编译：微科盟北岸，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
导读
肠道微生物群是宿主生活和环境适应不可或缺的组成部分，对于理解宿主的适应机制至关重要。赤狐（Vulpes Vulpes）比沙狐（V. corsac）拥有更广泛的生态位和更复杂的栖息地。然而，适应性机制（特别是导致这种差异的肠道微生物菌群）仍然不清楚。因此，我们对呼伦贝尔草原两种狐属动物的肠道微生物组进行了研究，并揭示了它们的肠道微生物组成、功能和适应机制。通过16S rRNA基因和宏基因组测序，研究了赤狐和沙狐的肠道微生物群和代谢功能。两种狐狸具有与生态位和生境相关的物种特异性微生物群和功能。赤狐肠道菌群具有丰富的拟杆菌属（Bacteroides），这导致了代谢途径（K12373和K21572）和与几丁质和碳水化合物降解相关的酶的显著富集，这可能有助于赤狐适应更广泛的生态位。沙狐肠道菌群富含Blautia、Terrisporobacter和ATP结合盒式（ABC）转运蛋白（K01990，K02003和K06147）这可以帮助沙狐在恶劣的栖息地生存。这些结果表明，赤狐和沙狐的肠道微生物群可能具有不同的能力，这可能为赤狐和沙狐提供了适应不同生态位和生境的能力，从而为了解宿主对不同生态位和生境的适应机制提供了重要的微生物群数据。
原名：Comparative Analyses of the Gut Microbiome of Two Fox Species, the Red Fox (Vulpes Vulpes) and Corsac Fox (Vulpes Corsac), that Occupy Different Ecological Niches
译名：占据不同生态位的赤狐（Vulpes vulpes）和沙狐（Vulpes corsac）肠道微生物组比较分析
期刊：Microbial Ecology
IF：4.552
发表时间：2021.6.30
通讯作者：张洪海
通讯作者单位：曲阜师范大学生命科学学院
研究人员通过雪地足迹链一共采集到24份粪便，并对粪便的生物体进行了初步的判定。样品1、2、3、4、5、7、8、9、11和13属于赤狐粪便（
在赤狐足迹链上发现），并且剩余样品（
6、10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24）属于沙狐粪便（在沙狐足迹链上发现）。然而，由于这种方法的识别可能存在偏差，研究人员扩增了24个粪便样本的D-loop序列和
Cytb
基因序列。
D-loop
序列可以在部分样品中（1、2、3、4、5、7、8、9、11、13、14、16和17）成功扩增，但在剩余的样本中（6、10、12、15、18、19、20、21、22、23和24）未能成功扩增。因此，研究人员使用Cytb基因引物（基于沙狐线粒体设计）鉴定剩余样品。然而，只有样品15和21在剩余样本中成功扩增出Cytb基因序列。研究人员通过Mega软件使用邻接法鉴定物种。图1A展示了样品14、16和17是沙狐粪便（与沙狐聚为一支），而其他样品（
1
、2、3、4、5、7、8、9、11和13）是赤狐粪便（与赤狐聚为一支）。图1B展示了样品15和21是沙狐粪便（与沙狐聚为一支）。研究人员将赤狐和沙狐的样品分组为CH组（CH1、CH2、CH3、CH4、CH5、CH7、CH8、CH9、CH11和CH13）和SH组（SH14、SH15、SH16、SH17和SH21）。
图1 通过NJ法构建D-loop区（A）和Cytb基因（B）的系统发育树。为了了解生态位对赤狐和沙狐肠道微生物组成的影响，研究人员分析了16S rRNA基因测序数据。从15个样本中获得了926 441个高质量reads。在97%相似度阈值下，高质量reads被划分为723个OTUs（赤狐）和513个OTUs（沙狐）。测序结果用于描述每个样本的细菌群落多样性。Alpha多样性指数列于表S1（包括observed species、Shannon、Simpson、Chao1、ACE和Goods coverage）。物种积累箱形图表明样品的数量足以进行实验分析。在我们的研究中，尽管增加测序深度可以检测到新的OTUs的可能性，但稀释曲线趋于平缓，该研究挖掘了所有样品的微生物群落多样性。
