编译：微科盟Prolemon，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。
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导读
脑卒中（也叫中风）是全球死亡和残疾的主要原因。神经保护方法在临床试验中失败了，因此需要有替代靶点的治疗创新。肠道微生物群是许多中风风险因素的重要因素。然而，中风和肠道菌群之间的双向相互作用在很大程度上仍然未知。本研究中，我们进行了两项临床队列研究，以捕捉中风后肠道生态失调动态及其与中风预后的关系。然后，我们采用大脑中动脉栓塞模型探讨小鼠卒中后肠道失调，以及急性缺血性卒中与肠道失调的因果关系。最后，我们测试了氨基胍、超氧化物歧化酶和钨酸钠是否能通过恢复肠道失调来缓解卒中后脑梗死。本研究发现脑缺血迅速引起肠道缺血，并通过自由基反应产生过量硝酸盐，导致肠道菌群扩张失调。肠杆菌科富集通过增强全身炎症而加重脑梗死，是卒中患者主要不良预后的独立危险因素。使用氨基胍或超氧化物歧化酶减少硝酸盐生成或使用钨酸钠抑制硝酸盐呼吸均可抑制肠杆菌过度生长，减少全身炎症并减轻脑梗死。这些影响是肠道菌群依赖的，表明脑肠轴在中风治疗中的转化价值。这项研究揭示了中风和肠道失调之间的相互关系。缺血性中风会迅速引发肠道菌群失调，肠杆菌过度生长，进而加重脑梗死。
原名：Rapid gut dysbiosis induced by stroke exacerbates brain infarction in turn
译名：脑卒中引起的肠道菌群失调加重脑梗死
期刊：Gut
IF：23.059
发表时间：2021.2.9
通讯作者：尹恝＆周宏伟＆何彦
通讯作者单位：南方医科大学珠江医院
1. 肠杆菌科富集是急性缺血性卒中患者早期恢复的独立危险因素
招募了两个独立的缺血性卒中患者队列，以探索肠道微生物群失调的动态变化及其与卒中预后的相关性。第一组纳入28例缺血性卒中患者，收集急性(T1, T2)、亚急性(T3)和恢复期(T4)患者的粪便样本(表S1，图S1A)。根据基于加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)，急性期(T1和T2)和亚急性期(T3)的微生物组结构与年龄匹配和性别匹配的健康对照明显分离，并在恢复期(T4)恢复(图1A,B)。利用QIIME2,97%的序列被划分到科水平，由于16S rRNA基因标签的分辨率有限，只有67%的序列被划分到属水平(图S1B)。在科水平上，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、Veillonellaceae和Lachnospiraceae在中风后显著富集，而拟杆菌科(Bacteroidaceae)和Prevotellaceae显著减少(图1C和图S1C)。其中肠杆菌科在T4中风恢复后的增幅最大，与总群落动态相似(图1C,D)，而Bacteroidaceae则呈现相反的动态趋势(图1C及图S1D)。在第二个队列中，我们招募了124名缺血性卒中患者，在入院48小时内收集他们的首次粪便样本，并在治疗后7天评估他们的主要预后。根据他们的国家卫生研究所卒中量表(NIHSS)评分在7天与基线时相比的改善情况(表S2，图S1F)，将这些患者分为较差(<40%改善，n=72)或较好(≥40%改善，n=52)。这两组在入组时的NIHSS初始分数上没有显著差异(图S1H)。微生物分析显示，除了肠杆菌科在预后不良患者中显著富集外，上述两组中许多中风相关类群的相对丰度没有显著差异(图1E,F)。然后，我们测试了肠杆菌科是否是预后不良卒中患者的独立危险因素。在收集的所有临床资料中，同型半胱氨酸是缺血性脑卒中患者长期死亡率的危险因素，其中23个在单因素logistic回归分析中具有显著性(图1G)，而在多因素logistic回归分析中不具有显著性(图1H)。相反，在单变量(OR 1.72, 95%CI 1.31-2.27)和多变量logistic回归分析(OR 1.97, 95%CI 1.23-3.16)中，肠杆菌科富集仍然显著，表明肠杆菌科是预后不良的卒中患者的独立危险因素。
