国人作品 | FRONT CELL DEV BIOL：中国阿尔茨海默病患者粪便菌群的结构与功能失调

2021-09-16 11:41

越来越多的证据表明，肠道生态失调在各种肠，脑疾病中起着至关重要的作用。

编译：微科盟yl，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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导读

越来越多的证据表明，肠道生态失调在各种肠-脑疾病中起着至关重要的作用，例如阿尔茨海默病（AD）。然而，中国患者肠道微生物群改变与认知评分和宿主免疫的相关性仍不清楚。在本研究中，通过对100名AD患者以及71个认知正常对照的样品16SrRNA测序，探讨粪便微生物的结构和功能改变，并分析其与临床特征的关联。数据表明，在AD患者的粪便微生物多样性显著降低并且组成发生改变。有趣的是，大量产丁酸菌属（如Faecalibacterium）的丰度显著下降，这与AD患者的MMSE，WAIS和Barthel评分等临床指标呈正相关。与此相反，双歧杆菌（Bifidobacterium）等产乳酸菌属数量显著增加，且与上述指标呈负相关。肠道菌群失调的这种转变，产丁酸菌到产乳酸菌，会导致宿主的免疫紊乱，可以作为非侵入性生物标记物来区分对照和AD患者。此外，AD患者微生物群中脂肪酸的生物合成和代谢等功能变化，会改变免疫调节代谢物。我们研究AD患者粪便微生物群的结构和功能失调，表明肠道细菌可能用于早期、非侵入性诊断AD，可以用于个性化治疗，并开发专为中国AD患者量身定制的益生菌。

论文ID

原名：Structural and Functional Dysbiosis of Fecal Microbiota in Chinese Patients With Alzheimer's Disease

译名：中国阿尔茨海默病患者粪便菌群的结构与功能失调

期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

IF：6.684

发表时间：2021.2.4

通讯作者：吴绍长

通讯作者单位：丽水市第二人民医院老年科

实验设计

结果

1 研究参与者特征

表1显示了中国AD患者以及年龄和性别匹配的认知正常的健康对照的特征。AD组和对照组在性别、体重指数、吸烟、饮酒及合并高血压、高胆固醇血症、糖尿病、冠心病等方面无统计学差异（p>0.05），但AD患者的MMSE、WAIS、Barthel评分明显低于健康对照组（p<0.05）。

表1. 参与者的特征。

2 AD患者粪便微生物群整体结构的改变

总共获得了5760,348个高质量的读数，平均每个样本33,686个读数，用于随后的微生物群落分析。有趣的是，包括Shannon和Simpson指数在内的alpha-多样性指数在对照组和AD患者之间存在显著差异，表明AD相关微生物群的细菌多样性降低(图1A,B)。丰富度指数observedOTUs，ACE以及Chao1，在AD组中也显著低于对照组（图1C-E）。在 beta 多样性上，尽管组内存在显著差异，但基于Jaccard、Bray-Curtis、未加权UniFrac和加权 UniFrac 的PCoA也将AD组和健康对照组区分开（Adonis检验：p<0.01；图1F-I）。因此，alpha和beta多样性分析表明，与对照组相比，AD相关粪便微生物群落的整体结构发生了显著变化。

图1. 中国AD患者粪便微生物群的改变以及细菌多样性和丰富性。（A）Shannon和（B）Simpson多样性指数以及（C）observed OTUs（D）ACE和（E）Chao1丰富度指数。用于评估AD患者和健康对照粪便微生物群的整体结构。（F）基于Jaccard（G）Bray-Curtis（H）未加权UniFrac和（I）加权UniFrac距离，对中国AD患者和健康对照组的粪便微生物群进行主坐标分析(PCoA)。

