项目文章 | Environmental Research:硫酸钠胁迫下硫循环和镉迁移过程中土壤细菌群落、功能基因和代谢产物研究

2021
09/22

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微生态
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编译:微科盟Moon,编辑:微科盟汤貝、江舜尧。

导读  
硫酸钠胁迫可提高土壤中镉(Cd)的迁移率,微生物的硫氧化能力和镉抗性,而耐胁迫相关代谢物的积累与土壤镉的有效性和毒性增加有关。本研究用硫酸钠刺激受镉污染的好氧土壤微环境,来研究镉污染对土壤微生物群落结构、功能基因和相关代谢物谱的影响宏基因组分析表明,硫氧化细菌和抗镉细菌携带分别编码soxdsrsqr基因和zntczccad基因的基因簇。硫酸钠增加土壤代谢重编程硫代谢的增强引发了三羧酸(TCA)循环的上调,促进了土壤细菌羧酸及其前体物质的分泌高硫酸钠剂量诱导的有机酸积累可能导致Cd迁移率的增加PseudomonasErythrobacter spp.表现出对重金属或硫胁迫的高适应能力,表现为硫循环、镉抗性基因和代谢产物的丰度增加。这些结果为理解盐胁迫下参与硫转化和镉溶解过程的微生物机制提供了有用见解。   

论文ID


 

名:Soil bacteria, genes, and metabolites stimulated during sulfur cycling and cadmium mobilization under sodium sulfate stress

译名:硫酸钠胁迫下硫循环和镉迁移过程中土壤细菌群落、功能基因和代谢产物研究

期刊Environmental Research

IF:6.498

发表时间:2021.6.30

通讯作者:陈世宝 & 师华定

通讯作者单位:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所;生态环境部土壤与农业农村生态环境监管技术中心


实验设计



 

结果与讨论


镉迁移性随土壤中硫含量增加呈现非线性增加
为了确定硫酸钠对土壤镉有效性的影响,我们利用硫酸钠浓度逐渐增加的好氧土壤微群落测定了DTPA可提取镉的含量。通过分析不同化学形态硫的比例分布,我们发现,在对照处理中,90%以上的土壤硫与有机分子结合,而水溶性和盐酸溶性硫在剩余10%中占比较高(图1a)。随着硫酸钠浓度增加,无机硫的比例也逐渐增加,从而导致土壤有效硫的提取量也随之增加(图1b)。尽管施硫土壤中无机硫相对有机硫的比例增加(高达315.6%),但有趣的是,我们观察到土壤有效硫浓度呈指数增加而非线性变化,这与硫酸钠剂量的增加相当。这些结果表明,在此条件下,微生物矿化有机硫为无机硫酸盐可能是土壤硫循环的重要组成部分。此外,添加硫酸钠为硫循环细菌提供了更多电子受体(SO42-),以此增强其活性。
在当前的农业生产活动中,额外施用硫是降低土壤中重金属生物有效性的有效措施。特别是在强还原性环境下,土壤中的H2S和SO42-被转化为负二价硫离子(S2-)和含巯基的离子(HS-),有利于CdS的沉淀。例如,在厌氧水稻土壤中添加硫可以促进铁锰胶膜形成,吸附Cd。但是,这些过程是否也发生在有氧和干旱环境中,还缺乏相应的研究。在本研究中,当土壤溶液中SO42-的含量增加一倍时,DTPA可提取Cd的比例增加到94.6%(附表1)。造成这种现象的原因之一可能是HS-在微生物氧化过程中,硫原子(S0)不断产生质子(H+)酸化土壤,从而维持Cd在土壤中的溶解度。在S0氧化成硫酸过程中,H+的产生是引起金属溶解的必要过程。另一个原因可能是Cd与SO42-等无机配体在土壤溶液中形成络合物,这可能进一步增加金属迁移性。此外,盐胁迫还导致土壤溶液中Na+、K+、Ca2+、Mg2+等碱性阳离子种类和含量增加(附表1),这些阳离子可能会与二价金属离子(如Cd2+)竞争土壤中相同的结合位点,从而导致Cd2+的进一步释放。已有研究也表明,虽然硫酸盐还原对土壤水淹过程中Cd的固定起着关键作用,但对土壤排水过程中Cd的稳定性影响较小或具有不同的影响。
在土壤溶液中,镉可以通过与有机和无机配体的络合而持续存在。在本研究中,用MINEQL+计算的溶液形态分析表明,CdSO40/CdT的比值随着硫酸钠水平的增加而显著增加(图1c)。通常,不带电荷或净负电荷配合物的增加会减少金属带负电荷土壤表面的吸附,从而导致金属的高溶解性和迁移性。与之前的研究结果一致,我们观察到随着硫酸钠的增加,土壤中可提取Cd浓度呈非线性增加(图1d),这进一步证实了在干旱土壤中施用硫酸钠后,可能是其他的作用,而不是化学转化作用影响了镉的溶解性。
 