在门分类水平上，CH组有15个菌门，SH组有13个菌门。厚壁菌门（Firmicutes，赤狐：39.34%±15.33%；沙狐：61.16%±20.40%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，赤狐：30.30%±11.51%；沙狐：15.01%±11.04%）、梭杆菌门（Fusobacteria，赤狐：24.71%±11.37%；沙狐：18.67%±11.04%）、变形菌门（Proteobacteria，赤狐：3.99%±2.08%；沙狐：2.77%±2.79%）和放线菌门（Actinobacteria，赤狐：1.26%±1.39%；沙狐：1.94% ±1.95%）是赤狐和沙狐肠道菌群的优势菌门（图2A）。在属分类水平上，赤狐有156个菌属，沙狐有144个菌属。Fusobacterium是CH组（25.19%±11.38%）和SH组（18.67%±11.04%）丰度最高的菌属。此外，Bacteroides（CH组 23.66%±8.46%；SH组 6.68%±4.34%）、unidentifed_Clostridiales（CH组 7.59%±4.69%；SH组 5.70%±4.20%）、Peptoclostridium（CH组 4.12%±3.29%；SH组 4.50%±1.56%）和Blautia（CH组 3.42%±2.62%；SH组 10.13%±4.11%）是赤狐和沙狐肠道菌群中其他的优势菌群（图2B）。
图2 赤狐和沙狐在门分类水平（A）和属分类水平上（B）的菌群组成。每个条形图代表每个样本中相对丰度排名前10的细菌。Alpha多样性的t检验（observed species, p = 0.69；Shannon, p = 0.36）在箱线图中显示（图3）。CH组和SH组的菌群群落多样性和丰富度没有显著性差异。PCoA图显示CH组和SH组的肠道菌群分别聚集在一起（图4）。通过ANOSIM分析发现CH组和SH组的肠道菌群beta多样性有显著性差异（R = 0.60, p= 0.002）。研究人员通过LEfSe分析（LDA score> 4，p < 0.05）两个组的差异菌群。在科分类水平上，拟杆菌科（Bacteroidaceae）在CH组中显著富集，毛螺菌科（Lachnospiraceae）和Christensenellaceae在SH组中显著富集。在属分类水平上，拟杆菌属（Bacteroides属于拟杆菌科）在CH组中的丰度显著高于SH组。Blautia（属于毛螺菌科）和Terrisporobacte（属于Peptostreptococcaceae）在SH组中丰度显著高于CH组（图5）。
图3 observed species (A) 和 Shannon (B)的箱线图。
图5 基于生物标志物的LDA分布直方图和系统进化分布，CH组和SH组丰度差异具有统计学意义。研究人员基于PCoA图挑选了CH1、CH2、CH3、CH4、CH5、CH7、CH11、CH13、SH14、SH15、SH16和SH21去构建宏基因组文库（图4）。基于宏基因组文库浓度（>20 ng/μl），研究人员挑选了CH5、CH11、CH13、SH14、SH15和SH21用于宏基因组测序。从6个样品中获得了45.17 Gb的高质量数据。通过数据质量控制和筛选，共获得45.07 Gb的clean data，有效率达99.50%以上（表1）。Core-Pan基因的
稀疏曲线趋向平坦并且随着数据的增多而接近，表明采集的样本可以满足后续生物信息学分析的要求。相关性热图分析显示组间差异大于组内差异。这些结果表明，样本选择是可靠的，分组是有意义的。为了描述肠道菌群功能的组成和发现两个物种之间的功能差异，使用
KEGG和CAZy数据库对clean data进行功能分析。
通过宏基因组分析，共鉴定了7006个KEGG直系同源（KO）分类，包括6个KEGG Level 1分类、45个KEGG Level 2分类和383个KEGG Level 3分类。在
KEGG Level 1