3 AD患者粪便微生物群落变化的研究

在不同的分类水平上对AD患者和对照组的粪便微生物群落组成进行了评估。利用RDP对序列进行了分类，共得到10门、76科、203属。门和属的分布表明了AD患者和对照组之间的差异。LEfSe分析可以清晰的显示出AD与对照组比较有显著性差异的关键分类（LDA>3,p<0.05,图2）。在门水平上，我们发现，AD患者Actinobacteria和Verrucomicrobia显著增多，而Firmicutes显著减少。在科水平上，Bifidobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae、Enterococcaceae以及Corynebacteriaceae在AD患者中显著增多，而Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Clostridiaceae显著减少。在属水平上，24个关键功能细菌属在AD组之间发生了显著变化，而AD患者中只有8个属（Faecalibacterium、Roseburia、Clostridium sensu stricto、Gemmiger、Dialister、Romboutsia、Coprococcus以及Butyricicoccus）显著减少。有趣的是，传统上有益的属，如Bifidobacterium和Akkermansia，在AD患者中急剧增加。

此外，微生物动态相互作用决定了粪便微生物群落的结构。通过基于相关性的微生物相互作用网络发现，与AD患者相比，健康对照组存在更复杂的相互作用网络（图3），且健康对照组细菌间的正相关和负相关更明显。我们的数据表明AD患者粪便微生物区系存在结构性失调。

图2. 中国AD患者与健康对照之间的差异细菌分类群。（A）LEfSe确定了中国AD患者与健康对照之间丰富度差异最大的分类群，LDA>3。（B）门、科、属水平上较丰富的细菌分类群相对丰度的比较。

图3. 中国AD患者和健康对照粪便微生物群系的相关性。AD患者和健康对照粪便微生物群丰富度的相关网络。用SPARCC数据算法的稀疏相关性计算相关系数；Cytoscape 3.4.0用于构建网络。红色和蓝线分别表示正相关和负相关；AD患者的关联网络更简单。

4 基于粪便微生物群落的特征区分健康对照和AD患者

我们与AD相关的粪便微生物群中确定了几个不同的分类群。然后，评估了六个属（Bifidobacterium、Faecalibacterium、Roseburia、Akkermansia、Lactobacillus以及Enterococcus）作为生物标志物的价值。这些属的差异特征显示在图4A-F中，显示了显著的个体间差异。首先只使用一种差异细菌作为预测因子，生成接收工作特性曲线下的面积，得到曲线下面积（AUC），范围从0.304到0.797（图4G）。图4显示Faecalibacterium是健康对照的最佳判别因子（AUC：0.797），最佳截断值为3.2149%。此外，多变量逐步Logistic回归分析被应用于AD相关属，以确定最能将对照与AD患者区分开来的分类群。我们发现，使用所有六个丰富的属显著提高了预测性能（AUC：0.836）。我们还评估了Faecalibacterium/Bifidobacterium（F/B在2876.2660至0.0001之间，图4H）的预测价值。我们发现F/B比值有助于区分健康对照组和AD患者，其AUC值为0.788。F/B比值的最佳截断值为1。因此，这些关键的差异属可以作为区分健康对照和AD患者的潜在生物标志物。

图4. 不同的属作为AD诊断标志物。差异属的相对丰富和最佳截断值，（A）Bifidobacterium，（B）Faecalibacterium，（C）Roseburia，（D）Akkermansia，（E）Lactobacillus，（F）Enterococcus。（G）单独或组合的差异属的ROC曲线，（H）Faecalibacterium/Bifidobacterium的AUC。

5 阿尔茨海默病中的微生物功能失调

为了确定AD患者和对照组之间粪便微生物群落的代谢和功能变化，使用PiCRUSt分析微生物群落的潜在功能。通过比较在第二级水平上的64条KEGG通路，确定了AD患者和对照组之间存在明显差异的7个KEGG通路。我们发现AD患者的碳水化合物代谢、外源物质的生物降解和代谢、转运和分解代谢显著增加，而转录、免疫系统、环境适应和细胞运动性显著降低（p<0.05；图5）。第三级水平中的15条通路，包括脂肪酸和硫辛酸的代谢，以及叶酸的生物合成，都显著增加；而其他15条通路，包括细菌的趋化性和脂肪酸的生物合成，在AD相关的微生物群落中显著减少。因此，粪便微生物群落的功能失调可能参与了AD的发生发展。