图1 随着卒中时间的延长，肠道微生物群的动态变化，肠杆菌科是卒中的一个独立的危险因素。(A)-(D)临床队列1包括28例缺血性卒中患者和28例健康对照。(A)主坐标分析显示了健康对照和急性期(T1-T2)、亚急性期(T3)和恢复期(T4)缺血性卒中患者的肠道微生物群组成。(B)所有缺血性脑卒中组与对照组的距离。(C)空白对照组与各缺血性脑卒中组肠道细菌科和肠道微生物α多样性(Shannon和PD whole tree index)的气泡图分布差异显著。(D)对照组和所有缺血性卒中组肠杆菌科相对丰度。(E)-(H)临床队列2包括124例预后良好或不良的缺血性卒中患者。(E)气泡图在主要结局良好和不良组间分布有显著差异的分类群。(F)
主要结局预后
不良组肠杆菌科的相对丰度显著较高。(G)缺血性脑卒中患者主要预后不良的危险因素的单因素logistic回归分析。(H)在校正混杂因素后，对缺血性卒中患者主要预后不良的危险因素进行多因素logistic回归分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001采用Wilcoxon秩和检验。2. 缺血性卒中导致肠道菌群快速失调，肠杆菌科细菌富集在确认急性脑卒中患者肠道微生物群失调与肠杆菌科细菌富集的关联后，我们试图确定这种失调是否由脑卒中的发生引起。我们使用经典的卒中模型
MCAO，探讨卒中事件是否能引起显著的肠道微生物群失调(图2A)。为了测定小鼠脑卒中后肠道微生物群的变化，我们采用MCAO或假手术，分别于脑卒中后3小时、6小时、12小时、1天、3天、7天处死小鼠进行动态跟踪。根据我们的结果，动脉栓塞早在中风后3小时就成功地诱发了脑梗死，从12小时开始显著增加，在第1天到第7天达到顶峰(图2B,C)。有趣的是，随着PC1和PC3脑梗死的增加，肠道微生物群呈现清晰而快速的动态变化。早在中风后3小时，回肠内容物菌群与对照组有明显偏差(图2D,E)。从卒中后12小时到卒中后1天，微生物组达到最大偏差，然后在卒中后7天逐渐恢复到与对照组相似的状态。小鼠的这种偏离-恢复模式与卒中患者的趋势相似，但在更短的时间内(图1A)。同样，我们发现肠杆菌科是卒中建模后变化最显著的分类群(线性判别分析=4)(图S2A)。早在中风后6小时，肠杆菌科相对丰度就从正常状态下的不足1%增加到高于10%，它从12小时到1天达到高达40%的峰值水平，然后从3天到7天逐步恢复(图2F和H)。这种动态变化不仅发生在回肠内，还发生在其它三个额外的肠胃部分，即空肠，盲肠和结肠(图2G,I,J,图S2B-J)。除了16S rRNA测序，我们还利用大肠杆菌（Escherichiacoli）特异引物进行了定量PCR，与sham组1天后的时间点相比，MCAO组1天后四个肠胃部的大肠杆菌从几百过度生长到了几万倍(图S2K-N)。
图2 大脑中动脉栓塞(MCAO)小鼠肠道菌群快速失调，肠杆菌科显著富集。(A)动物实验设计:对照组(n=10只)，sham组(根据处死时间分为不同组，分别于假手术后3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d，n=5只/时间点)，MCAO组(根据处死时间将小鼠分为不同组，分别于MCAO后3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d采集，n=10只/时间点)。(B)所有MCAO组的脑切片。