综述 | Genome Medicine：全球基因组病原体监测为疫苗策略提供依据：肺炎球菌基因组学十年探索

2021-09-15 11:17

基因组技术有潜力为疾病病例中分离病原体的固有挑战提供解决方案。

导读

疫苗是预防传染病的有力药物，但通常旨在预防某些最可能传播和引起疾病的菌株。大多数疫苗无法成功根除病原体，因此可能会出现疫苗逃避株。与大多数进化过程一样，能够捕获整个基因组的所有变异为我们提供了监视和了解疫苗逃逸过程的最佳机会。基因组学已被广泛用作病原体监测的最佳方法，具有早期和精确识别高风险菌株的潜力。如果有足够的纵向数据，基因组学还可以预测这种菌株的出现，从而可以立即或提前进行干预。在本文中，我们以全球肺炎球菌测序（GPS）项目的经验为例，考虑了病原体基因组监测的优势和挑战。我们着重介绍了基因组数据的多面性以及基于基因组的工具的最新进展，这些工具可提取与疫苗策略和治疗方案相关的有用信息。最后，我们总结了对基因组病原体监测的未来展望。

论文ID

原名：Global genomic pathogen surveillance to inform vaccine strategies: a decade-long expedition in pneumococcal genomics

译名：全球基因组病原体监测为疫苗策略提供依据：肺炎球菌基因组学十年探索

期刊：Genome Medicine

IF：11.117

发表时间：2021.05.17

通讯作者：Stephen D. Bentley

通讯作者单位：英国欣克斯顿惠康基因组校区惠康桑格研究所

综述目录

1 背景

2 肺炎球菌疾病的生物学

2.1 定殖是产生疾病的先决条件

2.2 肺炎球菌荚膜

3 疫苗逃逸机制

3.1 重组和肺炎球菌的进化

3.2 通过荚膜转变和菌株替代逃逸疫苗

4 为全球疫苗策略提供依据的基因监测

4.1 全球肺炎球菌测序项目的动机和范围

4.2 数据库和数据分享

4.3 数据分析

4.4 数据可视化和解释

5 结论和未来方向

5.1 填补了疾病负担高的国家的重要数据空白

5.2 利用基因组监测系统对抗多种病原体

5.3 加强疾病负担高的LMICs能力建设

5.4 优化疫苗配方

5.5 基因组学在临床微生物实验室的潜在应用

主要内容

1 背景

肺炎双球菌是一种常见的条件致病菌，可引起多种疾病。感染范围从中耳炎到肺炎、败血症和脑膜炎等严重的侵袭性肺炎链球菌病（ IPD），特别是刚出生的婴儿和老年人容易感染肺炎双球菌。在2015年，肺炎双球菌感染导致了890万死亡病例，其中5岁以下的幼儿死亡病例达317 000例。中低收入国家的疾病负担最重。肺炎球菌疾病可以通过接种疫苗预防，使用抗生素进行治疗。在21世纪初，肺炎双球菌联合疫苗（ PCV）首先在高收入国家推出，并通过全球疫苗和免疫联盟组织逐渐应用在中低收入国家。与之前的肺炎双球菌多糖疫苗（PPV）不同的是，PCV可以在婴幼儿期产生免疫作用，并通过诱导T细胞介导的免疫应答长期保护机体。PCV的广泛应用有效地减少了全球范围内肺炎双球菌病例。与2000年相比，2005年肺炎双球菌所导致的1-59个月婴幼儿的死亡数目减少了51%。此外，PCV还通过直接减少疫苗靶向的高度耐药菌株以及通过减少通常需要使用抗生素的发热性疾病产生的间接影响，对降低抗生素耐药性产生了积极影响。

PCV在宿主体内触发免疫反应，攻击围绕在肺炎双球菌细胞外部的多糖外壳。为了躲避免疫清除，多糖外壳不断分化，产生了100多种目前已经识别的构型或血清型。目前，PCV以13种血清型为目标，这些血清型是婴儿发病的主要原因，特别是那些与抗菌素耐药性有关的血清型。疫苗对血清型的不完全覆盖使得肺炎双球菌不断进化并逃避疫苗的攻击。有几份报告显示，没有相应疫苗的血清型导致的疾病增加。针对24种血清型的高价疫苗正在开发中，应有助于减少13价PCV（PCV13）不覆盖的血清型所导致的疾病。此外，需要进一步监测，以便为未来的疫苗策略提供依据。