图5. 基于PiCRUSt检测中国AD患者和健康对照粪便微生物。基于双面Welch’s t检验，评估不同的细菌功能。通过百分比比较不同组KEGG功能类别（级别2和3）。

6 不同类群与临床指标和宿主免疫的相关性

研究发现，AD患者的临床指标MMSE、WAIS和Barthel评分显著降低（p<0.01）。利用Bio-Plex人细胞因子27-Plex检测平板方法，我们观察到抗炎细胞因子如IFN-γ显著降低，促炎细胞因子如TNF-α显著升高，并且IL-8、MCP-1、MIP-1a等趋化因子显著降低。为了确定AD患者的不同属与临床指标和细胞因子之间的关联，我们使用Spearman进行了相关性分析（图6）。值得注意的是，产乳酸的Bifidobacterium和丙酸的产生菌如Akkermansia与临床指标（如MMSE、WAIS和Barthel评分）呈显著负相关，而产丁酸的菌属（如Faecalibacterium、Roseburia、Gemmiger、Coprococcus和Butyricicoccus）与临床指标呈正相关（p<0.05），而产丁酸的菌属与临床指标呈显著正相关（p<0.05）。Bifidobacterium与IL-8呈负相关，Akkermansia与IFN-γ呈负相关，但与IP-10呈正相关。Enterococcus、Corynebacterium与促炎细胞因子TNF-α呈正相关，Faecalibacterium、Roseburia、Gemmiger以及Coprococcus与TNF-α和IP-10呈负相关（p<0.05）。综上所述，AD患者粪便微生物组中富含乳酸的菌群和减少的丁酸菌群在AD的进展中起着不同的作用，并对宿主的免疫应答起着不同的调节作用。粪便微生物图谱的改变以及相关的宿主反应可能是阿尔茨海默病的关键病理生理机制。

图6. 粪便微生物群与促炎、抗炎细胞因子和趋化因子以及临床指标的相关性。热图显示了AD患者中34个属与临床指标和宿主免疫相关的部分Spearman相关系数。Spearman的秩相关（R）和概率（p）用于评估统计学重要性，*p<0.05。

讨论

肠道微生物群在促进人类健康方面起着至关重要的作用，因此常常被称为“被遗忘的器官”。越来越多的证据表明，肠道微生物群是维持肠道内环境稳定的关键因素。肠道微生物群既可以导致胃肠道疾病，也能对其他器官产生影响，如中枢神经系统（CNS）。探索肠道微生物对神经系统退行性疾病的作用和机制是一个新兴的研究领域。最近，有研究表明，肠道微生物群落的组成和功能的变化显著影响神经元功能，从而影响宿主的行为。微生物群的肠-脑轴被证实调节多种神经化学途径。微生物-肠-脑轴信号已经揭开了精神病学的新纪元，有望为精神疾病的诊断和治疗提供新的靶点，并破译其发病机制。

衰老与先天免疫系统和获得性免疫系统的过度刺激有关，会导致轻度慢性炎症。增加肠道通透性和细菌移位。作为一种主要与年龄相关的神经退行性疾病，AD的发病与肠道微生物群落的改变密切相关。此前“AD微生物群”研究大多是在小范围的患者中进行的，而这项研究中，100名中国AD患者和71名年龄和性别匹配的正常对照者参加了AD微生物群分析。总体而言，更深的测序和更高的覆盖率使我们能够在AD相关的粪便微生物群落中识别出低丰度的类群。结果显示，中国AD患者粪便微生物群落结构发生明显变化，α多样性指数降低，β多样性指数改变。与以往对AD患者的临床研究不同，我们的研究还表明，AD患者的Shannon指数显著降低，observedOTUs、ACE和Chao1等丰富度指数也显著降低。基于Bray–Curtis的PCoA也显示出AD患者和对照组的组成差异。综上所述，α多样性和β多样性指数都为AD患者的AD微生物群结构失调提供了强有力的证据。