图1. 应用增加硫酸钠剂量后,土壤中硫的主要化学形式(a)、有效硫(b)、镉(c)、有效镉(d)浓度的分布。
 
基因组分箱和系统发育分析表明抗胁迫ProteobacteriaActinobacteria占优势
为了揭示在硫酸钠胁迫下可能参与硫循环与镉转化的微生物类群,我们接下来通过宏基因组序列重叠群分箱技术复原每个系统中的微生物基因组,共发现68个完整度大于70%且污染度小于10%的bins。覆盖度和GC含量百分比图展示了与复原基因组相关的重叠群簇(附图2a)。这些微生物分属于6个以上的细菌门,宏基因组测序reads丰度最高的几种分别是Proteobacteria(27.9%)Actinobacteria(22.1%)Bacteroides(26.5%)。这些细菌门是非盐碱地和污染土壤中的常见微生物,具有不同的丰度。我们成功重构了20个可能与硫循环和镉毒性相关的高质量基因组草图(附表2),并利用预测到的蛋白质进行系统发育分析,发现其中10个bins与Proteobacteria和Actinobacteria聚为一簇(图3和附表3)。由此推测,在硫和镉胁迫条件下,重金属抗性和硫氧化代谢通路促进了这些微生物的主导地位。
 

图3. 硫(a)和镉(b)相关基因组分箱的最大似然系统发育树及其读取深度。
 
土壤功能基因和微生物群落的刺激
3.1 硫氧化可能受变形杆菌soxsqr基因介导
鉴于这些微生物普遍存在金属抗性和硫氧化代谢活性,我们接下来重点鉴定和研究宏基因组数据中这些微生物的功能基因,尤其是硫转化和镉抗性通路相关基因。我们发现在硫氧化过程中,sox基因的拷贝数随着硫酸钠浓度增加而增加(图2a)。有其他研究将无机硫化物氧化过程描述为细菌在这些特定胁迫条件下最重要的产能反应。在镉和硫含量高的土壤中,与硫循环相关的功能基因的丰度更高也可以用有效硫含量更高来解释(图1b)。根据每个基因组bins(例如Bin36、Bin354、Bin295、Bin81、Bin99、Bin119、Bin149)中硫代谢相关基因reads的丰度比例(图2),硫氧化微生物类群包括Sphingomonadaceae、Pseudonocardiaceae、Pseudomonadaceae和Haliangiaceae等。在这些与硫氧化反应相关的reads中,系统发育分析结果表明最多的sox基因reads来自于一个变形杆菌基因组(图2,图3a)。
Sox系统通常控制好氧化能营养和厌氧光养变形杆菌中硫合物的氧化。先前研究也发现,变形杆菌中保守的sox操纵子控制着Paracoccus中硫代硫酸盐向硫酸盐转化的硫氧化途径,而不会形成游离中间体。Sox系统的模块化性质使其能够利用不同种类硫中间体进入氧化途径。因此,不同还原性无机硫化合物的中间产物(如S2O32, SO32等)在微氧条件下可被周质中Sox复合体和O2、NO3和NO氧化,最终导致为SO42-的积累。
迄今为止,在变形杆菌基因组中已经发现了大量的Sox基因簇,如soxRSVWXYZABCDEFGH。这项研究中,在富硫微环境中鉴定的soxABD同源物可以编码将硫代硫酸盐转化为硫酸盐所需的蛋白质。此外,这些样品中含有许多编码巯基酯酶的soxGsoxR。除sox基因家族外,编码硫醌氧化还原酶的sqr基因也能催化硫化物作为电子供体氧化成硫或聚硫化物。同样,反式作用的异化亚硫酸盐还原酶(Dsr)系统也可以将磺胺类物质氧化成亚硫酸盐。在这项研究中,Pseudomonas及其近缘物种是硫胁迫土壤中参与硫转化的优势类群。据报道,这些物种能够不完全氧化硫代硫酸盐,以及活性较低的硫化物和单质硫,形成连四硫酸盐,而连四硫酸盐可以被化能自养菌利用。
除了参与硫氧化的基因,我们还发现了与硫还原和硫转运相关的基因(cysADHIJNCWaprAB),这些基因随硫酸钠增加而增加(图2a。这些硫还原基因在污染土壤进添加硫酸钠后丰度较低。微生物群落中硫氧化增加而硫还原减少,这与观察到的硫转化相关基因的丰度和类型随着盐胁迫的增加而改变相一致。其他研究也证实,土壤微生物可以通过调节基因和代谢产物的表达以适应不同环境。由此推测,高浓度硫促进了微生物群落的硫氧化活性。在本研究中,Bins 119、149和304包含硫酸盐还原基因(cysJaprA),以及编码sox硫氧化基因的reads,表明携带这些基因的物种可能进行逆向反应,即将还原态硫化合物氧化为硫酸盐。已有研究发现,许多化能自养固氮生物功能多样,可以在富硫化物的寡营养环境中利用多种电子供体,如氧化镉、铅、锌等。以上结果表明,添加硫酸盐可促进硫氧化微生物类群的生长,微生物的异化型硫氧化作用可能在提高土壤Cd迁移率中起主导作用。