自2011年，全球肺炎球菌测序（GPS）项目开始提供基因组监测。在本文中，我们描述了肺炎球菌疾病的生物学，采取基因组学的方法和经验，探究了逃逸疫苗的机制和跟踪逃逸的疫苗菌株，基于基因组特征的进展和基因组病原体监测的未来展望。

2 肺炎球菌疾病的生物学

2.1 定殖是产生疾病的先决条件

了解病原体生物学和疾病的形成机制对于指导疫苗策略非常重要。肺炎双球菌是人体鼻咽中的共生殖民者，其中宿主会对生态位进行定期清除，鼻咽中也存在微生物群间的竞争，人与人之间也存在互相传递的可能。因此，人类鼻咽生态位内的变异是主要的肺炎球菌基因组进化的驱动因素。同时，任何系统性抗菌药物的使用，不论其目标病原体是哪种，都是选择的主要驱动因素。侵袭性疾病是肺炎双球菌的进化终点，因为它会导致抗生素清除、宿主免疫清除或宿主死亡。

肺炎双球菌的定殖率随地理位置和年龄的改变而改变。高收入国家中儿童的定殖率通常低于低收入国家。宿主免疫可以解释年龄相关的变异，婴幼儿中的变异最高，随着免疫系统的成熟逐渐降低。人们普遍认为，IPD的首要条件是致病株在鼻咽部位的无症状定殖。尽管会受到其他人体免疫系统疾病（例如HIV）的影响，发病率趋势主要与携带者的年龄分布相关。在南非，大于25岁成年人的IPD发病率高于10-24岁个体的发病率，这可以归因于大于25岁成年人有更高的HIV感染风险。感染HIV个体的IPD发病率要比未感染HIV个体的发病率高出43倍。有趣的是，一些血清型与不同的年龄组和HIV状态相关。

图1. 2011年南非各年龄组侵袭性肺炎链球菌病发病率（红色）和携带率（蓝色）。

2.2 肺炎球菌荚膜

肺炎球菌荚膜是一层覆盖在细菌细胞上的交联多糖。该荚膜的一个重要功能是保护肺炎球菌细胞不被吞噬；无荚膜的肺炎双球菌通常无法引起侵袭性疾病，但可能导致非侵袭性疾病。荚膜是将不同个体分类成不同血清型的理论依据。抗血清对“类型”分类的替代已经有80多年的历史，使得更好地鉴别不同血清型和相关疾病的关系。通过对疾病中和无症状携带的肺炎双球菌菌株进行血清型分离，可以观察到不同血清型菌株在导致侵袭性疾病方面上的实质性差异。这种导致侵袭性疾病的差异尚未完全了解，但可能与荚膜的基本生化特征有关；具有高治病潜力的血清型往往具有较薄的荚膜，这增强了与上皮细胞的附着和直接相互作用，进而缩短了携带周期。

荚膜由一个10-30 kb的基因簇编码，被称为用于荚膜多糖合成的cps。不同血清型荚膜编码基因的组成和序列是不同的。分析这些基因的差异性为利用PCR基于DNA的血清学分类方法，DNA微阵列和全基因组测序（WGS）的发展铺平了道路。这些方法与基于抗血清反应的传统实验方法具有高度一致性。基因分型方法提供了一些优点，包括在阴性临床样本培养中的应用，多重共定殖血清型的检测和可能预示新血清型的荚膜编码基因中新的遗传变异。

荚膜多糖诱发血清型特异性免疫应答，自1947年首次临床使用两种不同的六价肺炎球菌多糖疫苗以来，荚膜多糖已成为肺炎球菌疫苗的研究基础。1977年疫苗发展到14价，1983年发展到23价，对与更广泛疾病相关的血清型提供了保护。不幸的是，肺炎球菌多糖疫苗在婴儿中产生了较差的免疫原性，因为抗多糖抗体应答与特异的脾脏B细胞亚群相关，而脾脏B细胞亚群在两岁以下的婴幼儿中没有发育完全。此外，PPV只引起不依赖T细胞的免疫反应，保护性抗体的作用时间有限。考虑到疾病负担主要集中在5岁前，上述PPV限制促使PCV的开发，这将更好地保护婴儿。PCV是由荚膜多糖与载体蛋白共价连接而成，以提高抗体应答并诱导长期保护。PCV在婴儿和一些对PPV没有反应的高危患者中具有免疫原性。自2000年以来，PCV在全球的应用与儿童肺炎球菌疾病负担的降低以及对全球成人的间接保护作用相关。图2总结了已许可的PCV，正在开发的PCV，以及23价的PPV。其中，最近获得世卫组织资格预审的低成本10价疫苗为中低收入国家的儿童常规免疫提供了很大可能性。尽管针对24种血清型的高价PCV正在开发中，但在过去20年里，肺炎球菌群体作为一个整体一直是PCV的移动目标，而肺炎球菌血清型的覆盖不全仍旧是个挑战。

