肾结石中的钙结合蛋白对结石的形成的影响？

人肾结石中钙结合蛋白的多色成像，用于阐明蛋白质对晶体生长的影响

Sci Rep. 2021; 11: 16841.Published online 2021 Aug 26. doi: 10.1038/s41598-021-95782-1

PMCID: PMC8390759 PMID: 34446727

Multicolor imaging of calcium-binding proteins in human kidney stones for elucidating the effects of proteins on crystal growth

Yutaro Tanaka,1 Mihoko Maruyama,2,3,4 Atsushi Okada,1 Yoshihiro Furukawa,5 Koichi Momma,6 Yuki Sugiura,7 Rie Tajiri,8 Koichi P. Sawada,2 Shunichi Tanaka,4 Kazufumi Takano,4 Kazumi Taguchi,1 Shuzo Hamamoto,1 Ryosuke Ando,1 Katsuo 

Abstract

   肾结石中的钙结合蛋白对结石的形成有很大影响。这些蛋白质在肾结石中的空间分布对于评估蛋白质对结石形成的体内影响至关重要，尽管这些蛋白质的实际分布仍不清楚。我们揭示了三种不同蛋白质，即骨桥蛋白 (OPN)、肾凝血酶原片段 1 (RPTF-1) 和钙颗粒蛋白 A (Cal-A) 在保留原始矿物相和质地的人肾结石中的微观分布：一水草酸钙(COM) 和二水草酸钙 (COD)。OPN 和 RPTF-1 分布在 COM 和 COD 晶体内部，而 Cal-A 分布在晶体外部。OPN 和 RPTF-1 在具有镶嵌结构的 COM 晶体中显示出均匀分布，并且在 COD 晶体中与特定晶面平行的周期性分布。这些蛋白质的独特分布使我们能够根据它们的理化性质和每种蛋白质的复杂物理环境变化来解释每种蛋白质对 CaOx 晶体生长的不同体内影响。这种方法将进一步使我们能够阐明不同蛋白质对肾结石形成的体内影响。

     肾结石疾病是一种常见疾病，一生中至少影响 1.7-14.8% 的人口。在多达 50% 的病例中，这种疾病会在第一次发作后的 5 年内复发。尽管这个健康问题很重要，但仍无法获得结石形成的预防性治疗。了解肾结石形成的发病机制对于减少肾结石疾病的发生和复发至关重要。大约 80% 的肾结石是草酸钙 (CaOx) 结石。CaOx结石由 ~ 90%的矿物相组成，即CaOx进一步分为一水草酸钙[Ca(C2O4)·H2O](COM)和二水草酸钙[Ca(C2O4)·2H2O](COD)，以及有机物的一小部分，被认为是蛋白质基质。肾结石形成的发病机制包括涉及矿物质成分和蛋白质基质之间复杂相互作用的多步骤过程。已经在肾结石中鉴定了 100 多种蛋白质。其中，已知几种蛋白质，尤其是钙结合蛋白，在 CaOx 结石形成过程中起着至关重要的作用。这些蛋白质的具体作用已在结石形成的许多步骤中得到深入研究，包括晶体成核、晶体生长、晶体聚集和晶体粘附，并进行了大量体外结晶研究。体外研究有助于评估特定蛋白质对结石形成过程中特定步骤的影响。然而，在真正的结石形成环境中，大量蛋白质同时起作用，尿液中蛋白质、钙离子和草酸盐的浓度会发生波动。这种担忧促使我们研究真正的人类肾结石，以发现蛋白质对晶体生长的真正影响。在以前的大多数研究中，肾结石中的蛋白质的鉴定是在粉碎和提取后用质谱法进行的。因此，丢失了关于结石中蛋白质空间分布的信息。在非常有限的研究中，肾结石中的蛋白质鉴定是使用肾结石切片进行的，其中 CaOx 晶体通过脱钙完全去除 。这种方法可用于发现肾结石中蛋白质的分布，这可能有助于了解特定蛋白质对结石形成的影响。然而，在这种方法中丢失了大量记录在肾结石晶体中的关于结石形成的信息。70 多年以前的研究表明，通过使用光学显微镜对肾结石切片和抛光薄片进行晶相鉴定和晶体质地分类可以获得肾结石矿物信息的重要性。  缺乏对肾结石中原始 CaOx 晶体的蛋白质分布进行评估的分析一直是理解结石形成的一个相当大的障碍。蛋白质分布和晶相/形态的协调评估可以提供有关结石形成历史的重要信息。多重免疫荧光染色 (multi-IF 染色) 已被用于显示两种或多种蛋白质在生物样品的许多类型的软组织中的分布。将该技术应用于由多孔磷酸钙晶体组成的骨组织，也为 着眼于骨矿物质稳态的动态调节。然而，这并没有用于研究由致密和坚硬晶体组成的肾结石，尽管单次免疫荧光染色已被用于显示不保留矿物质信息的脱钙肾结石中特定蛋白质的分布。