(C)对照组与所有MCAO组的相关脑梗死率。(D)-(F)对照组和所有MCAO组回肠内容物样本中肠道菌群的时间变化，包括基于非加权UniFrac距离的主坐标分析(D)，PC3上群落结构(E)和科水平上的肠道微生物组成(F)的时间序列分析。在空肠(G)、回肠(H)、盲肠(I)和结肠(J)各时间点，通过16S rRNA测序，sham组和MCAO组间肠杆菌科相对丰度的时间变化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001采用Wilcoxon秩和检验。
3. 肠道微生态失调与卒中诱发的肠道缺血和硝酸盐的产生有关为了探讨脑卒中导致肠道快速失调的潜在机制，我们采用RNA测序技术比较了MCAO组和sham组小鼠盲肠组织的基因表达谱。根据通路分析，我们发现MCAO组中只有谷胱甘肽代谢过程通路显著上调(图S4A，B)，由于谷胱甘肽参与了氧化应激过程，而氧化应激主要是由缺血和再灌注触发的，我们假设胃肠道也伴有脑卒中的缺血。为了验证这一假设，我们使用激光散斑成像系统检测小鼠盲肠MCAO期间的血流。与sham组相比，当从颈动脉移除丝状物时，小鼠盲肠内的血流明显减少，并持续1小时(图3A,B)，因此支持了我们的假设，即胃肠道也伴有缺血性卒中(图3C)。我们进一步测量了缺血-再灌注损伤过程中三个关键基因的表达：Nox1和Duox2的超氧化物生成和Nos2的一氧化氮(NO)生成，与sham组相比，这三个基因在卒中后1天均显著上调，这进一步支持了卒中期间肠道缺血-再灌注损伤的存在(图3D-F)。此外，它们的相对表达水平也表现出了时间转移模式，在卒中后3小时开始呈上升趋势，在卒中后1-3天出现峰值(图S4C-E)。超氧化物和NO可以迅速相互反应，产生细胞毒性过氧亚硝酸盐，进而自发转化为硝酸盐，而硝酸盐就是一种在厌氧微环境中通过硝酸盐呼吸促进肠杆菌科过度生长的化学物质。我们进一步确定了小鼠盲肠黏液层的硝酸浓度在从卒中后3小时的9.12 µM显著增加到卒中后1天的105.50 µM(图S4F)，这显著高于sham组的16.98 µM (图3G)。在体外肠道微生物中添加0-200 µM硝酸根研究结果表明，硝酸盐水平足以诱导肠杆菌科细菌的过度生长(图S4G)。值得注意的是，Nox1和Duox2表达的升高、硝酸盐浓度的升高、肠杆菌科过度生长和脑梗死增加均在卒中后1天达到峰值。除了肠道菌群失调，肠道缺血-再灌注损伤和过氧亚硝酸盐的产生也会损害肠道屏障的完整性。我们测定了包括Tjp1、Ocln和Cldn2的紧密连接蛋白基因的相对表达，与相关sham组比，MCAO组脑卒中后1天Tjp1和Ocln的表达明显降低，Cldn2的表达明显升高(图3H-J)。除了肠道屏障破坏以为，我们还测定了小鼠血清中的肠道渗漏生物标志物。我们的结果显示，MCAO组中脂多糖(LPS)、脂多糖结合蛋白(LBP)和D-乳糖(D-lac)显著富集(图3K、L和图S4H)，并在卒中后1天达到峰值(图S4I-K)，呈现相似的时间转移模式。
图3 大脑中动脉栓塞(MCAO)小鼠肠道缺血再灌注后硝酸盐呼吸诱导肠道微生物菌群失调。(A)sham组(n=3)和MCAO组(n=5)在sham和MCAO手术期间的激光散斑图像和小鼠盲肠血流相关ROI比例。(C)脑卒中后肠缺血和再灌注诱导自由基反应机制示意图。(D) Nox1、(E)Duox2和(F) Nos2相对表达量;(G)小鼠盲肠黏液层硝酸盐浓度;相对(H) Tjp1，(I)Ocln和(J) Cldn2表达;(K)sham组和MCAO组第1天时间点血清脂多糖(LPS)和脂多糖结合蛋白(LBP)水平(n=10只/组)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001采用Wilcoxon秩和检验。