分类水平上，代谢（CH组 13.72% ± 0.69%；SH组 14.87% ± 0.25%）、基因信息处理（CH组 5.36% ± 0.25%；SH组 5.77% ± 0.24%）和环境信息处理（CH组 2.81% ±0.18%；SH组 4.16% ±0.04%）是赤狐沙狐肠道菌群中排名前三的功能。在KEGG Level 2分类水平上，碳水化合物代谢（CH组，3.62% ± 0.27%；SH组 4.17% ± 0.17%）和氨基酸代谢（CH组 2.83% ± 0.14%；SH组 3.29% ± 0.12%）是赤狐和沙狐肠道菌群中的优势功能。在KEGG Level 3分类水平上，ko00230（嘌呤代谢：1.47% ± 0.04%）和ko02010（ABC转运蛋白：2.05% ± 0.06%）分别是赤狐和沙狐肠道菌群中的丰度最高的代谢途径。基于
CAZy
数据库，肠道菌群的unique基因共鉴定出544个ECs，包括6个CAZy模块和257个酶家族。在CAZy Level 1分类水平上，糖苷水解酶（GH）（CH组 1.96% ± 0.30%；SH组 1.59% ± 0.28%）、糖苷转移酶（GT）（CH组 0.83% ± 0.03%；SH组 0.77% ± 0.03%）和碳水化合物结合模块（CBM）（CH组 0.34% ± 0.03%；SH组 0.77% ± 0.07%）是赤狐和沙狐肠道菌群中三大优势酶家族。在CAZy Level 2
分类水平上，
GH2（CH组 0.17% ± 0.02%；SH组 0.13% ± 0.03%）、GT2（CH组 0.24% ± 0.01%；SH组 0.24% ± 0.01%）和CBM48（CH组 0.05% ± 0.01%；SH组 0.11% ± 0.01%）是赤狐和沙狐肠道菌群中丰度最高的酶家族。在EC分类水平上，α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）是CH组（0.32% ± 0.08%）和SH组（0.28% ± 0.05%）中丰度最高的酶。研究人员根据KEGG和CAZy数据库中各分类水平的基因计算Bray-Curtis距离，然后绘制PCoA图。在每个分类水平上，PCoA图显示CH组和SH组之间肠道微生物功能组成分离。根据每个分类水平的功能丰度进行ANOSIM分析。在所有ANOSIM分析中，CH组与SH组差异均无统计学意义（p > 0.05）。因此，使用MetaStats分析和LDA来确定功能途径和酶的显著差异。LDA（LDA score>4, p < 0.05）展示了己糖胺酶通路（K12373）和淀粉结合外膜蛋白（K21572）在
CH
组中的丰度显著高于SH组。
ABC-2
型转运系统ATP结合蛋白（K01990）、
假定
ABC转运系统ATP结合蛋白（K02003）和ATP-结合盒，B亚科，细菌（K06147）在SH组中丰度显著高于CH组（图6）。研究人员通过MetaStats分析鉴定两组中差异显著的酶。
在
Level 1分类水平上，研究人员没有发现酶家族在CH组和SH组之间具有显著性差异。在Level 2分类水平上，一共有23个酶家族（GH16、GH20、GH29、GH30、GH57、GH63、GH92、GH109、GH110、GH117、GT1、GT3、GT9、GT19、GT30、GT83、GT104、PL12、PL8、PL15、CBM20、CBM35和CBM67）在CH组中显著富集（
q
< 0.05）。与赤狐相比，研究人员发现SH组中显著富集的酶为GH25、GH49、GH112、GH120、GT35、GT66、CE4和CBM48（q < 0.05）（图7）。在Level 3分类水平上，研究人员发现β-己糖胺酶
（EC
：
3.2.1.52）和透明质酸酶（EC：3.2.1.35）是K12373通路中最重要的酶，且显著富集于CH组（q < 0.05）。此外，几丁质酶（EC：3.2.1.14）、地衣酶（EC：3.2.1.73）和葡糖淀粉酶（EC：3.2.1.3）可以作用于几丁质和淀粉代谢途径，且在CH组中显著富集（
q
< 0.05）。
图7 两个物种微生物群中显著富集酶的MetaStats分析（q < 0.05）。