   本研究调查了能够对肾结石样本进行多 IF 染色并保留原始矿物质信息的条件。我们研究了三种不同的蛋白质，骨桥蛋白 (OPN)、肾凝血酶原片段 1 (RPTF-1) 和钙颗粒蛋白 A (Cal-A) 在 CaOx 结石的薄片中的分布。这些蛋白质在大多数 CaOx 结石中很常见，被称为钙结合蛋白，可能影响 CaOx 结石的形成。据我们所知，这是第一项在肾结石中共同观察多种基质蛋白的研究。我们根据每种蛋白质的分布、理化性质以及 CaOx 结石形成过程中每种蛋白质的复杂物理环境变化，进一步解释了每种蛋白质对 CaOx 晶体生长的不同体内影响。结果 基于显微观察结合 FT-IR 分析，肾结石样本的结构域分为三种类型，与 Schubert 和 Brien 报道的一致：由自形 COD 晶体组成的不规则纹理（类型 1，称为自形 COD COD 聚集体；图 1c)，由不规则取向的 COM 晶体（类型 2，称为镶嵌 COM；图 1f）和同心层叠的 COM 晶体（类型 3，称为同心 COM；图 1i）组成的马赛克纹理.大多数观察到的 CaOx 石材样品由这三种纹理组成（表（表 11））。

图1本研究中分析的肾结石样本。 (a) 样品 1。(b) 样品 1 薄片的偏光显微图像。(c) (b) 中白框区域的放大图像。 (d) 样品 2。(e) 样品 2 薄片的偏光显微图像。(f) (e) 中白框区域的放大图像。 (g) 样品 3。(h) 样品 3 薄片的偏光显微图像。(i) (h) 中白框区域的放大图像。表格1患者人口统计、结石的最大尺寸、矿物相的比例的总结。

CaOx草酸钙，Type1：自形COD，Type2：由不规则取向的COM组成的马赛克纹理，Type3：同心层叠的COM。将用于生物样品的多 IF 染色协议应用于通过典型地质方法制备的肾结石样品的薄片分析。对于应用，调整染色前薄片的蚀刻条件，发现只有在典型染色过程之前对抛光薄片进行轻微蚀刻（使用 pH 6.0 柠檬酸盐溶液 1 分钟）时，可视化才能成功.多 IF 染色使三种不同颜色的蛋白质（OPN：绿色、RPTF-1：蓝色和 Cal-A：红色）在三种不同的石材纹理中共同可视化。我们发现每种蛋白质根据其在 COM 和 COD 中的位置显示出特征分布模式。在 15 个样品中的 7 个样品中发现了自形 COD 聚集体（表（表 1）1）。自形COD聚集体主要存在于CaOx肾结石的外围（图（图1a-c）1a-c）。已知这些 COD 晶体具有由 {101} 面组成的四方双锥体形状。许多 COD 双锥体在两个锥体的尖端也具有 {110} 面（图 2b 和补充图 S1）。COD晶体的多IF染色图像如图2a所示，OPN周期性地出现在COD的{110}面上，如图2c中的白色箭头所示。该面与典型的 COD 体外晶体生长中没有出现的双锥体尖端的面相同。RPTF-1 沿{101} 面呈平行层，具有微米级间隔，如图 2d 中的黄色箭头所示。该晶面是典型 COD 生长的特征。Cal-A 存在于 COD 晶体之外，在特定表面上没有优先吸附（图 2e）。在其他石头样品中也看到了相同的分布模式（补充图 S2）。

