国人作品 | SBB：生态网络和宏基因组分析揭示长期过量氮肥增加土壤微生物群落对季节变化的敏感性

编译：微科盟莫扎她，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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1 土壤理化性质 

如表S1所示，在施用氮肥（56N）后，铵态氮和硝态氮被迅速同化，在2周左右降至缺肥率（0N）。除过量施肥（196N）后铵态氮和硝态氮浓度均增加外，其余生长季铵态氮和硝态氮浓度均与0N样品相同。施用196N处理的土壤pH值（4.93）显著低于0N处理（6.35），且降低后的土壤pH值在生长季保持稳定。施肥56N和196N对土壤铵态氮和硝态氮浓度影响并不持久。

施用196N后，土壤细菌丰度显著下降，在生长高峰期，0N和196N细菌丰度差异较大[（8.25±5.48）×10⁷ vs（3.01±1.68）×10⁶ copies/g土壤]（图S1）。3个施氮量真菌丰度比较接近，且在整个生长季中都非常稳定。

值得注意的是，施用196N后，细菌群落的3个α多样性指数（Pielou均匀度、Shannon多样性、物种丰富度）均显著降低（图S2A，暗红色柱状图）。3个多样性指数之间存在较强的正相关关系，pH值与所有多样性指标均显著相关（表S2）。但各施肥量下，3个多样性指数在整个生长季中基本稳定，但有较小的显著波动，尤其是196N处理在衰老期变化增加（图S2A，暗红色条）。

施氮对细菌β多样性的影响与α多样性相似（图1A，图S3A，图S4A），其中各生育阶段施氮196N显著影响了细菌群落结构（P = 0.003，P < 0.001，P = 0.01，P = 0.007，分别是施肥前、施肥后、生长高峰期和衰老期）（图S3A，粉色指标，表S3）。各施肥处理的细菌群落结构在整个生长季都比较稳定（图1A和S3C，表S3）。我们还发现，196N处理的细菌群落生长阶段间的Unifrac距离显著大于0N和56N处理（图2B，***P < 0.001）。在门水平上，两个优势菌门变形菌门和酸杆菌门不受施肥的影响（图S4A）。在较高的分类水平上没有变化，可能掩盖了较低分类水平上的变化，如过量氮肥显著影响了酸杆菌门（Acidobacteria）的一些亚群（Gp1、3、4、6、16）和变形菌门（Proteobacteria）的一些亚群（图S4B、图S5A）。但受生长期影响较大的属很少发现。

我们整合各施氮量下不同生长阶段的样本，构建了3个网络。如表1所示，高R²（R² > 0.838）表明三个网络具有无标度性。avgCC、HD和模块性（M > 0.4）在经验网络中显著高于随机网络，表明小世界和模块化特性。因此，与以往文献类似，本研究构建的网络可以用于揭示微生物共生对氮肥的响应。196N网络的平均连通性、平均聚类系数和密度最高，HD最低（图3A，表1）。56N网络的平均连通性和平均聚类系数较低，HD最高（表1）。在长期施肥的影响下，196N施肥量降低了细菌与真菌间的交互作用，但显著提高了微生物间的正相关百分率，达到87.9%（图3，表1）。此外，196N样品中真菌节点的相对数量也有所减少（图3，表1）。在3个网络中检测到36个连接器和25个模块中心。仅检测到一个网络中心（图S7），属于Azoarcus属。除3个节点的相对丰度大于0.5%外，大多数节点的相对丰度都很低（表S5和表S6）。这3个节点存在于196N处理中，系统发育接近黄杆菌属、Gp1属和芽孢杆菌属。

为了更充分地解析196N施肥对微生物功能的影响，选取植物生长高峰期0N和196N样品进行宏基因组分析。MG-RAST标注结果如图4A所示。施用196N均提高了碳水化合物、辅酶、维生素、DNA、噬菌体和呼吸代谢基因的相对丰度。但施用196N后，蛋白质、细胞壁、核苷酸和磷代谢基因的相对丰度降低。Pfam和COG注释结果显示，0N与196N之间存在显著差异，过量施肥添加普遍增加了氨基酸和碳水化合物代谢相关基因的相对丰度（图S8）。KEGG注释结果显示，尽管196N增加了优势碳水化合物代谢和氨基酸代谢基因的相对丰度，但两个处理之间差异不大（图4B）。3种注释结果均表明，施用196N显著降低了信号转导机制基因的相对丰度。