以呼伦贝尔草原赤狐和沙狐为研究对象，研究了赤狐和沙狐的肠道菌群及其功能。研究人员发现了赤狐和沙狐显著富集的菌群和功能代谢通路。基于KEGG数据库注释，赤狐和沙狐肠道菌群功能主要集中在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和能量代谢。在极端寒冷的环境中，赤狐和沙狐可能会采取相似的代谢模式。通过比较这两个物种的肠道菌群，我们观察到肠道微生物组和功能组成的差异，反映了宿主生态位和生境的差异。研究人员认为，这两个物种肠道菌群的差异有助于宿主适应不同的生态位和栖息地。在门分类水平上，赤狐和沙狐的优势菌群为厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、变形菌门和放线菌门。此结果与其他犬科动物的肠道菌群组成相似，例如豺、狼和狗。虽然两个物种的肠道菌群组成比例不同，但通过LEfSe分析（LDAscore>4，p < 0.05）没有发现两种狐属动物的肠道菌群组成存在显著差异。在属分类水平上，赤狐肠道菌群拥有高比例的拟杆菌属。拟杆菌属可以降解碳水化合物形成短链脂肪酸（SCFAs），包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs是哺乳动物肠道上皮细胞的主要能量来源，在维持宿主健康和代谢方面发挥重要作用。通过宏基因组注释结果发现K12373和K21572主要存在于拟杆菌属中。己糖胺酶途径可促进聚糖降解产生SCFAs，并为宿主形成各类N-聚糖。因此，它可能提高了赤狐对多糖的利用，并与赤狐肠道菌群中高比例的拟杆菌属有关。此外，β-己糖胺酶（EC：3.2.1.52）和透明质酸酶（EC：3.2.1.35）显著富集于K12373代谢通路。这增加了聚糖降解和生物合成的效率。结合淀粉的外膜蛋白位于拟杆菌属细胞膜上，可将淀粉转运到拟杆菌属细胞中进行一系列的降解代谢途径，从而为宿主提供碳和能量来源（SCFAs）。通过CAZy在二级分类水平上的分析，研究人员观察到赤狐和沙狐肠道菌群的最大差异集中于糖苷水解酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块。拟杆菌属富含糖苷水解酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块基因。植物种子是红狐和沙狐的食物组成之一。糖苷水解酶可以分解食物中的多糖；糖基转移酶可以为宿主产生糖原，碳水化合物结合模块可以促进酶与底物的结合。在Level 3分类水平上，几丁质酶（EC：3.2.1.14）、地衣酶（EC：3.2.1.73
）
和葡萄糖淀粉酶（
EC：3.2.1.3）基因在拟杆菌属中富集。在繁殖季节，赤狐和沙狐的食物组成中含有一定数量的昆虫。赤狐肠道菌群中较高丰度的几丁质酶可以提高降解昆虫外骨骼的能力，提高蛋白质的生物利用率。犬科动物会舔舐含有地衣的唾液，这会导致地衣进入消化道。地衣酶的增加可能有助于赤狐分解地衣中的淀粉，可以弥补在严冬时匮乏的食物资源。此外，赤狐的肠道菌群具有丰富的葡萄糖淀粉酶基因，该基因编码的蛋白质可以有效分解植物种子中的淀粉。这些结果表明，赤狐的肠道菌群可以通过适应消化各种食物，从而帮助它们占据更广泛的生态位，并具有更高的碳水化合物利用率。沙狐肠道菌群含有大量的Blautia和Terrisporobacter，它们能在碳水化合物代谢途径中产生多种SCFAs。一些研究表明，
Blautia
分解碳水化合物的能力弱于拟杆菌属；然而，Blautia在抗炎症中扮演了重要的作用。Terrisporobacter也与宿主的健康相关，较高的丰度有利于宿主的生存。因此，这两种菌属可能在维持宿主健康方面发挥着重要的作用。ABC-2型转运系统ATP结合蛋白（K01990）、假定ABC转运系统ATP结合蛋白（K02003）和ATP-结合盒，B亚科，细菌（K06147）在沙狐肠道菌群中显著富集。这三种酶家族具有泵的作用，可以将毒素排出细胞，并将营养物质输送到细胞中，它们可以帮助宿主在严酷的环境中生存。根据研究人员之前的野外工作发现，沙狐的栖息地是缺乏水资源的特定环境（高草坡地和沙地），显著富集的细菌和通路可能在维持宿主健康和促进其适应恶劣环境方面发挥重要作用。然而，由于沙狐不能占据广阔的生态位，它可能比赤
狐更适合于缺水的恶劣环境。综上所述，研究人员对赤狐和沙狐的肠道菌群和功能组成进行了描述，并分析了两种狐狸的肠道菌群和功能的差异。功能和酶的显著富集与两种狐狸肠道菌群中差异菌群相关。拟杆菌属是赤狐适应更广泛生态位和更复杂生境的重要因素。Blautia和Terrisporobacter富集与沙狐肠道菌群中，可以帮助宿主适应恶劣的环境。研究人员推测赤狐和沙狐的肠道菌群有助于它们适应不同的生态位和生境。该研究的结果为了解中国呼伦贝尔草原上的赤狐和沙狐生态位差异提供了独到的见解。
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