图2 自形 COD 聚集体中的蛋白质分布。(a) 多中频图像。白框区域的放大图像显示在（b）-（e）中。(b) 光学图像。水晶面用黄色虚线和那些索引显示。(c) OPN 的 IF 图像。晶面和层状层分别用黄色虚线和白色箭头表示。(d) RPTF-1 的 IF 图像。晶面和层状层分别用黄色虚线和黄色箭头表示。(e) Cal-A 的 IF 图像。晶面和层状层用黄色虚线表示。马赛克 COM 纹理是 CaOx 结石中最普遍的纹理（图（图 1d-f）1d-f）。在 15 个样本中的 12 个样本中观察到了这种质地（表（表 1）1）。马赛克 COM 的多 IF 染色如图 3a、b.3a、b 所示。OPN 和 RPTF-1 存在于整个 COM 晶体中（图（图 3c，d）。3c，d）。相反，Cal-A 仅存在于晶界（即 COM 晶粒的表面）（图 3e）。我们进一步分析了蛋白质的线强度分布，如图 3a 所示，以详细评估每种蛋白质分布模式（图 4a 上的黄线）。OPN 和 RPTF-1 在晶体区显示出较高的强度，而 Cal-A 在晶体区显示出较低的强度（图 4b）。Cal-A 的高强度仅沿晶界观察到。尽管 COM 颗粒的大小和形状不同（补充图 S3），但在许多样品中都可以看到这些蛋白质分布。

在单独的窗口中打开图 3镶嵌 COM 中的蛋白质分布。(a) 多中频图像。白框区域的放大图像显示在（b）-（e）中。(b) 光学图像。晶界用黄色虚线表示。(c) OPN 的 IF 图像。晶界用黄色虚线表示。(d) RPTF-1 的 IF 图像。晶界用黄色虚线表示。(e) IF 图像。晶界用黄色虚线表示。

图 4 COM 样品中蛋白质 IF 染色的线强度分布。(a) 马赛克 COM 纹理，带有黄色箭头显示的线轮廓轨迹。(b) (a) 中马赛克 COM 颗粒上的线强度分布。(c) 锥形层压 COM 纹理，带有黄色箭头显示的线轮廓轨迹。(d) (c) 中锥形层压 COM 颗粒上的线强度分布。同心 COM 也是 CaOx 结石的典型纹理（图（图 1g-i）。1g-i）。

     我们在 15 个样本中的 10 个样本中发现了这种纹理（表（表 1）。1）。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 分布在同心层中（图 5a）。OPN 和 RPTF-1 作为恒定和规则层存在于整个 COM 晶体中，形成微米级间隔（图（图 5b，c）。5b，c）。相比之下，Cal-A 分布由位于石头外表面的不规则和相对较宽的层组成（图 5d）。SEM观察显示靠近每个Cal-A层的间隙层（图（图6a，b）6a，b）。形成间隙空间的两个表面都被微小的沉积物占据，这些沉积物与构成同心 COM 的主要 COM 晶体明显不同（图（图 6c，d）。6c，d）。同心 COM 中这些蛋白质的线强度分布在每个蛋白质分布中显示出尖峰（图（图 4c，d）。4c，d）。OPN 和 RPTF-1 的分布相似（即 5.58 ± 2.70 µm/层 OPN 和 5.99 ± 2.56 µm/层 RPTF-1）（补充表 S1）。然而，与 OPN 和 RPTF-1 相比，Cal-A 层具有明显大的间隔（即，23.17 ± 18.57 µm/层）。在其他 9 个样品中的大多数中都看到了类似的分布模式和间隔，尽管在少数样品中没有看到 Cal-A 层（补充图 S4 和表 S1）。

图 5锥形层压 COM 中的蛋白质分布。(a) 多中频图像。(b) OPN 的 IF 图像。(c) RPTF-1 的 IF 图像。(d) Cal-A 的 IF 图像。

