后，原核生物群落组成和功能过程发生显著变化。与参考地点相比，暴露地点的地下水原核生物群落中甲烷氧化菌（甲基球菌科）和产甲烷菌（甲烷杆菌科）的丰度显著降低，而与硝化作用（亚硝基球菌科）相关的亚硝基球菌科的丰度较高，表明暴露地点的生物地球化学循环可能发生显著变化，而这些变化与Mg2+、SO42-和Na+的浓度的相关性最高。本研究得到的结果可以帮助评估矿井水污染对地下水生态系统功能的风险，帮助我们了解地下水污染对原核生物群落的影响，有助于地下水生态系统的保护以及矿井水排放的管理。
原名：Saline mine-water alters the structure and function of prokaryote communities in shallow groundwater below a tropical stream
译名：含盐矿井水改变了热带河流下浅层地下水原核生物群落的结构和功能
期刊：Environmental Pollution
IF：8.071
发表时间：2021.5.12
通讯作者：Lisa Chandler
通讯作者单位：澳大利亚农业、水和环境部
试验数据包括了在矿井水污染区域暴露点（Exposed，n=5）以及上游（Upstream，n=6）、下游（Downstream，n=3）和相邻的中央小溪道（Central，n=3）。参考地点天然浅层地下水通常呈酸性（pH=4.8-6.4），电导率较低（EC < 50 μS cm-1），碱度、主要离子浓度以及金属元素的浓度如图1所示。与参考地点相比，暴露于矿井水的地点通常具有更低的氧化还原值，以及略低的pH值（4.54-5.93）。所有采样地点均处于亚氧或缺氧条件（溶解氧浓度都< 1 mg L-1），并且温度较高（27-32°C）。NO2-与NO3-的浓度低于检测限（< 0.005 mg L-1），溶解性有机碳的变化范围很大（0.84–998 mg L-1），中值为15 mg L-1。在暴露地点，在样品中检测出SO42−，Mg2+和Mn（矿井水含有的污染物）浓度显著升高（P < 0.001），Na+、Cl-和Fe的浓度同样显著升高，而Ca2+的浓度降低。
主成分分析（PCA）表明，暴露地点和其它参考地点的环境特征明显分离，沿第一轴分离的样品与Mg2+和EC呈正相关，与Mn呈正相关。第二轴分离样品，以Ca2+为基准（r > 0.7），Mg2+浓度与EC有很强的线性关系（图2）。与2017年相比，2018年许多化学元素的浓度较低（图1），但不显著，这可能是由于2018 年采样前期降雨量略高导致的。PCA中2017年和2018年数据点的分组分布表明水质的年际变化程度较低。
图1. 不同取样点2017、2018年样品理化性质箱线图，箱线图的上下边缘分别表示第一个和第三个四分位数（25%和75%个百分位数），水平线表示中位数。
图2. 基于样品环境特征的主成分分析（相关性>0.5，DPW：与永久地表水的距离; SWL：滞留水位）。
在
17个采样点采集的样品中存在1606个特有OTU，其中细菌占83%（1332 OTUs），古细菌占17%（274 OTUs）。所有的OTU被划分为31门，66纲，107目，165科，255属。其中，27%在门水平上的OTU无法鉴定（细菌24.9%，古细菌2.5%），43%在属水平上无法鉴定。除去无法鉴定的OTU，优势菌门属于变形菌门（35.6%）、酸杆菌门（5.4%）、奇古菌门（5%）、厚壁菌门（4.9%）、广古菌门（4.5%1）和泉古菌门（4.2 %），总共约占总量的60%。细菌由25个已知的门组成，主要组包括变形菌门（43.9%）、未分类的细菌门（30.7%）、酸杆菌门（6.6%）和厚壁菌门（6.1%）。变形菌门拥有最高的属水平多样性（总共117属），其中甲基单胞菌属的相对丰度最高（11%）。酸杆菌门包括了13个纲，其中地发菌属是丰富度最高的属（27%）。厚壁菌门的OTU分为4个纲，狭义梭菌属是其中丰富最高的属（25%）。而古细菌由五个门水平组成，其中大多数OTU分配给奇古菌门（9%）、广古菌门（29%）和泉古菌门（16%）。亚硝化球菌属是奇古菌门中的优势菌属（99%）。广古菌门是多样性最高的古菌门，由4纲的12属组成，其中甲烷杆菌属（37%）是优势属。与其它参考地点相比，矿井水暴露地点的未分类细菌所占比例显著增加（图3）。甲基球菌科、甲烷杆菌科、Clostridiaceae 1以及其他科水平上甲基营养菌在暴露地点不存在或相对丰度小于1%。而螺杆菌科在上游地点不存在或相对丰度小于1%，但在下游和中心地点以及暴露地点都存在。