2. 随着环境硫酸钠浓度增加,微生物组宏基因组测序文库中被注释为与硫循环(a)和镉毒性(c)相关的功能基因的reads百分比;被注释为硫代谢(b)和镉代谢(d)的reads分类。

 
3.2 镉抗性可能由Sphingomonas cad/czc基因介导
接下来我们分析了与土壤中镉生物有效性相关的基因,发现与镉抗性相关的基因(cadAcadIczcAczcBczcCczcDzntA)均存在于重建的基因组中(图2c)。与对照相比,随着硫酸钠增加,这些基因的相对丰度增加,表明由于土壤Cd有效度高,携带这些基因的抗镉细菌增加了。其中cadA的相对丰度最高。需要指出的是,镉通过与必需二价阳离子相同的运输途径进入微生物细胞,并且微生物对镉的抗性通常来源于耗能的外流机制。CadA是一种阳离子转运ATP酶,是质粒编码的抗逆性通路的共同组成部分。在这些系统中,CadC结合到cadA基因的启动子-操纵基因以抑制其转录。在本研究中,分别属于Sphingomonas sp.和Candidatus_Solibacter_usitatus的Bin 99和Bin 96含有丰富的编码cadAcadC的重叠群(图2,图3b)。Sphingomonas已被报道编码不同的金属氧化基因和表达高水平的碱性磷酸酶,例如,ZntA参与镉和铅抗性,尽管它是一种锌转运ATP酶。CadA-ZntA和ZntR的同源物在Pseudomonas putida 06909中位于染色体的相邻位置,可以提供强镉抗性。意外的是,虽然已知Candidatus_Solibacter成员与青枯病有关,但目前没有其参与土壤中的Cd代谢的报道。
相比之下,CzcA、CzcB和CzcC蛋白包含由阳离子-质子反转运体驱动的主动外排蛋白复合物,可以将Cd2+泵出微生物细胞。具体来说,CzcA是一个阳离子/质子反向转运体,而CzcB是一个阳离子结合亚基,CzcC亚基可以修饰Cd2+特异的底物,CzcD协调控制czc基因簇表达,并作为细胞外阳离子的传感器。因此,适当的czc基因表达水平可以保证细胞对重金属具有足够的抗性。我们发现czc基因相关reads来源于多个物种,例如Bins164、51和96。这些结果表明,细菌可能进化出了抗性系统,使它们能够在有毒的高金属环境中生存。值得注意的是,Sphingomona ssp.(即Bin99)含有编码硫氧化和镉抗性基因(分别为soxRcadA)的contigs。Sphingomonas属的细菌分布广泛,常常与生物地球化学动态过程有关,如铁或硫酸盐循环。在这项研究中,土壤中硫酸钠增加导致溶解性Cd大量释放,最有可能是由于Sphingomonas soxRcadA基因的转录表达增强导致的。属于耐盐Erythrobacter_sp.的重叠群(Bin231)数目也增加了,但它在金属抗性方面的具体作用尚待进一步研究确定。
 