图 6 同心 COM 中的钙粒蛋白 A (Cal-A) 分布。(a) 薄片的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。(b) 多 IF 染色和薄片 SEM 的合并图像。SEM 图像中显示的同心对齐间隙空间的位置与 Cal-A 层压的位置重叠。(c) 坠毁的同心 COM 的 SEM 图像。(d) (c) 中白框区域的放大图像。从中心到外部的同心 COM 宝石的方向用白色虚线箭头表示。COM 晶体之间的间隙空间用白色实线箭头表示。

       在本研究中，CaOx结石中三种质地的比例以及三种质地中三种蛋白质的分布与结石形成者的年龄和性别没有明确的关系，尽管所调查的结石数量不足以进行相关性分析. OPN、RPTF-1 和 Cal-A 已知存在于 CaOx 结石中，这是基于通过电解从石粉提取物中检测出来的 9-11。OPN 在使用免疫细胞化学技术脱钙 CaOx 结石中的微观分布显示 OPN 分布在 CaOx 结石的同心薄片中 21, 30。本方法生动地可视化了先前认为的“有机层”中三种不同蛋白质的位置（图 7a，b）。我们在本研究中显示的同心 COM 中 OPN 的分布模式与之前的观察结果一致。我们进一步发现RPTF-1在同心COM中的分布模式与OPN几乎相同，而RPTF-1在COD晶体中的分布与OPN不同。相反，Cal-A 的分布模式与其他两种蛋白质完全不同。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的这些不同微尺度分布记录了 CaOx 结石形成的历史。

图 7 CaOx 中三种主要质地的蛋白质分布示意图。（ a ）先前研究中考虑的蛋白质基质分布（白色：矿物相黑色：有机物）。(b) 本研究中发现的特定蛋白质分布（绿色：骨桥蛋白（OPN），蓝色：肾凝血酶原片段 1（RPTF-1），红色：钙颗粒蛋白 A（Cal-A）。1 型自体 COD，2 型镶嵌 COM，和 Type3 同心叠层 COM。去：讨论蛋白质掺入晶体的主要控制因素OPN 和 RPTF-1 均存在于自形 COD 晶体、镶嵌 COM 颗粒和同心 COM 中（图（图 2a、2a、a、3a3a 和 5a）5a）。这一发现证实了这些蛋白质同时包含在 COD 和 COM 晶体中。Cal-A 存在于自形 COD 晶体的外部和镶嵌 COM 颗粒周围（图（图 2e2e 和 3e）。3e）。在同心 COM 情况下，通常在 Cal-A 层周围发现的间隙空间表明 Cal-A 层不包含在晶体中，而是分布在晶体表面上（图 5d5d 和 6a-d）)。这些分布表明 OPN 和 RPTF-1 倾向于结合到 CaOx 晶体中，而 Cal-A 几乎没有结合。