我们观察到的结构失调表明AD粪便微生物群的组成有显著变化。AD患者在门，科和属的水平的细菌分类与健康对照中有显著差异。在门水平上我们观察到Actinobacteria和Verrucomicrobia在AD中显著增多，Firmicutes显著降低，而Proteobacteria和Bacteroidetes丰富度没有显著变化，这与先前的研究不一致。Firmicutes/Bacteroidetes作为衰老指标，在AD相关的微生物群中也没有显著变化。然而，研究发现Firmicutes/Actinobacteria的比例显著下降（p<0.05），这可能揭示了AD患者肠道菌群的失调。在科水平上，Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Clostridiaceae 1在AD患者中减少，而Bifidobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Coriobacteriaceae、Erysipelotrichaceae、Enterococcaceae则显著增加。Ruminococcaceae和Lachnospiraceae可以产生不同类型的短链脂肪酸（SCFAs）。由于对维持健康的有益效果，丁酸盐在研究中得到了特别关注。丁酸盐可以影响胃肠生理，肝脏代谢的外周免疫，以及血脑屏障的完整性，间接促进大脑的功能。此外，它可以促进并且维持小胶质细胞的成熟。然而，产乳酸的菌如Bifidobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Coriobacteriaceae、Enterococcaceae在AD患者中增加。有研究发现Enterobacteriaceae菌科可以帮助区分AD患者和健康对照（AUC：0.698）。粪便细菌在门和科水平上的改变代表了与阿尔茨海默病相关的粪便微生物群的生物失调，但较高的分类水平粪便细菌不适合AD患者的非侵入诊断。

与科水平的变化一致，有些属例如Bifidobacterium、Akkermansia、Faecalibacterium、Collinsella以及Roseburia的含量在AD相关的粪便微生物群变化显著。传统益生细菌，例如Bifidobacterium、Akkermansia在AD患者中显著增加，而Faecalibacterium以及Roseburia则显著下降。ROC曲线表明，这些差异属可用作生物标志物，区分患病组和对照，这为AD的非侵入性诊断提供了新的靶标。Bifidobacterium对人类有益，可以产生乳糖，已被用作乳制品中的食品补充剂。有研究发现口服双歧杆菌A1能够通过抑制炎症和免疫反应基因表达来改善认知功能，维持老年人的寿命。但与以往的动物和临床研究的研究不同，双歧杆菌是AD患者粪便丰富度最高的属，提示双歧杆菌属在AD的发生发展中可能起重要作用。不同种的双歧杆菌可能有不同的作用，这或许可以解释为什么双歧杆菌一方面与健康和微生物群落多样性有关，另一方面却在患病人群中增多。因此，我们需要重新审视双歧杆菌在维持认知功能和治疗痴呆症方面的潜力。我们的数据还显示双歧杆菌与MMSE、WAIS、Barthel和IL-8呈显著负相关，这也表明双歧杆菌在我们的临床研究中不是一个有益的属。Akkermansia是一种专门降解粘蛋白的菌，可以利用粘蛋白衍生的糖，如岩藻糖，通过丙二醇途径生产丙酸。先前的研究表明， Akkermansia muciniphila 与预防肥胖、促进伤口愈合、增强抗肿瘤反应和动态平衡状态下诱导的肠道适应性免疫反应有关。Akkermansia、两株Clostridium、一株Eubacterium、一株Bifidobacterium以及菊粉的组合物最近已被用作治疗2型糖尿病。Akkermansia muciniphila的发现为肠道共生菌在下一代治疗产品中的使用开辟了新的途径，它们可以被用来靶向动态微生物群落。然而，我们的数据表明 Akkermansia 是与AD相关的粪便微生物群落中最丰富的属之一。与Bifidobacterium相似，Akkermansia与AD的临床指标（MMSE、WAIS、Barthel）和抗炎细胞因子（如IFN-γ）呈负相关。根据我们目前的观察，Akkermansia并不总是一种潜在的有益细菌，在老年人AD发展中的，它可能会损害肠-脑轴。Clostridium IV、Desulfovibrio以及Corynebacterium等在AD患者中丰度较高的属被认为参与了AD以及其他CNS疾病的发生。Clostridium IV是小鼠的2型糖尿病和肥胖以及AD发生的危险因素，与MMSE呈负相关。Sawin等人的研究还表明，Desulfovibrio可以诱导SCFAs水平降低，从而导致中枢神经系统疾病的病理状态。前人的研究还发现，抑郁症和自闭症患者中Corynebacterium的数量减少，而Corynebacterium与促炎性TNF-α呈正相关。与他们的研究不同，我们发现Collinsella、Enterococcus、Olsenella、Eubacterium、Christensenella、Anaerotruncus和Halomonas等属也在AD相关的粪便微生物群落富集。Collinsella作为放线菌门丰富度最高的属，与MMSE、WAIS、Barthel呈负相关，发现在AD患者中显著增加，但在复发-缓解型多发性硬化症患者中降低。Enterococcus在原代大鼠皮质神经元中产生早期AD样神经纤维表位，可作为AD病因学中的有害细菌。与我们的发现类似，与健康对照组相比，Christensenella数量在帕金森氏病患者中增加。这些丰富的AD相关粪便菌群，主要是乳酸和丙酸的产生菌，可能在AD的发病和发展中起着关键作用。