图3. 不同采样地点原核生物在科水平上的相对丰度（总丰度 < 1%被归为“其它”）。
原核生物群落的
nMDS分析图显示了暴露地点和其它参考地点之间存在明显的群落分离（图4A），PERMANOVA分析表明了暴露组、取样年份和地点之间存在显著差异（p < 0.01）（表S5）。暴露分组、取样点是群落结构变异的最大贡献者，而取样年份虽然在统计学上显著（p = 0.01），但重要性不如其他因素。对暴露组进行配对比较，表明暴露地点与各参考地点差异显著，参考地点之间差异不显著。在暴露分组和采样年份间数据离散度差异不显著（PermDISP，p > 0.05）（表S5），表明这些组间差异对结果没有影响。然而，各采样点之间的数据离散度存在显著差异（PermDISP，p = 0.016），表明PERMANOVA结果也受到离散度差异的影响（表S5），聚类分析也显示每个站点的样本倾向于聚集在一起（图S6）。群落结构与环境变量之间的关联分析表明暴露组和参考组之间存在明显的群落分离（图4B），暴露地点样品沿第一轴（右）分离。Na+、SO42-和Mg2+浓度在群落结构变异中所占比例最大，分别为12.4%、11.8%和11.2%（表S6）。丰富差异分析表明，在暴露地点和参考地点的OTUs相对丰度差异显著（p < 0.01）(图5)。与暴露地点相比，参考地点中属于β变形菌纲的未分类科、甲烷杆菌科、甲基球菌科的相对丰度显著增加。而在暴露地点，亚硝基球菌科、属于热变形菌目和弯曲菌目未分类科的相对丰富度更高。
图4.（A）原核生物群落结构nMDS分析图。虚线圆圈代表通过SIMPROF检测识别出的具有45%相似性的重要集群。（B）原核生物群落结构dbRDA分析图。表示了原核生物群落与环境变量之间的关系。
图5. 科水平上26个丰度最高的原核生物在参考地点和暴露地点之间显示的丰度差异。
圆圈大小科水平OTU的丰富度，颜色深度表示相应科水平不同OTU的数量。FAPROTAX功能预测确定了69个功能类群，每个功能类群包括至少一个OTU，其中化能异养是主要功能类群（占17.7% OTUs）。分配给化能异养的out同时还与其它功能过程有关，如甲基异养、烃类降解和芳香化合物降解。与参考地点相比，暴露地点显著（Kruskal-Wallis，p < 0.001）降低了与化学异养、烃类降解、甲基异养和甲烷异养相关的OTUs的相对丰度(图6)，同时显著（Kruskal-Wallis，p < 0.001）提高了参与硝化、脲酶解反应的基团和参与硫循环的基团（即硫化合物的还原）的丰富度（图5）。在nMDS分析图中，暴露地点与参考地点功能类群分离（图7A），但是没有群落组成差异显著。PERMANOVA分析表明了暴露分组、地点和采样年份间均有显著差异（表S8）。暴露分组、采样地点是产生变化最大的部分（表S8）。暴露组之间在年份间没有显著差异（p = 0.49），但采样站点在年份间的响应存在显著差异（p = 0.001）。对暴露组进行配对检验发现，各参照组与暴露组差异显著。原核生物群落功能类群与环境因子的相关性分析（图6B）表明，Na+和SO42-对功能组分变化的解释率最多（分别为15%和13%），其次是Mg2+（10%）和Cl-（9 %）。
图6. 丰富度最高的35个功能类群分布的热图，按取样点排序。颜色越深丰富度越高。
图7.（A）原核生物群落功能nMDS分析图。虚线圆圈代表通过SIMPROF检测识别出的具有80%相似性的重要集群。（B）原核生物群落功能dbRDA分析图。表示了原核生物群落功能与环境变量之间的关系。
