科研 | Gut：一株新分离的人类共生菌可预防小鼠食源性肥胖和代谢紊乱

我们最近从人类粪便中分离出一个属于瘤胃球菌科的新物种，我们将其命名为D. welbionis，D. welbionis是从这个新属中分离出来的第一个种。除了描述这个全新的属和种之外，我们发现D. welbionis与低体重相关的菌类密切相关。事实上，D. welbionis有92%的16S rRNA基因序列与未培养的O. guillermondii相似，在基于粪便微生物群测序的人群研究中，O. guillermondii被认为与瘦有关。此外，同样属于瘤胃球菌科的Anaerotruncus属也与猪和人的体重呈负相关。考虑到D. welbionis与这些类群在分类上的相似性，我们试图解读肠道微生物菌群中Dysosmobacter丰度与宿主健康之间的关联。

我们首先调查了O. guillermondii是否存在于一般人群中，并参考了3个独立队列：HMP，AGP和FGFP。基于16S rRNA基因序列，D. welbionis J115^T这个序列变异在HMP队列(n=161)的流行率为62.7%，相对丰度范围为0%-3.9%。对于AGP队列(n=9511)，流行率为69.8%，相对丰度范围为0%-9.2%。在横断面FGFP(n=2259)个体中，65.9%的个体检测到该序列变异，相对丰度在0%-0.9%之间。

我们通过之前招募的53个非糖尿病、胰岛素抵抗、超重或肥胖个体的队列(Microbes4U队列)进一步探索了这种细菌是否与肥胖受试者的BMI或任何特定的代谢标志物相关。利用Dyssosmobacter属特异性引物，我们在Microbes4U队列的粪便DNA中定量。Dysosmobacter spp在所有个人粪便总微生物群的范围为0.00035%至2.7%之间，平均为0.75%,对应于每克粪便的菌量为1.7×10⁵ - 2.0×10⁹，平均为5.9×10⁸(图1)。

有趣的是，在Microbes4U人群中，Dysosmobacter spp的相对丰度和绝对丰度与BMI呈负相关，而Dysosmobacter spp的绝对丰度与空腹血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)呈负相关(图1A,D-G,表S1)。这表明Dysosmobacter属可能与抵抗肥胖和肥胖相关的糖代谢改变有关。

研究对HFD诱导的体重增加的保护是由于D. welbionis J115^T的直接作用还是来自于肠道菌群生态系统的重构。采用16S rRNA基因扩增子序列分析小鼠盲肠微生物群组成。基于广义UniFrac不相似矩阵的主坐标分析表明，HFD对生态系统的整体组成有深刻影响。HFD小鼠与灌胃活D. welbionis J115^T的HFD小鼠的微生物群非常相似(图2G)。三组间的α多样性指数丰富度、Simpson和Shannon相似(图S3)。我们发现，31 OTUs的相对丰度在两个或多个小鼠组之间具有显著差异(图2H,I)。

与对照组相比，HFD增加了Bacteroidaceae科以及Alistipes、Ruminoclostridium、Tyzerella和未鉴定的Lachnospiraceae属，减少了Erysipelotricaceae以及Rikenellaceae RC9肠道组和Muribaculum(图2I)。有2种OTUs的相对丰度通过HFD提高，而D. welbionis J115^T处理使其恢复到正常饮食喂养水平：即OTUs 11和OTUs 16分别属于Ruminoclostridium和Alistipes。拟杆菌属(Bacteroides)和Ruminoclostridium属的OTUs 54和71在D. welbionis J115^T处理下分别升高和降低，且不受饲料影响。qPCR显示，未经处理的小鼠中不存在D. welbionis，而在强喂食活D. welbionis J115^T的小鼠中，每克盲肠中细菌数量达到2.3×10⁸(相当于0.76%的微生物群)(图2J)。D. welbionis J115^T不能持久地在小鼠肠道内定居，因为在3天的洗脱期后，在任何小鼠的粪便中都没有检测到(图S3)。

由于Dysosmobacterspp在无特定病原体的小鼠肠道菌群中未检测到，我们试图确认该活菌D. welbionis J115^T灌胃后小鼠耐受性良好。经活D. welbionis J115^T处理的小鼠空肠组织上未观察到炎症迹象(图3A)。这得到了对肠道不同部位促炎标志物的相对表达的测量(图S3)以及对肠道屏障标志物(如抗菌肽、粘液生成和紧密连接蛋白)未产生有害影响(图3B)的支持。接种活D. welbionis J115^T的小鼠空肠绒毛高度略有下降(542.7vs 482.3 μm, q=0.024)，但隐窝深度没有受到影响(图3C)。绒毛高度的降低可能会导致吸收表面的减少并影响能量吸收，同时也会加速通过时间。然而，通过测量和计算通过时间和从食物中吸收热量的百分比显示，这些参数没有受到活D. welbionis J115^T给药的影响(图3D-E)。结果表明，活D. welbionis J115^T灌胃的小鼠具有良好的耐受性，且没有改变肠道生理。