图2. 目前可获得和正在开发的肺炎球菌疫苗血清型配方。每种疫苗的血清型是有颜色的。与PCV7血清型相比，其他配方中多余的血清型颜色为蓝色（PCV10）、黄色（PNEUMOSIL）、粉红色（PCV13）、绿色（PCV15）、橙色（PCV20）、紫色（PCV24）和散点模式（PPV23）。¹SII，印度血清研究所；²PPV23是一种肺炎球菌多糖疫苗，对2岁以下儿童不具有免疫原性。

3 疫苗逃逸机制

3.1 重组和肺炎球菌的进化

肺炎球菌天生就能从周围环境中摄取裸露的 DNA。这一特征最早由Frederick Griffith在1928年提出，后来被Avery、MacLeod和McCarty用来证明“转化原则”是纯DNA。在鼻咽生态位，细菌细胞通过正常转换而裂解，产生可供摄取的裸露DNA，为不同肺炎球菌菌株的基因变异提供了来源。输入的DNA可以重组到自身的基因组中，从而为肺炎球菌提供快速进化适应性的强大机制。DNA多基因片段重组的能力使得从物种外部导入基因“岛”，并在物种内部重新分配基因，从而产生不同的肺炎球菌谱系或菌株。重组使菌株能够全部或部分取代荚膜编码基因，进而改变血清型；这通常被称为荚膜转变。从疫苗所针对的血清型（即疫苗类型，VT）到疫苗所不针对的血清型（即非疫苗类型，NVT）的任何转变都可能导致对疫苗的逃逸。

3.2 通过荚膜转变和菌株替代逃逸疫苗

在对全球流行的PMEN1菌株的基因组分析中，已经发现了多个荚膜转变事件。对在时间和地理上广泛收集的基因进行祖先系统发育重建和重组分析，可以推断肺炎双球菌株可能最早在20世纪70年代出现在西欧，并在随后的几十年在全球传播。从23F原始血清型中检测到10例荚膜转变现象，其中一些属于NVTs。一个值得注意的转变是血清型19A，在2000年引入PCV7后在美国被证实是一种引起NVTs疾病的新病因。祖先重建显示，23F到19A的荚膜转变在引入PCV7的几年前就已经发生了，这表明疫苗对其覆盖范围之外的荚膜转变产生了正向选择。

在任何特定的地理区域传播的肺炎球菌形成了一个多菌株、多血清型的群体，其中6-13种主要菌株占据了总量的60%，剩下的是少数菌株。PCV从人群中清除VTs的有效性各不相同。PCV的推广对总体肺炎球菌携带率影响不大，这表明种群NVTs部分能够扩展，填补VTs空出的生态位。经过一段时间的干扰后，新出现的疫苗接种后群体似乎是由荚膜开关变异体和已由NVTs控制的菌株的组合扩展而形成的。这两种逃逸疫苗机制的相对贡献因地区而异，正如抗菌素选择压力一样，导致PCV后出现的NVTs发生变化。一般而言，在PCV13引入后，具有高侵袭性疾病潜力的NVTs（如血清型8、12F、24F）在IPD中更常见。

4 为全球疫苗策略提供依据的基因监测

4.1 全球肺炎球菌测序项目的动机和范围

PCV7目标定位于在美国最常引起侵袭性疾病的血清型。在小于五岁的儿童中，疫苗的覆盖率是83%，在大于7岁的所有年龄组中，疫苗将IPD的发生率降低了45%。通过一个创新的融资机制，即2009年由全球疫苗、免疫联盟以及世界银行和其他捐助方共同发起的肺炎球菌预先市场承诺（AMC），提高了PCV在中低收入国家的负担能力。这一机制加速了PCV在全球数百万易受侵害儿童中的推广。然而，肺炎球菌血清型监测显示，PCV7在许多高疾病负担的中低收入国家的覆盖率要低得多。鉴于此，在2011年，比尔和梅林达•盖茨基金会（与埃默里大学，美国疾病控制和预防中心以及威康桑格研究所合作）发起了GPS项目，应用基因组学了解肺炎球菌的进化并将疫苗引入中低收入国家。当时，GPS是一个开创性的项目，没有什么先例可遵循，但10年过去了，相关人员吸取了教训，规划了新的方向。该项目在三个非洲国家（冈比亚、马拉维和南非）率先启动，并希望增加合作伙伴，以实现广泛的地理覆盖，优先考虑符合GAVI支持的低收入国家推广PCV。到2021年3月，GPS项目对来自57个国家的26 100个肺炎球菌基因组进行了测序。