在硫酸钠胁迫下镉污染土壤的TCA循环和膜脂质代谢物增加,而糖代谢产物减少
微生物群落不断分泌代谢产物,进一步改变土壤中的生化反应。本研究采用基于GC-LS分析的非靶向代谢组学方法,监测土壤微生物在环境压力的代谢反应产生的代谢产物。采用偏最小二乘回归分析法(PLS-DA)多元数据分析方法对硫酸钠胁迫下的代谢反应变化进行鉴别。在PLS-DA得分图中(图4a),加硫酸钠组与对照组具有明显差异。并且,在硫酸钠胁迫下,影响逐渐增强。PLS-DA由于其强大的预测或鉴别能力已被证实为一种有用的样本分类技术。由于土壤中的代谢产物主要来源于土壤微生物,因此镉污染土壤中的硫酸钠增加大幅度改变了土壤微生物群落的代谢过程。
土壤中代谢产物谱随不同硫酸钠处理下不同生物活性的变化而变化,表现为有机酸和脂类相对丰度增加而碳水化合物相对丰度降低(附图3)。在通路富集分析中,通过p值小于0.05和影响值大于0.1选择显著相关的通路。本研究中,我们表征了6条代谢通路(图4b),并且主要的代谢通路之间有明确的联系(图5)。与对照组相比,盐胁迫下依赖于三羧酸循环、脂肪酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢的代谢产物均上调。基于这些结果,调节代谢通路似乎是微生物在胁迫条件下生存的主要策略。
在本研究中,TCA循环上调促进微生物分泌各种羧酸,如延胡索酸、苹果酸、草酸、乙醛酸等(附图4),这可能是由丙酮酸等相应前体物的增加引起的,因为这些前体物在土壤硫酸钠增加时下以剂量依赖的方式显著增加(附图4)。TCA循环的大幅上调可能有利于微生物适应盐胁迫条件下细胞质和周围环境之间的渗透平衡。三羧酸循环是细胞呼吸的关键组成部分,需氧微生物通过上调呼吸作用产生能量分泌防御性化合物,以应对氧化应激。此外,参与三羧酸循环的有机酸可以通过释放H+和/或它们的羧基,与酸性矿物形成可溶的Cd-有机配合物。TCA循环中间体的上调也可导致Na+和Cd2+等过量阳离子的中和,以缓解盐胁迫。
值得注意的是,延胡索酸和油酸的准确率平均下降幅度最大(图4c),这表明这些化合物是造成对照组和处理组之间的差异的原因之一。脂肪酸、固醇和磷脂是质膜的主要组成成分,其含量的变化可能表明了膜组成和膜流动性的重塑对微生物适应盐胁迫环境的影响。脂肪酸高表达被证明有助于受损膜的修复,并在应激期间维持有利于主要蛋白功能的细胞内环境。综上所述,我们发现镉污染土壤中高剂量的硫酸钠可引起胁迫相关代谢产物的微生物分泌发生显著变化
众所周知,糖类在应激过程中也会累积,因为它们作为调节机体代谢的重要渗透保护剂,有可能维持细胞的水合作用和功能。然而,在本研究中,D-核糖浓度在硫酸钠胁迫下显著降低。值得注意的是,蛋白质和糖类通常是微生物生物膜的主要组成部分,而生物膜在胁迫环境下微生物的维持和定植中起着重要的作用。D-核糖和其他糖(如葡萄糖和纤维二糖)的下调可能进一步表明对生物膜形成的负面影响。此外,由于必需氨基酸甘氨酸和丝氨酸防御物质谷胱甘肽合成中具有重要作用,它们在应激过程中经常上调。丝氨酸和甘氨酸的高表达可能表明土壤微生物群落的特定成员启动了抗氧化防御途径。在本研究中,我们发现丝氨酸的分泌是由硫代谢引起的。高剂量硫酸钠激活剧烈硫代谢反应可能会启动下游的代谢途径并改变相应代谢物的积累。此外,有趣的是,我们观察到一些抗应激代谢产物,包括棕榈酸和苹果酸,并没有随着硫酸钠剂量的增加而持续上调(图4c)。这些变化可能表明,高硫酸钠可能诱导了强烈的应激反应,这些应激反应可能抑制了其他与盐耐受相关的途径。