在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)中，D. welbionis J115^T给药后观察到了较低的肥胖程度与较好的糖耐量。在给葡萄糖15分钟后，初始血糖峰值更快地恢复到基线血糖水平(图4A,B)，这与该组拥有较低的空腹胰岛素水平和较低的胰岛素抵抗指数相关(图4C,D)。此外，与纯HFD喂养的小鼠相比，灌胃活D. welbionis J115^T的小鼠血浆瘦素和抵抗素水平显著降低(图4E,F)。葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)水平也出现了类似的趋势(图4G,H)。相反，血浆脂质没有被D. welbionis J115^T处理改变(图S1)。

图4 活D. welbionis J115^T可减少高脂饮食(HFD)下的脂肪组织增加和炎症变化，并改善代谢特征。(A)OGTT血糖曲线(B)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)测得的平均曲线下面积。(C)OGTT期间葡萄糖给药前30 min和给药后15 min测定血浆胰岛素。(D)胰岛素抵抗指数。(E)瘦素、(F)抵抗素、(G)葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)和(H)纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的血浆水平。(I)代表性的皮下和肠系膜脂肪组织(分别为SAT和MAT)的H&E染色图，比例尺=100 µm。(J)SAT中脂肪细胞直径(µm)的分布。(K)脂肪细胞直径(µm)在MAT中的分布。(L)SAT中脂质代谢相关基因的相对表达。(M)SAT中炎症和免疫系统相关基因的相对表达。

肥胖与脂肪细胞肥大、脂肪分解受损和促炎症表型相关，这会导致不良的脂肪因子分泌、胰岛素抵抗和异位脂肪沉积。因此，我们通过组织学和图像分析测量了皮下脂肪组织(SAT)和肠系膜脂肪组织(MAT)的脂肪细胞直径(图4I)。D. welbionis J115^T处理显著提高了SAT中小脂肪细胞(直径≤50 µm)的比例，降低了大脂肪细胞(直径≥70 µm)的比例(图4J)。这种效果在MAT中更加明显(图4K)。

活D. welbionis J115^T处理组小鼠的脂肪细胞较小，与整体脂质代谢较少的脂肪储存有关。事实上，脂肪酸运输蛋白4(Fatp4)，参与脂肪酸从血液中摄取，在经过处理的小鼠的SAT中表达量减少了2倍(图4L)。相反，参与脂解和脂肪酸动员的基因，如脂肪甘油三酯脂肪酶(Atgl)和激素敏感性脂肪酶(Hsl)，在治疗组小鼠的SAT中比在HFD小鼠中表达更多。此外，促炎因子的相对表达，如细胞因子Tnfα和一些巨噬细胞浸润的标志物Cd68、Cd163、Cd11b和Lbp在HFD中升高，在D. welbionis J115^T处理组中降低，而其他一些标志物则不受影响(图4M)。

活D. welbionis J115^T处理的HFD小鼠鼠肩胛间的棕色脂肪组织（BAT）的重量显著低于HFD喂养小鼠，甚至略低于对照组小鼠(图5A)。组织学分析表明，HFD诱导的BAT增加与脂滴大小增加以及脂肪细胞白色样外观相关(图5B)。HFD显著增加了切片中脂滴所占据的表面积(图5C)。在高脂饲料喂养的小鼠中添加D. welbionis J115^T可恢复棕色脂肪细胞形态，并降低脂质含量。然后，我们对从高脂饲料喂养的小鼠BAT中提取的RNA进行了RNA序列分析(图5D)，发现HFD小鼠BAT组织中炎性反应和细胞外基质结构组成GO(GO:0006955和GO:0030020)表达显著高于HFD喂养的D. welbionis J115^T处理小鼠。(图5D，图S4，表S2)。对小鼠炎症和巨噬细胞浸润标记物的定量PCR检测证实，与对照组饮食的小鼠相比，HFD小鼠增加了炎症，且在HFD饲料基础上灌胃活D. welbionis J115^T完全预防了HFD导致的BAT炎症(图5E)。此外，高脂饲料可上调胶原和基质金属蛋白酶基因等促纤维化因子的表达，而活D. welbionis J115^T处理可使其正常化(图5F)，这表明D. welbionis J115^T可保护BAT免受高脂饲料诱导的重塑和/或纤维化。BAT中的炎症和棕色组织白转化与BAT中的线粒体功能障碍和产热作用受损有关。D. welbionisJ115^T补充增加了BAT特异性解偶联蛋白Ucp1、特异性BAT标记物(Prdm16和Dio2)和线粒体生物发生标记物Pgc1α(图5G)的表达，尽管只有Prdm16具有统计学意义。为了确认BAT活化和线粒体数量，我们检测了线粒体呼吸链的几个基因(Mt-Co1、Cox7a1和Cox8b)的表达，发现HFD显著提高了它们的表达，而活D. welbionis J115^T进一步提高了它们的表达(图5G)。