然而，在与AD相关的粪便微生物群落中，观察到了Faecalibacterium、Roseburia、Clostridiumsensu stricto、Gemmiger、Dialister、Romboutsia、Coprococcus以及Butyricicoccus的水平降低。特别的是，丁酸产生菌如Faecalibacterium、Roseburia、Coprococcus与年龄呈负相关。我们的研究发现，这些细菌与阿尔茨海默病临床指标（MMSE、WAIS、Barthel）呈正相关，与炎性细胞因子（TNF-α）、趋化因子（IP-10）呈负相关。Faecalibacterium是Firmicutes门的主要成员，是健康肠道最重要的细菌指示物之一，可以调节肠道上皮的炎症水平。有益的Faecalibacterium可以减少多种肠道疾病，而在虚弱和老年患者中Faecalibacterium相对丰度降低。与这些发现一致，老年帕金森氏病患者Faecalibacterium比例的下降而Bifidobacterium增加。所有这些变化可能会促进肠道环境的炎症，导致老年人出现慢性低度炎症。以前的研究发现，由于能够产生丁酸盐和诱导耐受细胞因子谱，Faecalibacterium具有抗炎特性，可以帮助减轻老年AD患者的变化。Liu等人发现高原藏式发酵奶可以增加微生物多样性，并能提高AD小鼠模型中Bacteroides以及Faecalibacterium的水平，这与AD小鼠认知能力的改善有关。通过临床对比分析以及动物实验研究，证实了Faecalibacterium对心理健康的有益作用，这引起了人们将其作为新一代益生菌或心理益生菌的兴趣。Roseburia是一种产生SCFA（尤其是丁酸盐）的共生菌，它会影响免疫维持、结肠动力和抗炎特性。在许多肠道紊乱（包括2型糖尿病、肥胖症、肠易激综合征、神经系统疾病和过敏）中，产丁酸菌 Roseburia 减少，这表明这些细菌作为肠道健康指标的潜力。与我们的数据一致，Keshavarzian等人证实了Roseburia的抗炎特性，并发现对照组粪便中的Roseburia水平比帕金森氏症患者的粪便中含量更高。Neyrinck等人发现Roseburia的数量与宿主脂质代谢和肥胖的指标呈负相关。Roseburia保护神经系统免受疾病侵袭，并通过其代谢物丁酸调节肠-脑轴减少神经炎症。 Coprococcus 在肠道中数量较少，可以将果糖转化为丁酸也将乳酸生成丙酸。Faecalibacterium与Coprococcus与更高的生活质量（QoL）指标相关，与QoL评分呈正相关。我们之前的研究表明，即使在校正了抗抑郁药的混淆作用后，抑郁症患者也几乎没有 Coprococcus 。Parashar和Udayabanu还发现，Coprococcus在帕金森氏症患者粪便中减少。Nagpal等人发现，与对照组相比，轻度认知障碍参与者的Coprococcus水平增加。相反，我们的研究表明，Coprococcus与AD的临床指标呈正相关。Butyricicoccus是一种产丁酸的梭状芽胞杆菌，在AD患者的粪便中减少。 Butyricicoccus 与临床指标MMSE、WAIS、Barthel、抗炎细胞因子IFN-γ呈正相关，与促炎细胞因子TNF-α呈负相关。Devriese等人还发现，溃疡性结肠炎患者粘膜相关Butyricicoccus活性降低与claudin-1的异常表达相关。Zhang等人也发现，与对照组相比，AD小鼠模型中Butyricicoccus的丰度明显减少。Shen等人观察到通过使用水飞蓟素来调节肠道微生物，会增加Butyricicoccus，可能会防止AD。在AD患者中发现了 Clostridium Sensu Stictio 的下降。Clostridium Sensu Stictio与HDL呈正相关，与VLDL负相关，与心血管疾病和中风的风险降低有。Gemmiger也是一种短链脂肪酸产生菌属，与中风后认知障碍患者的蒙特利尔认知评估得分呈正相关。我们的研究还发现，Gemmiger丰度降低与MMSE、WAIS、Barthel呈正相关，并与炎症细胞因子呈负相关。与我们的研究一致，Vogt等人发现，Dialister在AD患者中丰度较低，并与脑脊液中的AD生物标志物例如Aβ42/Aβ40，p-tau和p-tau/Aβ42表现出显著的相关性。因此，不论这些微生物是在AD患者粪便中降低还是富集，都有助于短链脂肪酸的转变，可能参与了AD的发生和发展。