图4. 偏最小二乘法判别分析得分图(a)和富集分析(b)展示代谢通路的差异,随机森林分析展示在不同处理条件下富集的土壤代谢物。


  图5. 与对照组相比,高剂量硫酸钠处理下土壤细菌表达上调的主要代谢通路。
 
特定的基因组箱与胁迫相关代谢物的丰度增加有关
在目前的研究中,增加硫酸钠浓度改变了镉污染土壤中的微生物群落,从特定基因组和代谢物相关reads的丰度变化可以看出这一点。在这项工作中,我们利用到通过调查微生物栖息土壤中分泌的代谢物推断土壤中的微生物群落结构和活跃生化矿化途径的原理。另一项最近的研究报道了在EnterobacterComamonas spp.共培养中,Cd(II)胁迫引发了H2S和琥珀酸产生、金属离子转运系统上调和TCA循环。此外,Pan 等人研究了含或不含铁修饰的CeO2纳米颗粒对水稻土土壤群落代谢组的环境影响,发现脂肪酸、氨基酸和烷烃都受到与处理相关的微生物代谢变化的影响。然而,在许多环境条件下(如各种重金属污染土壤)尚未建立微生物群落和土壤代谢物之间的联系。在这项研究中,我们确定了土壤代谢物和基因组分箱之间具有统计学意义和强共现关系(附图5)。其中,变形杆菌与代谢产物(主要是有机酸和脂类)存在一系列强正相关关系。高剂量硫酸钠增加了变形杆菌丰度,进而触发了应激相关代谢物的分泌,这与Pan等人的研究结果一致,他还发现,污染土壤中盐胁迫导致变形杆菌富集与类似代谢物水平的升高相关。
值得注意的是,这些典型的代谢物,特别是羧酸,有助于建立一个有利于酸杆菌生存的生态环境。我们观察到酸杆菌(Bins 51和96)与有机酸浓度之间呈正相关。在酸杆菌中,Bin 119与有机酸和烷烃具有较强的正相关。硫酸钠增加了它们的浓度,这可能与Bin 119相关基因丰度的增加有关,特别是硫氧化相关基因。硫酸钠增加后,Chloroflexi (Bin 319)丰度的增加也促进脂肪酸(山梨酸)浓度的增加。这些结果表明,土壤细菌已经发展出专门的代谢产物分泌机制,促进其在高胁迫环境中的维持。最近的其他研究也表明,微生物的耐受性是通过上调抗氧化酶和渗透保护有机化合物的生物合成途径介导的,这些物质可能被释放到环境中。同样,Lian等人发现,在sst基因介导的盐胁迫下,微生物对土壤中烟酸、水杨酸和肉桂酸等芳香化合物积累到较高水平,这反过来又促进了土壤微生物组组成和主要代谢过程的变化,从而丰富了能够利用这些化合物获取碳和能量的微生物类群。此外,值得注意的是,Bin 99不仅与土壤主要代谢物的相关性最强,而且具有较高与硫氧化和镉抗性相关基因的reads丰度。不难想象这些菌株可以作为生物制剂,在有氧条件下促进Cd迁移性方面具有潜在应用价值。


结论


硫酸钠可以通过刺激微生物调控应激反应途径促进土壤中Cd的释放。硫酸钠可以诱导微生物硫氧化和镉抗性基因的转录,这一现象在Erythrobacter (Bin113)和Pseudomonas (Bin 99)中尤其明显,这些微生物的功能发生了显著变化,并参与了土壤Cd的生物迁移。本研究结果表明,在镉含量高的土壤中,细菌通过调节膜磷脂组成和激活抗氧化防御途径等多种途径增强其对镉和钠盐胁迫的耐受性。其中,硫代谢引发了TCA循环有机酸合成的上调,从而导致土壤细菌分泌这些有机酸,而盐胁迫下有机酸积累的增加促进了土壤Cd的迁移。值得注意的是,PseudomonasErythrobacter spp.通过上调硫循环和镉抗性基因,表现出较强的生态适应代谢能力。在好氧条件下,特别是在高硫酸钠浓度的环境中,这些细菌可能被用作生物制剂来促进Cd的迁移。
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关键词:
微生物,硫酸钠,基因,土壤,增加

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