理论上，蛋白质吸附和掺入 CaOx 晶体受其氨基酸侧链的结合力和相应蛋白质的其他特定性质（如静电负电荷）的影响 。净电荷表明 OPN 和 RPTF-1 比 Cal-A 带更多的负电荷，OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的等电点分别为 3.5、2.5-3.0 和 6.5-7.0。已知 OPN、RPTF-1 和 Cal-A 具有钙结合域 。这些结构域还可以作为生长晶体表面的局部结合位点。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的钙结合域可以分别结合 10、7 和 2 个钙离子。因此，这些蛋白质对 CaOx 表面带正电荷的 Ca 的整体和局部亲和力将导致这些蛋白质进入 CaOx 的不同掺入效率。晶体生长通过将生长单元合并到出现在晶体表面上的台阶和扭结点来进行。蛋白质和生长晶体表面之间的三维兼容性将决定蛋白质掺入晶体表面的程度。对生长的扭结位点和步骤具有很强结合能力的蛋白质往往更有效地结合到生长的晶体中 。目前报道的三种蛋白质的分布和钙亲和力表明 OPN 和 RPTF-1 的强亲和力促进了 COD 和 COM 晶体的结合和掺入。相反，亲和力较低的 Cal-A 仅粘附在晶体表面，而不会结合到晶体中。先前的一项研究表明，更多磷酸化的肽将更高的肽掺入 COM 的比率支持这一解释。这些讨论将使我们能够根据钙结合特性预测许多其他蛋白质的分布。OPN和RPTF-1对CaOx晶体生长的体内选择性吸收和抑制作用    主要存在于 CaOx结石外围的自形 COD 晶体被认为具有特征层状结构，其中所谓的“有机物层”和“矿物质层”在晶体生长过程中相互交替 。虽然层移的确切原因尚不清楚，但可能的解释包括人类宿主的环境变化、肾脏生理和尿液生化变化，以及形成矿物中发现的振荡分区结构的动力学反馈机制。目前的结果表明，OPN 和 RPTF-1 分别构建了对应于 COD 面的层状结构作为晶内蛋白质，而 Cal-A 不包含在层状结构中（图 2c） -e).2c-e)。蛋白质在肾结石晶体上/内的表面选择性吸附/掺入的体内证据表明，蛋白质的分布与光学显微镜观察到的传统“有机物质层”不同（图 7a）。Chien 等人报道了 OPN 在 COD 晶体上选择性吸附的体外证据。根据这些报告，OPN 与 COD 的典型晶体X面结合并结合到矿物相中，与我们的结果一致（图 7b）。表面选择性吸附/掺入可能是由于每种蛋白质的钙结合能力和/或蛋白质分子上的官能团之间的不同分子相容性以及每个晶体表面上晶格离子的排列造成的。据报道，大多数蛋白质在结石形成过程中抑制 CaOx 晶体生长 。

抑制晶体生长肽被认为是通过阶梯固定和/或扭结阻断。在之前的体外研究中，已知 OPN 和 RPTF-1 是 CaOx 晶体生长的抑制剂 。然而，肾结石形成的抑制程度仍不清楚。目前的观察表明，大多数肾结石 COD 晶体具有典型的X  面晶体习性（图 2b）。生长速度相对较慢的晶体表面通常发育良好 。这一发现表明，与其他表面相比，COD 的面的增长速度较慢。RPTF-1 的优先吸附可能通过加入 COD 来减缓晶体生长，被发现为与X 面一起的层状结构（图 2d）。另一方面，我们发现X面是 COD 晶体内部的 OPN 层状结构（图 2c）。