由于肠道肠杆菌科迅速富集与脑梗死面积增多在时间上是一致的，我们想知道肠杆菌科过度生长是否在脑卒中的病理生理过程中发挥了作用。作为一种典型的肠杆菌科物种，大肠杆菌在雄性和雌性小鼠中风模型中均表现出显著的过度生长，我们试图确定大肠杆菌是否能够影响中风的进展。我们的结果显示，与只接受了相应抗生素处理小鼠(Abx组)相比，将从MCAO处理小鼠中分离出来的大肠杆菌菌株接种到抗生素处理小鼠中显著增加了脑梗死的水平(图4A,B)。为了探究其潜在机制，我们通过RNA测序比较了抗生素处理组和大肠杆菌处理组小鼠盲肠组织的差异表达基因，发现了大肠杆菌处理组参与免疫系统过程的基因，基于GO分析发现其先天免疫反应和对细胞因子的反应显著富集(图4C)。根据KEGG分析，大肠杆菌处理组的上调通路包括干扰素信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路和toll样受体(TLR)信号通路。因此，我们进一步测定小鼠血清中系统性炎症相关的生物标志物水平，发现大肠杆菌处理组的LPS、LBP、TNF-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6浓度明显高于Abx组。这表明，肠道微生物中大肠杆菌丰度的增加可能会加速中风后的全身炎症(图4D-H)。此外，我们的结果显示，在大肠杆菌接种的小鼠中TLR4通路相关基因，包括Tlr4、Traf6、Tram、Myd88和Nfkb显著上调(图4I-M)。为了验证LPS-TLR4通路的作用，我们敲除了参与整合LPS生物合成通路的waaL基因。大肠杆菌waaL突变体接种组的脑梗死发生率与Abx组相当，显著低于E. coli处理组(图4A,B)。此外，从急性缺血性中风患者中分离的另一株大肠杆菌(E. coli AIS01)也加重了小鼠模型中的脑梗死(图S4L)。这些数据表明大肠杆菌在肠道中的过度生长可能通过LPS介导的全身炎症加剧脑梗死。
图4 肠杆菌科过度生长促进脑梗死。(A)动物实验设计及(B)Abx组、大肠杆菌组、ΔwaaL大肠杆菌组的脑梗死比例(n=10只/组)。(C)基于大肠杆菌组和Abx组盲肠组织RNA测序分析的热图显示两组之间的基因表达显著改变(n=5只小鼠/组)。涉及免疫和全身炎症通路的基因被注释。(D)血清脂多糖(LPS)，(E)脂多糖结合蛋白(LBP)，(F)肿瘤坏死因子(TNF)-α，(G)白细胞介素(IL)-1β，和(H) IL-6在Abx组和E. coli组之间的水平。(I) Tlr4，(J) Traf6，(K) Tram，(L) Myd88和(M) Nfkb在Abx组和
E. coli
组之间的相对表达量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001采用Wilcoxon 秩和检验。为了测试肠杆菌过度生长作为中风治疗新靶点的潜在作用，我们使用了三种针对不同途径的抑制剂：抑制iNOS介导的NO产生的AG，可以消除超氧化物的一个热稳定的Mn-型SOD，和抑制肠杆菌科的硝酸盐呼吸的钨酸钠(W)。三种物质均在MCAO后1小时口服(图5A)。与预期的一样，AG组和SOD组盲肠黏液层硝酸盐浓度与sham组相当，显著低于MCAO组(图5B)。有趣的是，抑制剂不仅抑制了自由基的产生，而且在转录水平上显著抑制了相关基因的表达。AG组Nos2相对表达量显著降低，SOD组Nox1、Duox2表达量显著降低(图5a-e)，提示iNOS可能存在正反馈调控。根据PCoA、AG、SOD和W显著恢复了肠道菌群失调(图5F-H)，并将Enterobacteriaceae丰度降低到sham组水平(图5I-K)，支持了硝酸盐呼吸是中风后肠道失调的主要驱动因素这一事实。更重要的是，AG、SOD和W显著降低脑梗死率(图5L-N)以及挽救了海马神经元(图S5A)，这进一步证实肠道生态失调对卒中后损伤的进展至关重要。