利用Xander软件对N循环相关基因进行长reads组装和注释（图5A）。rplB基因的PCA结果显示，过量氮肥确实对细菌群落结构有显著影响，这与16S rRNA基因分析结果一致（图S9和图S3A）。在0N和196N处理中均检测到古菌而非细菌的amoA基因，且在过量施肥处理中，amoA基因的相对丰度显著增加，尤其是与Crenarchaeota门相关的序列（图5A），nifH基因在一些重复中偶见，在196N的影响下，相对丰度降低，对应于较低的N₂固定率（表2）。nirK、nirS、norB和nosZ基因参与了反硝化作用。nirK基因相对丰度从657±36显著增加到888±270，nirS基因相对丰度从64±59显著减少到36±18，且nirK基因丰度与田间反硝化速率一致（表2）。在0N和196N样品中，norB_qNor基因的相对丰度均高于norB_cNor基因。196N对所有norB都无显著影响。nosZ（分支I）和nosZ_a2基因的检出率也无显著差异。总体而言，施用196N对反硝化基因丰度没有明显影响。

为进一步证实过量施氮对N循环基因的影响，从SEED子系统注释中提取了N循环基因信息。如图5B所示，添加196N显著降低了某些氮循环过程的相对丰度，增加了其他氮循环过程的相对丰度。氨同化、尿囊素利用、N₂固定和氰酸盐水解均降低，而一氧化氮合酶、酰胺酶和尿素/腈水合酶基因的相对丰度增加。过量施氮对氨化和反硝化相关基因的影响并不显著，这与Xander结果一致，但与过程速率不一致（表2）。

富营养型假说认为，由于较高的有效氮能使富营养型类群使用更多的不稳定碳，所以贫营养型细菌会被富营养型类群所取代。我们发现氮肥增加了富营养类群（拟杆菌门和厚壁菌门）的相对丰度，减少了寡营养类群（疣微菌门）（图S4A）。在亚门水平，变形菌门是典型的富营养类群，Alpha-和Gamma变形菌门在高施肥水平显著增加，而Beta变形菌门没有增加（图S4B），这可能是由于酸性导致。酸性细菌Gp1的相对丰度在过量氮施肥的土壤中大大增加（图S4B），这与它对低pH土壤的偏好和它最近被归类为富营养型类群一致。总体上，只受高氮肥（196N）的影响，而低氮肥（56N）的影响不大）。许多研究表明，细菌群落受到低pH值的显著影响。

不论pH值是否发生显著变化，低施肥量和高施肥量下真菌组成在门、纲和属水平均发生变化（图S4）。因此，真菌群落对pH的响应要小于氮肥。然而，之前对土壤真菌的全球调查发现，有几组真菌受到全球范围pH值的显著影响。最近的一项研究表明，土壤pH值是决定中国东北三个地点真菌群落总量的最具影响力的因素。因此，pH值和施肥对真菌群落的影响可能存在交互作用，特别是196N处理。

许多调查表明，生长季节对土壤细菌和真菌群落有显著影响，通常伴随着土壤理化性质、根系分泌物和/或气候的显著变化。然而，我们没有发现细菌和真菌群落结构的明显季节性变化，特别是在0N。这可能是因为0N和56N样地的大部分土壤化学物质在生长季基本稳定，以及随着柳枝稷生长而增加的碳输入可能造成的冗余，这与其他研究相似。与根际土壤化学物质不同，根际土壤化学物质可受不同生长阶段根系分泌物和残留物的影响，本研究排除根系的块状土壤受生长阶段的影响较小。此外，柳枝稷田间稳定的土壤化学物质可能归因于单一栽培和年收获生物量，这阻止了进一步的养分输入。

长期施肥后，不同生育期间196N样品的微生物群落差异大于0N和56N样品（图2B和D）。196N网络的avgK值越高，HD值越低，说明196N样品中微生物成员之间的相互作用越强烈。Unifrac距离和网络分析都间接表明，196N样品更容易受到外界干扰，如植物生长和气候（表S1）。Meta网络分析结果显示，对氮肥敏感的物种聚在一起，表明外源干扰可能通过针对敏感物种对微生物群落产生更大的影响。相比之下，56N样品不同生长期的微生物群落差异最小（图2B和D）。与196N网络相比，56N网络的avgK和avgCC值更低，HD值和模块化值更高，说明56N网络中微生物间的相互作用稀疏，且56N处理的微生物种群对环境变化具有更强的抗性。因此，施肥是影响生态网络关系的重要因素。