最初，GPS项目优先对5岁以下儿童的IPD分离物进行测序，收集PCV引入前和引入后的样本。创始成员来自资源充足的机构，每个机构在肺炎球菌监测方面都有良好的记录，因此很容易满足首选抽样标准。但其他许多国家的情况并非如此，因此有必要做出一些妥协，比如将无症状携带者而非IPD的样本纳入其中是必要的。允许这样的妥协强调了仔细管理样本元数据的重要性。必须为每个测序的样本收集可靠的元数据，以便尽可能多的样本支持具体的分析问题；例如，如果样本没有关于它们是来自健康携带者还是来自IPD的信息，它们就不能用于与毒性相关的遗传学分析。为了最大限度地利用GPS数据库，除非事先提交元数据，否则不会对样本进行测序，从而确保所有测序工作产生的基因组数据具有更高的分析价值。GPS样本的最低元数据要求简单地设定"日期"和"地理位置"，通常还记录了一系列临床和微生物数据用于区分（表1）。平均而言，分离株有37个与基因组分析输出相关的元数据字段（如硅血清型、基因型和抗菌素耐药性决定因素）。因此，GPS系统为肺炎球菌疾病预防提供了丰富的数据驱动和假设驱动的子研究。

表1. 全球肺炎球菌测序（GPS）项目元数据示例。

^a对青霉素、阿莫西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛、美罗培南、氯霉素、复方新诺明、红霉素、克林霉素、利奈唑胺、左氧氟沙星、环丙沙星、达福普汀、四环素、利福平、万古霉素等17种抗菌素的敏感性分析。

4.2 数据库和数据分享

数据库是基因组监测系统的重要组成部分。它是一个数据中心，在这里多个来源的数据集合被组织起来供用户查看、搜索、下载和共享。在一个涉及伙伴网络的监测系统中，数据库的设计也应便于个人获取自己的数据和分享数据（图3）。为了最大化地使用，开放数据、开放软件和开放获取出版物是必不可少的，并已成为许多资助方的严格要求。虽然开放数据的可利用性持续增加，但以公平和平等的方式分享利用这些基因资源所带来的益处，对于维持数据生产的良性循环是必不可少的。《名古屋议定书》的启动为基因资源提供者和使用者提供了法律确定性和透明的利益分享框架。

图3. 全球肺炎球菌测序（GPS）数据库的输入和输出。输入用浅橙色突出显示，而输出用向下灰色箭头符号显示。

4.3 数据分析

将基因组监测系统中的大量数据转化为有意义的信息来指导公共卫生决策需要准确的数据分析和解释。从肺炎球菌基因组中，我们可以快速可靠地提取公共卫生相关信息，包括血清型、基因型和抗菌药物耐药性概况。这种工具正在被调整为在网站上作为应用程序运行，因此不需要正式的生物信息学专业知识。例如，病原观察为多种微生物病原体提供了基因组数据的电子检测和表征。通过简单地将序列数据文件“拖放”到浏览器窗口中，用户可以快速获得公共卫生相关信息。

基因组数据在回答关键问题方面也很有力，比如疫苗逃避菌株的遗传和地理来源。通过计算替代率，我们可以推断何时何地出现肺炎球菌菌株和/或抗菌素产生耐药性的遗传变异。该项目共对26 100个基因组进行了测序。这些数据允许系统地定义621种循环菌株（GPSCs），并检测所有基因组变异，包括鉴定包含多达15种不同血清型的菌株。数据集主要由35个菌株（>各100个基因组）组成，占数据集的62%；其中一些在全球传播并与多药耐药相关。GPSC菌株定义为了解PCV推出后肺炎球菌种群变化奠定了基础。在一项GPS研究中，在PCV发生前后从6个国家的基于实验室的监测项中收集到的约3000株肺炎球菌分离株，如预期的那样，VTs被NVTs取代。使用GPSC，我们观察到NVTs的扩展主要是由全球传播毒株中血清型平衡的改变介导的，由于只表达非疫苗血清型的毒株增加，其影响较小。然而，这一观察结果因国家而异，流行的血清型和PCV后的GPSCs也是如此。这种差异可以部分解释为疫苗推出前肺炎球菌群的差异以及各国之间抗菌药物选择压力的差异。