通过我们研究结果发现，地下水原核生物群落组成和功能的变化与含盐矿井废水引起的污染密切相关。与参考地点（污染区域附近、上游以及下游）相比，来自暴露地点的样品的Mg2+、SO42-、Na+、Cl-、Fe和Mn浓度显著升高。高浓度Mg2+和SO42-是矿井造成的水污染的标志。虽然Mn在一些矿井水含量高，但在天然条件下的地下水中也存这样的现象，而其中一个参考地点（MCP03）的样品中的锰浓度高达（340–410 μg L-1）。在参考地点，弱氧氧化还原条件和较低的pH有利于游离Mn2+浓度升高，这也可能砂砾中微生物所介导溶解的。在暴露的地点也存在高浓度的Fe（主要为Fe2+），这是一种与矿井水无关的污染物，我们在暴露地点周围的沙道沉积物中观察到了氢氧化铁沉淀，这表明存在能够氧化铁离子的细菌。因此，矿井水的输入、微生物活动以及氧化还原条件的影响共同导致暴露地点的锰和铁浓度升高。在马格拉河流域，当Mg2+浓度超过3 mg L-1时，会对当地地表水物种产生毒性。在矿井污水中，Mg2+与SO42-含量有很强的相关性，但SO42-对表层水生生物的毒性不高。而由于Mg2+的高毒性和高迁移率，Mg2+成为玛格拉河流域最受关注的污染物。尽管这两种主要离子具有很强的相关性，但是与
Mg2+
浓度升高相比，SO42-浓度升高更有可能影响该系统中地下水原核生物群落。Mg2+和SO42-会通过各种机制作用于原核生物，而这一过程主要取决于他们的浓度。研究表明，高浓度的Mg2+可以通过破坏膜功能，减少细菌对表面的粘附性和破坏生物膜的组装来降低金黄色葡萄球菌对外界胁迫的抵抗力能力和存活率。然而，要达到这种破坏效果所需要的的浓度明显高于我们的样品中的Mg2+浓度，表明在我们所研究的水域Mg2+的直接毒性不太可能发生。SO42-作为许多原核生物的能量来源，其浓度的增加与原核生物群落结构和功能的改变有关。虽然本研究未探究Mg2+与SO42-浓度升高影响原核生物的具体机制，但我们推测，在玛格拉河浅层地下水中，原核生物群落变化可能是由于响应硫酸盐的物种优先生长，进而导致与此过程有协同关系的其他物种发生了复杂的生物地球化学循环变化。在野外和实验室研究中，SO42-浓度升高与原核生物群落结构的变化有关，这些发现与我们的结果一致。与硫酸盐还原菌（SRB）（例如Desulfovibrionaceae、Desulfobulbaceae和Desulfobacteraceae）相关的OTU在暴露地点普遍存在（图S7），但他们只代表了样品中的很小一部分，其相对丰富度占比不超过0.5%。Flynn等人发现SRB在含水层内附的沉积物上的相对丰富度是地下水中的4倍。在本研究中，暴露地点有很强的H2S气味，表明了硫酸盐还原的发生，但与此过程相关的生物丰度不高，因此没有在暴露地点与参考地点的分析中作为主要判别因子。然而，这项研究只检测过滤后的地下水样本和其他可能与硫化合物的还原有关的附着的生物群，所以在今后探究原核生物在这些过程中的作用有巨大的研究价值。在暴露地点的样品中，与产甲烷菌相关OTU（例如甲烷杆菌科）的相对丰度较低。Flynn等人研究表明，在SO42-大于0.03 mM（~3 mg L-1）的矿井中，产甲烷菌丰度相对较低，这可能是因为产甲烷菌在SO42-还原条件下无法生存。Raskin等人发现添加30 mg L-1的SO42-会导致产甲烷菌浓度降低（25%至8%），并且效果会持续一年。这可以解释了为什么即使在研究的第二年，检测到的SO42-浓度仍然在下降，并且在暴露地点中产甲烷菌仍然不存在或者相对丰度非常低。在来自暴露地点的样品中，与甲烷氧化（即甲烷氧化菌）相关的OTU，例如甲基球菌科的含量很低。与此相关的化学异养、甲烷氧化和其他含碳化合物氧化等功能类群同样在暴露地点的样品中含量较低。氧化还原电位是影响甲烷氧化最重要的因素之一，因此氧化还原电位值较低的暴露地点不利于甲烷氧化菌的生长。除了Mg2+和SO42-之外，我们还将Na+确定为可能影响暴露地点和参考地点原核生物群落结构和功能差异的驱动因素。Na+与Mg2+和SO42-具有很强的相关性(r > 0.80)，且在马格拉河暴露地点浅层地下水中Na+浓度高于参考站点，这可能与矿井水排放有关。然而，在矿井附近的地表水中Na+并未升高，所以Na+也未被确定为潜在水质污染物进行监测。所以在有限的Na+毒性检测中，尚不清楚Na+在何种浓度下对当地地表水生物会产生不利影响。由于马格拉河水质极软，河流生态系统可能对排放到马格拉河的地表水中高浓度的Na+十分敏感。目前，关于Na+对原核生物群落影响的研究也十分有限，主要是探究NaCl对淡水生态系统中沉积物原核生物群落的影响。Baldwin等人发现，只有在高浓度NaCl（2352 mg L-1 Na+）下，湿地沉积物细菌群落才会发生变化，但是，即使在低Na+浓度（57 mg L-1）下，古菌群落结构会发生显著变化，同时甲烷产量也显著下降。