内源性SCFAs水平受到许多因素的影响，其中肠道细菌代谢是最重要的。AD患者的微生物群紊乱会影响人体SCFAs的平衡，而SCFAs的异常水平可能会对人类健康产生负面影响。Zhao等人研究表明，SCFAs是饮食、肠道微生物群和健康的桥梁。我们观察到若干代谢途径，例如碳水化合物代谢，外源化学物生物降解，以及免疫系统，在AD相关的粪便微生物中发生显著变化。AD的微生物特性发生了变化，例如AD患者的微生物谱由产丁酸菌（Faecalibacterium）转变为产乳酸菌（Bifidobacterium）。然而，AD相关变化的具体作用及其功能还有待进一步研究。

我们的研究在某些方面是有限的。首先，它使用了16S rRNA扩增子而不是宏基因组测序，这限制了我们在物种水平上发现与AD相关的特定细菌。其次，我们的研究只横向调查了健康对照和确认的AD参与者。为了解释微生物群落与AD之间的动态相互作用，纵向病例对照研究应包括AD的不同阶段，如临床前阶段和轻度认知损害阶段，这些阶段标志着从健康到AD的转变。第三，与AD相关的粪便微生物特征和相应的代谢物以及非侵入性诊断模式仍需要更大的临床研究样本量来验证。第四，应培养AD相关的细菌，通过动物实验确定这些细菌和AD发病机制之间的关系。

总之，我们发现，与健康的老年人受试者相比，AD患者中粪便微生物的细菌组成发生改变并且多样性减少。AD患者的粪便微生物的结构紊乱表征在丁酸盐产生菌减少，例如Faecalibacterium，并增加乳酸产生菌，例如Bifidobacterium，两者均与AD患者的促炎、抗炎细胞因子以及临床指标显著相关。这些关键功能细菌的这些变化，例如Faecalibacterium和Bifidobacterium，可用作非侵入性生物标志物，以区分健康的老年人和AD患者。通过个性化饮食或益生菌干预使肠道微生物从产乳酸菌转化为产丁酸菌可能对早期AD患者有益。此外，AD相关的粪便微生物群功能紊乱还表明，粪便微生物群改变会导致患者的功能变化和代谢活动改变，这可能在AD的发病机制和发展中发挥重要作用。因此，我们使用大型和确认的AD队列对粪便微生物群进行调查，揭示疾病发病机制，这提供了通过调节肠道微生物组来管理神经退行性疾病的新途径。