X 面出现时 OPN 层状结构比体外研究中获得的无 OPN 的 COD 晶体的X面更发达。优先吸附 OPN 的 COD 的 {110} 面不是出现在典型晶体习性的 COD 上的晶面。因此，X上的 OPN 吸收会极大地降低相对表面的生长速度，并且减速慢到足以出现 X 面。换句话说X面的出现改变了许多肾结石样本中的一般晶体习性。COM 晶体显示为马赛克纹理或同心纹理（图（图 3a3a 和 5a）。5a）。OPN 和 RPTF-1 均均匀地存在于镶嵌结构中的 COM 颗粒中（图（图 3c，d）。3c，d）。因此，这些蛋白质对此类 COM 生长速率的影响尚不清楚。在同心 COM 中，板条状晶体从中心向外呈放射状排列。板条状晶体的晶面不清晰，但暴露于尿液的球形 COM 的外表面应具有相同的晶面。目前的结果清楚地表明，OPN 和 RPTF-1 具有相似的分布线剖面，其中它们在同心 COM 中周期性分布为大约 4 到 6 µm 尺度的间隔层（图 4c、d、4c、d、c ,d,5b,c5b,c 和补充表 S1。这表明 OPN 和 RPTF-1 在暴露于尿液的 COM 的特定晶面上的吸附和掺入的差异可以忽略不计。先前的体外研究表明 OPN 具有对X、Y 和 Z 面 的 COM 生长的抑制作用。当考虑到这种抑制作用时，目前的结果表明同心 COM 生长被 OPN 抑制，也可能被作为 RPTF 的 RPTF-1 抑制-1 具有相似的钙结合能力，因此具有与 COM 相似的掺入效率。Cal-A对CaOx晶体生长的体内抑制作用        在本结果中未看到在 COM 和 COD 晶体的特定晶面上的 Cal-A 吸附（图（图 2a2a 和 3a）。3a）。Cal-A 的钙结合能力低于 OPN 和 RPTF-1，并且存在于自形 COD 晶体的外部和没有层状结构的镶嵌 COM 颗粒周围（图 2a、e2a、e 和 3a、e） .3a、e)。然而，在体外研究中，已知 Cal-A 也能抑制 CaOx 晶体的生长。因此，Cal-A 可能作为表面活性剂分子发挥作用，在不掺入晶体的情况下影响形态和晶体生长速率 。在规律的尿液条件下（即没有不规则的高Cal-A浓度），由于OPN和RPTF-1抑制步的发展，Cal-A对COM和COD晶体生长的抑制作用可能低于OPN和RPTF-1通过结合到晶体中，通过钉扎和/或阻塞在晶面上。因此，肾结石中蛋白质的钙结合能力将有助于评估它们对 CaOx 生长的抑制作用的程度。在同心 COM 中，Cal-A 显示了距离为 20 到 50 µm 的非周期性层（图 4c、d、c、d、5d5d 和补充表 S1）。Cal-A 已在结石形成者的尿液中被发现28。因此，其在尿液中的浓度会自然发生波动。然而，由于其对钙离子的亲和力较低，Cal-A 浓度的小波动可能不会记录在 COM 纹理中。Cal-A 作为炎症反应的抗炎蛋白非周期性地从尿液中排出 。因此，由于不规则的环境变化，例如感染、损伤和出血，Cal-A 的非周期性层可能会偶尔记录尿液中的高浓度 Cal-A。它对 COM 生长的抑制作用很大程度上取决于它在生长晶体周围的浓度，因为几种肽对方解石晶体生长具有这种依赖性。当晶体周围的浓度较低时，Cal-A 可能会通过部分占据生长表面来微弱地减慢 COM 的生长，因为蛋白质不容易掺入 CaOx 中。在同心 COM 中，被包围的间隙层