虽然AG、SOD和W改善了肠道失调，减少了脑梗死，但这种脑梗死的改善是否由肠道微生物群介导尚不清楚。因此，我们先用广谱抗生素混合剂治疗小鼠，再用AG (Abx-AG)、SOD (Abx-SOD)或W (Abx-W)治疗小鼠。抗生素明显削弱了这三种方法的保护作用，Abx-AG、Abx-SOD和Abx-W组脑梗死与Abx组比较无显著性差异(图5O)，表明肠道微生物群对AG、SOD和W介导的脑梗死的改善是必要的。为了验证SOD在肠道微环境中的作用是否是通过其超氧化物歧化活性来实现的，我们构建了SODH84A突变体，该突变体将活性中心的氨基酸组氨酸突变为丙氨酸。这种突变酶缺乏锰结合活性，因此不能使超氧化物歧化。与MCAO组相比，SODH84A组没有改善脑梗死(图5M)。LPS、LBP、D-lac和丙二醛(MDA)结果表明，给药AG、SOD或W可恢复肠道屏障功能障碍(图S5J-L、S6I-K和S7I,J)。对紧密连接蛋白Cldn2、Tjp1和Ocln基因的相对表达分析进一步支持了上述观察结果(图sgo-q、S6N-P和S7M,N)。此外，这些方法减轻了全身炎症，显著降低血清TNF-α和IL-6浓度和促炎细胞因子基因表达，包括Tnf、Il6、Il1b、Kc和Cxcl2(图S5M、N、R-V、S6L、M、Q-U和S7K、L、O-Q)。作为Th1和Th17 T细胞极化的标记物，IFN-γ和IL-17与小鼠卒中模型中较差的预后相关，我们发现在AG、SOD和W处理的小鼠中Ifng的相对表达明显减少，AG和SOD处理的小鼠中Il17的表达减少(图S5W、X、S6V、W和S7R)。作为一种有希望改善脑梗死的治疗方法，我们进一步测试了AG靶向脑卒中的剂量-反应关系。脑卒中后1小时给药时，有效给药剂量为25~200 mg /kg，以25 mg/kg效果最佳(图5P)。与其他有效剂量相比，25 mg/kg对肠杆菌过度生长的抑制效果最强(图S5Y,Z)。此外，我们通过给MCAO模型小鼠25 mg/kg AG来测试治疗时间窗，发现AG可显著减少中风后1小时到12小时的脑梗死(图5Q)。卒中后12小时MCAO组肠杆菌仍显著高于sham组(图2F-J)，这可能有助于解释卒中后12小时给药AG的有效治疗效果。
图5 通过给药
氨基胍
(AG)、超氧化物歧化酶(SOD)或
钨酸钠
(W)抑制肠杆菌过度生长可改善脑梗死。(A) AG、SOD、W干预动物实验设计(n=10只/组)。(B)sham组、MCAO组、AG组、SOD组小鼠盲肠黏液层硝酸盐浓度。(C)sham组、MCAO组和AG组中Nos2的相对表达量。(D)sham组、MCAO组和SOD组Nox1和Duox2的相对表达量。主坐标分析显示盲肠内容物在sham组、MCAO组和(F) AG、(G) SOD或(H) W组之间的分布。sham组、MCAO组和(I) AG、(J) SOD或(K) W组盲肠内容物中肠杆菌科相对丰度较高。MCAO组与AG组脑梗死发生率(L)；MCAO组、SOD组、SODH84A组(M);(O)Abx组、Abx-AG组、Abx-SOD组和Abx-W组的脑梗死比例。(P) MCAO后1 h，分别给药1、10、25、50、100和200 mg/kg的小鼠(n= 4-10只/组)的脑梗死率。(Q) MCAO后1 h、3 h、6 h、12 h给药AG 25mg/kg后的脑梗死率(n=6-10只/组)。据我们所知，这是第一次揭示肠道菌群失调在重大疾病中的病原学作用，而且揭示了疾病状态下肠道菌群失调的驱动力，从而证明了二者之间的相互因果关系。在过去的十年中，肠道生态失调被发现会引起许多疾病，从代谢紊乱到中枢神经系统疾病，尽管生态失调的驱动力在很大程度上仍然难以捉摸。据观察，临床队列中缺血性卒中患者的肠道微生物群是失调的。这种生态失调，至少部分由中风事件迅速引起的。在MCAO建模后3小时，我们的结果显示了一种一致的时间转移模式，包括