我们假设长期过量施氮也降低了交互关系的多样性，这是由于真菌和细菌节点之间的联系减少（表1）。此外，在196N网络中，正相关的百分比增加，表明长期过量的氮添加可能会丰富一些互惠共生的微生物（表1）。之前的研究表明，负相关可以促进网络稳定性，因为竞争可以稳定微生物群落的共振荡。此前的研究发现，添加秸秆可以减少负相关性，在营养物质通常丰富的根际细菌中，协同变异主要是正相关的。在氮含量为196N的样地中，营养物质可能缓解了竞争并有利于许多营养水平。

高丰度并不意味着是一个关键的网络角色。例如，大多数关键节点的相对丰度很低，低于0.5%，这与之前的发现一致。随着施氮量的增加，网络中关键类群数量增加，谱系发生变化。关键分类群的消失可能导致模块和网络的分离，表明关键分类群可能在维持网络稳定性中发挥重要作用。关键微生物类群可以随着土地利用而变化，其中关键节点随着马铃薯生长时间沿边缘成为外围，不同的关键属出现在同一地点不同土地利用的地区。同样，不同施氮水平下，本研究的关键类群也存在差异。众所周知，关键分类群越多，网络的稳定性越高。由表S5和S6可知，随着施氮量的增加，关键节点数明显增加，表明196N网络的稳定性增加，与负相关连接减少相反。单一参数不足以预测网络的稳定性，需要进行一系列长期的实验来验证。我们应该谨慎扩展基于交互作用的生态理论来解释网络的变异性和稳定性。

基于COG、Pfam、KEGG和子系统数据库的宏基因组数据注释均显示，长期过量氮肥促进了许多代谢过程，尤其是碳水化合物代谢，这与之前土壤pH从6.9降至5.0的研究相似。该研究的测序深度为75 000reads/sample，远低于我们的4-5×10⁷reads/sample。因此，在之前的数据集中，许多可能的基因或基因类别都不够丰富，无法准确地确定N₂固定、木质素降解、氨氧化等相关基因的变化。由于测序深度的提高，我们的研究不仅恢复了更多的基因，而且允许了大多数N循环基因的组装。过量施氮也降低了许多功能基因，尤其是与信号转导相关的基因。之前的研究发现，在富营养化物种中，与信号转导相关的基因通常是高表达的。高氮施肥理论上促进了信号转导基因的表达，但却抑制了信号转导基因的表达，这可能是由于低pH和细菌丰度的影响。信号转导相关基因的相对丰度下降可能与细菌和真菌在196N网络中的联系减弱有关。

许多研究表明，氨氧化古菌（AOA）倾向于酸性环境，而氨氧化细菌（AOB）主要分布在中性、碱性和富氮土壤中。在我们的研究中，过量的氮肥使土壤酸化，从而创造了有利于AOA生长的环境。N₂固定基因的相对丰度（nifH）非常低，只在一些样品中检测到，与施肥处理中测定的较低的N₂固定率相一致（表2）。固氮需要较高的能量，随着土壤氮素的丰富，固氮速率通常会降低（。相比之下，Xander和SEED子系统注释均表明，除nirK基因外，长期过量施氮对水稻反硝化潜力没有显著影响。然而，196N处理的反硝化速率增加（表2）。相似的是，一些研究发现，尿素的添加增加了nirK和nirS基因的丰度或N₂O的产生速率。然而，其他研究表明，添加高浓度氮肥降低了nirK和nirS或nosZ基因的丰度。一般来说，反硝化过程受到多种因素的影响，如有效硝态氮、pH值、有机碳、氧有效性、水分、土壤质地、温度和植物种类。在最高产量时，高硝态氮含量土壤的反硝化速率随着有效硝态氮含量的增加而增加。硝酸盐是一种常见的近端控制反硝化速率的方法。但196N土壤的低pH值可能通过影响反硝化种群和土壤有机碳来影响反硝化基因丰度。因此，在我们的研究中，可能在许多情况下，通过基因数量测量的反硝化酶的能力超过了实际，因此不期望有直接的基因活性关系。就像这里看到的，反硝化过程比其他氮循环过程更有可能发生这种情况，因为其他过程受环境条件的动态控制较少。