   SEM 观察发现的 ny 沉积物与多 IF 成像发现的 Cal-A 层几乎相同（图（图 6a-d）6a-d）。因此，当 Cal-A 层由于某些生物变化而由于其不规则的高浓度而变厚时，Cal-A 可能通过广泛占据生长表面而作为 CaOx 生长的有效抑制剂。炎症是 Cal-A 分泌的触发因素，它也可能影响结石形成的不同步骤，因为在实验中发现了一种对肾结石形成具有促进和抑制作用的白细胞（即巨噬细胞）。肾结石模型小鼠 16. 多中频成像在整体肾结石形成中的可能应用 目前的工作将蛋白质多 IF 成像的应用扩展到更硬的生物矿物样品，即肾结石。晶体成核、晶体生长、晶体聚集和晶体粘附被认为是肾结石形成的重要步骤。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 被体外研究报告为 CaOx 成核、生长和聚集的抑制剂 48,49。目前多 IF 成像的扩展应用提供了先前体外研究暗示的蛋白质对 CaOx 生长抑制作用的体内证据。已经通过小鼠体内研究以及大量体外研究对每个步骤中蛋白质的影响进行了研究14、15、26。例如，基于小鼠体内实验报道了 OPN 作为晶体形成抑制剂和晶体粘附抑制剂的关键肾脏保护作用，而 OPN 促进晶体与肾小管上皮细胞的粘附和 CaOx 结石的增强根据最近使用 OPN 基因敲除小鼠 的体内实验报道了。在 OPN 基因敲除小鼠肾结石中发现的完全不同的晶体形态也支持 OPN 在肾结石形成的多个步骤中的作用。本可视化方法可用于评估小鼠体外研究中的蛋白质效应，甚至可用于评估人类肾结石形成的不同步骤。这种新颖的分析将使我们能够解释不同蛋白质对 CaOx 结石形成的体内影响，这可以为病理检查和个性化医疗以管理人类肾结石疾病开辟一条途径。去：方法 道德声明 本文提出的研究项目已获得名古屋市立大学医学研究生院机构审查委员会的批准。所有方法均按照相关指南和规定进行。根据伦理委员会批准的程序获得所有受试者的书面知情同意书。结石采集和结石切片的制备 从患者身上收集肾结石，并在日本名古屋市立大学进行分析。根据体红外光谱 (IR) 的信息，从我们数千个人类肾结石集合中选择了 15 个 CaOx 肾结石样本，并制备了薄片。石头的整体矿物成分是通过红外分析估计的。最初为地质调查而设计的岩石薄切片方法被应用于这项肾结石调查 55。肾结石样品完全嵌入环氧树脂中并切割。横截面用磨料（SiC 和 Al2O3）研磨，然后使用环氧树脂将抛光面粘附到载玻片上。进行第二次切割以使 1 毫米厚的样品平行于载玻片。然后将样品抛光至 20-30 µm 的厚度，并用金刚石浆料抛光。偏光显微镜和傅里叶变换红外分光光度法 通过偏光显微镜用 20-30 µm 厚的结石碎片切片观察构成肾结石的每个晶体的光学特征。通过将观察结果与 VESTA56 计算的典型 COD 晶体形状进行比较，确定每个 COD 平面的表面指数。根据光学特征，对晶体进行分类，然后用傅里叶变换红外分光光度计（FT/IR6100，JASCO）进行分析。测量波数范围为 7800-350 cm-1。所有测量均在环境温度下进行。测量光斑尺寸设置为 20 × 20 µm2。基于使用 RRUFF 数据库获得的 IR 光谱识别晶相。蛋白质基质的多色免疫荧光染色 用于矿物相分析的石头切片也用于通过 Multi-IF 染色分析蛋白质分布。将薄片用柠檬酸盐溶液 (pH 6.0) 处理 1 分钟以进行最小蚀刻。切片用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤，然后在磷酸盐缓冲液中的 1% 牛血清白蛋白中封闭 60 分钟下孵育过夜。使用的一抗是小鼠单克隆抗钙颗粒蛋白 A（1:100 稀释，Santa Cruz Biotechnology，sc-48352）、兔多克隆抗骨桥蛋白（1:100 稀释，Santa Cruz Biotechnology，sc-20631）和绵羊单克隆抗-人凝血酶原片段 1（1:500 稀释，Cedarlane Ontario，加拿大，CL20111AP）。然后将切片用 PBS 洗涤 3 次 10 分钟，然后与荧光偶联的二抗孵育 1 小时，避光。使用的荧光偶联二抗是与 Alexa Fluor 488 偶联的抗兔 IgG (H + L) 交叉吸附、与 Alexa Fluor 546 偶联的抗小鼠 IgG (H + L) 和抗羊 IgG (H + L) 与 Alexa Fluor 647 结合的交叉吸附。用 PBS 广泛洗涤 3 次 10 分钟后，使用共聚焦自动荧光显微镜 (Nikon A1R) 检测荧光。收集的激发和发射波长包括 OPN、RPTF-1 的 487 nm 激发（在 500 和 550 nm 之间收集的发射）、561 nm 激发（在 570 和 620 nm 之间收集的发射）和 639 nm（在 663 和 738 nm 之间收集的发射） , 和 Cal-A, 分别。从部分样品中观察到自发荧光 (AF)，但信号强度远低于本研究中讨论的蛋白质信号。还评估了对靶蛋白不具有特异性的抗体的结合。确认不存在来自非特异性抗体的 IF 信号。进行阴性对照测试以评估假阳性信号的缺失（补充图 S5）。对于抗体染色，使用同种型对照来检测任何非特异性结合。具体而言，用于对照的一抗是兔 (DA1E) mAb IgG XP 同种型对照（1:100 稀释 Cell Signaling）、小鼠 (G3A1) mAb IgG1 同种型对照（1:100 稀释 Cell Signaling）和绵羊 mAb IgG 同种型（1 :100 稀释 Novus) 使用与上述相同的荧光标记二抗。线条轮廓是用 ImageJ 构建的，每个蛋白质的最高和最低对比度点分别为 100% 和 0%。