缺血再灌注基因的表达，肠道微生物群与正常状态的偏离，肠杆菌的快速过度生长，以及脑梗死的增加。虽然人们对卒中后肠道缺血的可能性提出了担忧，但本研究提供了这种病理的影像学和分子证据。
4个肠段的肠道微生物群的硝酸盐呼吸最终导致肠道缺血-再灌注导致肠道失调。我们的研究结果不仅揭示了脑肠相互作用的新途径，而且为中风的治疗和预防提供了一系列潜在的新靶点。肠杆菌在肠道内的生长以及受损的肠道屏障通过产生大量的脂多糖迅速诱发全身炎症。我们观察到脑卒中患者血浆中LPS和LBP水平的升高，并且LPS和LBP水平的升高与缺血性脑卒中患者的预后较差相关。此外，LPS注射加重了实验性中风后的神经功能缺损和生存能力受损。在这里，我们观察到LPS可能通过显著升高小鼠血清TNF-α和IL-6水平，加速脑梗死后的炎症反应，从而促进脑梗死的恶化。据报道，这些炎症细胞因子在缺血性卒中患者中增加，并加重脑缺血损伤。然而，LPS的增加是否是卒中发作后肠杆菌科菌大量出现的短期效应尚不清楚。我们的结果显示，抑制肠缺血-再灌注诱导的肠杆菌过度生长可以减少全身炎症和脑梗死。此外，肠杆菌科的相对丰度是缺血性卒中患者早期恢复的独立危险因素，表明肠道微生物群在卒中事件急性期发挥作用。虽然肠杆菌科是唯一与中风结果相关的脂多糖产生细菌家族，但其他细菌也可能是产生脂多糖的来源，脂多糖可能是通过中风期间的脂多糖-TLR4全身炎症通路中发挥作用。未来的研究需要采用高分辨率技术来在较低的分类水平上表征与中风相关的生态失调病原体。虽然肠效应T细胞可能通过分泌IL-17而运输到软脑膜以增强脑卒中后的缺血性神经炎症，我们的研究显示在卒中后24小时内快速的肠道生态失调可能通过全身炎症促进脑梗死。炎症反应一直是急性缺血性脑卒中患者的治疗目标，尽管这些神经保护疗法大多数都失败了。我们的研究表明，肠道失调引起的病原体相关分子模式可能是炎症的一个关键来源，因此可能是卒中治疗神经保护的一个重要靶点。这三种抑制剂不仅为中风与肠道失调之间的相互影响的分子机制提供了证据，而且突出了潜在的转化价值。AG以抑制iNOS活性而闻名，是一种针对α-二羰基化合物的晚期糖基化终末产物抑制剂，用于糖尿病治疗。然而，在二期临床试验(ACTIONII)中，由于连续两年服用600 mg/天的副作用，该药物失败了。我们的结果表明，在相对较低的剂量和适用的时间窗下，AG在卒中急性期有潜在的应用价值。除AG外，SOD也是一个很有前途的候选者。我们的研究结果表明，这种特殊的热稳定SOD可以通过口服给药在胃肠道中发挥作用。SOD作为一种蛋白质酶，其维持肠道内SOD活性的具体机制及其代谢机制值得进一步研究。此外，本研究中观察到的脑卒中后肠道生态失调可能是由脑卒中事件以及相关代谢性疾病或入院后治疗引起的生态失调的混合。未来追踪卒中事件发生前低卒中风险人群的研究可能会将卒中事件引起的肠道失调从其他影响因素中分离出来。然而，我们的结果表明，目前对卒中患者的治疗未能恢复肠道生态失调，这是一个潜在的新的治疗靶点，将脑梗死恶化与卒中患者的不良预后联系起来。虽然我们首次提供了脑卒中后肠缺血的动态影像学证据，但本研究并未阐明这一关联的机制。我们推断中风可能通过交感神经系统引起肠缺血-再灌注，因为β-肾上腺素受体的阻断显著降低了肠通透性，去甲肾上腺素的释放改变了卒中后肠道微生物群的失调。除中风外，许多其他疾病可刺激交感神经系统，如炎症性肠病、心律失常和缺血性心脏病，它们可引起肠道缺血，导致硝酸盐的产生和肠杆菌过度生长。这一发现表明，我们研究中提到的治疗靶点（如硝酸盐产生、硝酸盐呼吸和肠杆菌过度生长），可以进一步扩大应用。进一步研究是否会发生类似的脑肠交互疾病以及肠道失调对这些疾病的贡献是必要的。
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