甲烷产量下降是由于甲烷八叠球菌属和甲烷发菌属所介导的乙酸发酵型甲烷化过程被抑制所导致的。在我们的结果中，这些类群在暴露点的相对丰度普遍低于参照点，同时在所有样品中的丰度很低（< 1%），这表明在马格拉河浅层地下水生态系统中，乙酸发酵型甲烷化过程并不是一个主要的过程，并且对Na+的响应可能与其他类群和过程有关。同样，盐度升高（NaCl）也与硝化活性降低有关，但其Na+浓度比我们样品测定的高得多。在实验室研究中，Beyer-Robson发现盐度为10 000 μS cm-1时，砂质沉积物硝化过程速率降低，但是在我们的研究中出现了相反的情况，硝化相关的类群（即亚硝化球菌属）在暴露（150 μS cm-1）相对丰度高于参考地点，这可能是由于我们的样品中主要离子之间高相关性的结果。然而，我们样品中存在的高浓度Na+和Mg2+，对原核生物群落产生影响可能是独立作用或者共同作用，甚至可能是拮抗作用，这需要进一步研究浅层地下水系统中不同离子浓度对原核生物群落的影响。采样位置对原核生物群落结构也有很大影响，但对功能类群影响较小组，表明沙道浅层地下水中的原核生物群落结构存在很大的空间异质性，但可能与地下水化学性质相关性不大。我们的研究地点分布在河道的7公里范围内，最近采样点之间的距离为10 m（图S1）。各采样地点的物理差异很可能与孔隙度、有机碳含量（包括叶叶凋落物和河岸植边的物根系）等因素有关。Brad在受垃圾渗滤液影响的含水层沉积物样品中发现，采样深度距离1 m的细菌群落存在空间特异性。Lin发现从非承压含水层中相距约30 m的钻孔收集的原核生物群落在横向和纵向都存在空间异质性，并提出这些变化可能与栖息地异质性有关，例如含水层内砾石之间的空隙，同时该研究还发现地下水高程的波动具有很强的时间变化特征，同时影响地球物理和水化学变量。虽然 PERMANOVA分析显示采样年份对原核生物群落组成变化的影响很小但显著，但这些差异在nMDS分析中不显著。原核生物群落结构的年际变化可能是由于水化学性质的变化，在污染区域的差异尤其明显。在研究的第二年，暴露组地点的污染物（例如Mg2+和SO42-）的平均浓度降低了至少50%，这可能是由于采样之前降雨量更大，雨季持续时间更长，导致了更大和更长的地表流量，并且会导致污染流域在纵向稀释。同时，这两年样本的测序深度有相当大的差异（图S5），尽管进行稀疏测定科研尽量减少这种批次效应，但也可能导致了年份之间的统计差异。预测的原核生物群落功能类群存在相当大的分类变异性，同样的OTU会分配给四个或更多不同的功能类群，表明在浅层地下水原核生物群落中存在功能冗余。这就解释了为什么与群落组成结构相比，在功能类群中观察到的暴露组之间的分离不那么明显。然而，在原核生物群落中大部分多未分类的OTU属于门水平，而FAPROTAX功能预测的大部分功能类群是在属和种水平上，因此FAPROTAX功能预测可能忽略了其他水平的OTU的功能。在对卡卡杜国家公园内泛洪区平原和死水潭沉积物样本中原核生物群落的研究中，也发现了大量未分类的序列，这些序列被认为可能是热带生态系统所独有的。Sutcliffe等人利用鸟枪宏基因组学与16S rRNA扩增子测序进行比较，发现鸟枪宏基因组学比16S扩增子测序识别出更多的物种，因此，在地下水原核生物群落研究的不足需要依靠宏基因组测序来完成。总的来说，这是第一次关于马格拉河浅层地下水原核生物群落的研究，揭示沙道流域基本原核生物群落特征以及矿井水导致Mg2+和SO42-浓度升高，同时会在局部区域内造成重要的生物地球化学循环过程（硝化作用增加和甲烷氧化作用减少等）。尽管地下水原核生物群落与生物地球化学循环相关，但并未将其广泛用于评估矿井对地下水的影响，我们的研究证明了地下水原核生物可以为矿井水管理提供有用的信息。
尽管关于采矿业对安利格特河区域影响的研究已有相当长的历史，但本研究是首次调查矿井水污染对安利格特河区域地下水原核生物的影响。我们的研究表明，地下水原核生物受到矿井水污染时，群落结构和功能类群在会发生显著变化。尽管Na+被认为与原核生物结构和功能相关性较高，但本研究中的污染主要与Mg2+和SO42-相关。综上，这些知识有助于评估采矿对地下水生态系统的潜在影响，并将有助于对开采中的矿井水进行管理。
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