为了进一步确定研究mRNA时观察到的遗传特征是否与代谢水平的特定变化有关，我们测量了柠檬酸合成酶活性。柠檬酸合成酶活性(每毫克组织表达)可以反应线粒体的含量，在活D. welbionis J115^T补充的HFD小鼠的BAT中其活性比纯HFD小鼠高70%(图5H)。尽管活D. welbionis J115^T补充的HFD小鼠的BAT大小减少，其总柠檬酸合成酶活性仍较HFD小鼠高出25.7% (图5)，这表明活D. welbionis J115^T补充增加BAT的线粒体含量和活性。由于BAT通过非颤抖产热的方式产生热量，我们试图确定D. welbionis J115^T补充是否会提高体温。在另一组实验(实验4)中，小鼠被喂食高脂饲料或高脂饲料并补充活D. welbionis J115^T 3周(图S5)，我们观察到，活D. welbionis J115^T补充的小鼠直肠温度平均比HFD小鼠高0.25℃(图5J)。

在本研究中，我们首先发现了新分离的D. welbionis J115^T在普通人群中高度流行，并且在患有代谢综合征的肥胖人群中，该细菌与BMI、空腹血糖和HbA1c呈负相关。我们接下来证明，补充活D. welbionis J115^T可部分保护小鼠免受HFD诱导的代谢紊乱和轻度炎症，特别是通过涉及BAT代谢和活性恢复的机制。

尽管许多细菌已被证明与肥胖和心脏代谢疾病有正相关或负相关关系，但绝大多数细菌从未被培养过，这使得很难证明它们在不利或有益表型中因果关系的概念。在本研究中，我们从简单的相关性转移到证明新发现的D. welbionis J115^T是一个很有前途的候选细菌。值得注意的是，该细菌可以生长在明确的培养基中，适合在人类中使用该细菌。这就可以避免以前在研究A.muciniphila时遇到的困难，因为所有在小鼠身上的初始数据都是通过一种含有不适合给人使用的动物来源化合物的培养基获得的。

有趣的是，虽然D. welbionis J115^T最初是从一个健康受试者的肠道中分离出来的，但是我们发现这种细菌广泛存在于普通人群中。事实上，通过使用几个队列，如HMP、AGP和FGFP(共1984个研究对象)，我们发现至少三分之二的普通人群的肠道中有这种新发现的细菌。由于在患有代谢综合征的肥胖人群中，该细菌的丰度与代谢参数和BMI呈负相关，我们测试了该细菌在HFD喂养时是否会影响宿主的代谢。为了做到这一点，我们每日用新鲜制备的活D. welbionis J115^T (1.0×10⁹可培养的活菌/只/天)或使用冷冻在海藻糖中的活细菌(1.0×10⁹可培养的活菌/只/天)或巴氏杀菌的D. welbionis J115^T(即热杀死的细菌)。我们发现，用活菌(从新鲜培养中获得的或冷冻在低温保护剂中获得的)处理小鼠，都减轻了HFD处理小鼠的体重和脂肪增加。而用巴氏杀菌法杀死细菌可以完全抹杀它的有益作用。我们发现，给予小鼠较长时间(即13周)的处理能产生更强的效果，并能进一步减少脂肪量增加，改善糖耐量，降低胰岛素抵抗。然而，当用较低剂量的D. welbionis J115^T(即<1.0×10⁹可培养和活细胞)处理时，小鼠对该细菌的有益作用没有得到体现(图S2)。

益生菌和有益菌的生存能力通常被认为是其健康促进特性的先决条件。对于某些物种，例如A. soehngenii的有益效应与其在肠道的复制能力相关，但是热杀死的A. muciniphila以及一些乳酸菌和双歧杆菌物种和活菌效果一致。在本研究中，我们发现巴氏杀菌的D. welbionis J115^T是低效的。我们还发现，其活菌不能永久地定居在小鼠的胃肠道。经过72小时的冲洗后，D. welbionis J115^T的粪便含量低于qPCR检测范围(图S3)。D. welbionis J115^T的有益作用是否由新鲜和冷冻制剂中同时存在的组成成分或代谢物介导，而不是由肠道中产生的代谢物，有待进一步研究。总之，这项研究为在肥胖人群中观察到的相关性的概念提供了证据，老鼠实验完全证实了D. welbionis J115^T的有益作用。

