DNA甲基化技术革新：高效eTAPS甲基化酶法转化试剂盒！

2021-09-24 08:44

据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，2020年全球新发癌症病例 1929万例，死亡病例996万例，中国癌症死亡人数位居全球第一。

据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，2020年全球新发癌症病例 1929万例，死亡病例996万例，中国癌症死亡人数位居全球第一。统计发现，癌症临床期早期的平均治愈率在80%以上，通过早筛识别出肿瘤发病前兆，及时干预，可以挽救无数患者生命。

图1. 疾病发展和五年生存率曲线（引自诺辉健康招股书）

据不完全统计，仅2020年国内16家早筛企业就完成了17笔融资，累计约63亿人民币。此外，2021年2月18日，诺辉健康正式在港交所挂牌上市，成为中国癌症早筛第一股。放眼国外，美国Illumina宣布以80亿美元完成GRAIL收购交易，癌症早筛企业 Exact Sciences以21.5亿美元收购液体活检初创公司Thrive……国内外癌症早筛市场迎来了蓬勃发展。

表1. 近一年早筛企业融资统计（信息来源于网络）

癌症早筛标志物
DNA甲基化“C”位出道

在全球，已有多家生物技术公司重点研发基于DNA甲基化的液体活检技术平台，以期实现癌症早筛。目前，癌症早筛标志物包括CTC、外泌体、ctDNA等。在肿瘤早期，ctDNA突变频率低至0.01%，检测时难度较大。

2017年，鹍远基因联合创始人、美国加州大学圣地亚哥分校生物工程系张鹍教授利用开发的高通量甲基化无创检测新技术MONOD，首次实验证明可以利用血液中的ctDNA甲基化信号进行癌症筛查和溯源。

目前已有多项研究表明，DNA甲基化检测在癌症早筛领域有巨大的应用潜力，国内外多家癌症早筛公司都瞄准DNA甲基化检测发力，其主要优势有：

1. ctDNA的甲基化往往发生在数以千计的CpG位点，CpG岛富集效应可显著提高甲基化信噪比；

2.甲基化修饰成簇分布，形成的信号和条形码几乎一模一样，较碱基突变的特异性更高；

3.甲基化修饰数量更多，对环境变化更敏感，能更早反映患者体内细胞癌变微小变化；

4.基于不同组织间的甲基化异质性，精准区分原发病灶和转移病灶。

此外，癌症早筛公司GRAIL在其CCGA-1子研究中将点突变、拷贝数变异和甲基化三种标志物进行对比，发现甲基化在信号丰度、组织溯源等层面显著优于其他检测指标，其中靶向甲基化测序的LoD接近0.1%，能够有效捕捉来自肿瘤的信号。天生的优势使得DNA甲基化检测成为众多致力于癌症早筛的研究团队和企业眼中的宠儿。

甲基化检测，高效转化是关键

DNA甲基化检测首先要进行甲基转化，目前有两种方案，一种是通过将非甲基化的C转化为U，另一种是将甲基化的C转化为U。前者以重亚硫酸盐测序（BS-Seq）为代表：利用重亚硫酸盐（Bisulfite）将DNA上未发生甲基化的C转变成U（甲基化C则不受影响），由此鉴定甲基化位点，转化效率高达99%，但BS-Seq缺点也十分突出：

Bisulfite会导致DNA断裂损伤，不适合在珍稀样品（如cfDNA）中应用；
Bisulfite转化后的文库GC占比失衡，AT会过度测序，故数据不能真实反应样本表观修饰情况；

后者以牛津大学宋春啸团队开发的TAPS（TET-assisted pyridine borane sequencing）为代表，这是一种无需亚硫酸氢盐、破坏性更小、效率更高的单碱基分辨率DNA甲基化测序方法。该技术利用TET酶将5mC和5hmC氧化成5-羧基胞嘧啶（5caC），然后经吡啶硼烷将5caC转化成U，PCR扩增后用于测序。目前，TAPS-seq的氧化剂TET1转化率为75%，需将氧化-消化-核酸纯化进行2次以提高甲基化转化率，建库前利用柱法回收，整体上实验过程繁琐、效率较低。

图2.甲基化转化两大类原理流程对比。

为解决TAPS-seq的痛点，翌圣生物基于自主生物专利技术，使用定向进化技术获得了高活性的eTET酶，并对实验流程进行优化，具体优势如下：

1. 酶法对样本转化更温和，减少了对DNA损伤。 转化错误率远低于Bisulfite ，因此获得数据更能反应样本真实表观修饰；

2. 酶法转化效率≥97% ，因此只需要1次氧化-消化-核酸纯化即满足转化需求，极大简化了实验步骤并节省时间；

3. 特殊处理的磁珠回收代替柱回收，整个转化过程 只需要一次DNA回收 ，提高了回收效率且适应自动化， DNA回收率高于35% 。

图3. 翌圣eTAPS转化流程

图4. Bisulfite、TAPS、翌圣eTAPS转化率，转化错误率以及DNA回收率对比

基于翌圣生物开发的eTAPS酶法转化技术，可以更高效对各类型样本中甲基化位点进行转换 ，结合翌圣生物研发的各类DNA建库试剂盒，可助力DNA甲基化在科研、临床、特别是早筛市场上应用。

产品信息

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关于翌圣生物

翌圣生物科技（上海）股份有限公司 (Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) 成立于2014年，长期专注于分子酶原料及建库试剂盒等产品的研发和生产。我们的目标让下游企业节省更多的成本，为中国精准医疗的发展贡献自己的力量。翌圣生物拥有先进的分子酶双向技术平台、大规模蛋白发酵纯化技术平台、高效抗体筛选技术平台，目前已成功开发各类诊断分子酶、二代测序建库酶等40余种，并实现工业放大。翌圣生物开发的用于基因检测、体外诊断（IVD）相关酶原料获得了广大客户的认可。此外，我们还为工业客户提供定制化开发服务，以满足个性化需求。

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