为了进一步探索活D. welbionis J115^T改善代谢参数的机制，我们对小鼠肠道菌群进行了测序，证实HFD改变了肠道菌群组成。然而，在处理组和未处理组之间，我们只观察到肠道微生物群组成的细微变化，从而表明细菌是通过对宿主代谢产生直接影响，而不是通过调节整个肠道生态系统，这与我们以前观察到的A. muciniphila的现象一致。因此，我们研究了活D. welbionis J115^T处理后观察到的较低体重和脂肪量增加是否可能是急性炎症或能量吸收减少的结果。我们发现慢性给药D. welbionis J115^T不影响肠道炎症、传递时间和能量吸收，因此表明细菌给药具有良好的耐受性，代谢改善不是由于能量吸收减少。我们发现活D. welbionis J115^T完全恢复了内脏脂肪细胞的形态，以及一些已知的炎症标志物，这些标志物有助于胰岛素抵抗和葡萄糖耐受的发展，抵抗素和PAI-1都与胰岛素抵抗的发生有关，两者较低的循环水平也支持了这一发现。

除了白色脂肪库外，BAT在控制能量和葡萄糖代谢方面至关重要。HFD喂养诱导了小鼠BAT的改变，使脂肪细胞的形态和功能由棕色变为白色，这一过程称为棕色脂肪组织的白化，最终导致BAT产热和能量消耗降低。我们发现活D. welbionis J115^T完全抑制了高脂肪饮食诱导的棕色脂肪组织白化，其特征是较轻的重量和较低的白色脂肪细胞丰度。此外，RNA-seq和qPCR分析显示，补充D. welbionis J115^T可减少巨噬细胞浸润、炎症标志物和促纤维化标志物的表达水平，后者与脂肪组织功能失调和底物氧化导致的能量生产受损有关。转录组数据表明线粒体数量增加是由柠檬酸合酶(线粒体基质的唯一标记)的活性增高所致。与HFD处理的小鼠相比，活D. welbionis J115^T处理的小鼠有更好的能量代谢和更高的能量消耗。补充D. welbionisJ115^T触发线粒体数量的增加，并导致更高的体温。尽管该实验支持了人类共生菌D. welbionis J115^T调节高脂饮食诱导的宿主能量代谢，但是在热中性条件下，活D. welbionis J115^T是否可能诱发对宿主新陈代谢的更强影响还有待探究。

表型改善的确切机制仍有待阐明。在潜在的候选介质中，我们可以提到丁酸盐，它是由D. welbionis J115^T从肌醇中产生的，已知可以增加BAT产热，还有其他特定生物活性脂质控制葡萄糖代谢和炎症。然而，我们在血浆和盲肠内容物中没有发现丁酸含量的增加 (在线补充图6)。总之，我们的数据有力支持了人类肠道共生的D. welbionisJ115^T在高脂饮食条件下可以调控宿主的新陈代谢。通过不同的在体研究，我们证实了D. welbionis J115^T可能通过调节脂肪发育和BAT代谢来调节宿主的能量代谢。至于其他下一代有益细菌，以及解释细菌如何与宿主交互的最终机制值得进一步探索。在本研究中，虽然我们发现该细菌是丁酸盐的生产者，但我们不能排除它可能与其他特定的分泌因素有关。最后，我们发现D. welbionis J115^T (1.0×10⁹可培养活菌)给基因缺陷型严重肥胖的ob/ob小鼠补充6周并没有显著降低其体重和脂肪增加(图S7)。总之，我们的数据强有力地支持了活D. welbionis J115^T对高脂饮食诱导的肥胖和糖尿病的有益作用。然而，是否需要更高剂量的D. welbionis J115^T活菌和/或更长的治疗时间来观察特定模型如ob/ob的有益效果，还需要进一步研究。此外，我们不排除活D. welbionis J115^T补充对小鼠的胰岛素抵抗的有益作用是独立于小鼠的肥胖变化的可能。确实，已经有研究表明宿主暴露于微生物群的时间是影响胰岛素敏感性的关键因素。因此，暴露时间对于菌群靶向治疗糖尿病和超重或肥胖是一个重要的问题。综上所述，D. welbionis J115^T是一种新分离的人类细菌，在普通人群中高度流行，在超重或肥胖伴有代谢综合征的受试者中与BMI、空腹血糖和糖化血红蛋白呈负相关。每天给小鼠给药活D. welbionis J115^T，持续至少6周至13周，可以缓解高脂饮食引起的代谢紊乱，其机制不依赖于肠道微生物群的具体变化，而是同时作用于白色和棕色脂肪组织代谢。