4.4 数据可视化和解释

分析数据的可视化是解释大型复杂数据集的关键步骤，这些数据集通常来自基因组监测系统。在系统发育树上可视化分离株之间的遗传关系，以及相关的元数据，是一种强有力的方法。常见可视化软件包括Microreact和NextStrain。GPS项目使用Microreact使全面分析的数据集易于获取，包括项目网络资源中特定国家和特定菌株研究。GPS还使用Phandango软件来可视化特定于基因内容变化的数据，如突变、重组和泛基因组变化。分析输出的解释需要一定程度的生物信息学和病原体研究的知识。在大多数微生物实验室或LMICs的监测网络中，生物信息学是一门相对较新的专业知识，需要培训和实践经验。与JUNO一起，GPS正在开发一个学习组合，以满足 GPS 和JUNO项目合作伙伴之间的不同需求。

5 结论和未来方向

GPS 项目通过识别新出现的血清型和逃逸疫苗菌株，清楚地证明了基因组学在过去10年病原体监测中的附加价值，从而为未来的疫苗战略提供了基础。该项目还强调了数据差距以及建立一个更可持续的监测系统以优化疾病预防战略的必要性。

5.1 填补了疾病负担高的国家的重要数据空白

在2018年一项关于肺炎球菌疾病全球负担的研究中，Wahl等人表明，2015年所有肺炎球菌死亡中大约有一半发生在四个国家：印度、尼日利亚、刚果和巴基斯坦。然而，当这项研究发表时，这四个国家只占GPS数据库的5%。这种不匹配在很大程度上是由于每个国家都有一套独特的经济、技术和政治策略，使它们超出了最初的 GPS 模型的能力范围，从而难以获得适当的样本。然而，这些国家并不缺乏有能力、有动力的利益相关者，希望通过一个分散的模式和对能力发展的充分支持，这些数据缺口可以得到填补。有了更多的代表性数据，基因组分析有可能为区域和全球传播背景下的病原体进化和风险提供一个清晰的图像。

5.2 利用基因组监测系统对抗多种病原体

GPS已经成功地建立了丰富的知识库，为未来的肺炎球菌疾病控制战略提供信息，并在为持续的基因组监测开发全球基础设施方面取得了良好进展，但仍有许多工作要做，以实现一个自我维持的系统。全球基因组学监测系统的其他疫苗可预防的细菌病原体也正在建立，许多解决方案可能在不同病原体物种中通用。与GPS最明显的相似之处是具有类似人口结构和不完全覆盖疫苗的地方性细菌病原体。脑膜炎奈瑟菌就是一个例子，该菌有多种疫苗配方，但没有一种具有完全的物种覆盖。在脑膜炎球菌疾病负担最重的非洲，针对A血清群多糖荚膜的结合疫苗的广泛使用已大幅降低A血清群疾病，但也有其他血清群导致的疾病增加，最明显的是X血清群，目前没有许可的疫苗。非洲“脑膜炎带”脑膜炎球菌病流行病学的特点是流行性浪潮和优势菌株的连续转移；基因组学明确了解脑膜炎球菌种群动态和为未来的流行病浪潮准备方面具有巨大的潜力。

5.3 加强疾病负担高的LMICs能力建设

对疫苗可预防病原体的基因组监测只有通过当地数据生成和分析才能持续，而这些数据目前非常重视疾病负担沉重的国家的能力建设。幸运的是，基因组学培训的倡议越来越多，包括湿式实验室和生物信息方面的专业知识，并大力强调“培训师培训”理念，以确保可持续性。宣传运动正在提高国家决策者对基因组学价值的认识，以便将基因组学纳入国家疾病控制战略。此外，全球卫生主要资助者正在优先考虑高负担国家基因组学能力建设的重要性。其他根本性挑战依然存在。然而，将DNA测序的普遍性和基因组学应用于高负担国家的一系列地方病和流行病病原体的需要结合起来，应该有可能发展可持续的病原体基因组学监测能力，这将对地方和全球的传染病预防都有好处。

5.4 优化疫苗配方

世卫组织列出了针对9种不同疾病模式（地方性、流行性、机会性）的细菌病原体的可用疫苗，并提出了不同的实施建议，其中一些更常用来应对疫情。在某些情况下，疫苗的抗原通常是不变的，并能很好地覆盖所有种类（例如白喉、百日咳、破伤风、伤寒）。在这些情况下低密度基因组监测将有助于描述疫苗失效的情况，以了解疫苗规避的机制，并预测它是否可能是一个新出现的威胁。在疫苗抗原高度变异且物种覆盖不全的情况下，目前可能需要像季节性流感疫苗那样定期重新配制有效疫苗。重新配制周期可能不需要像流感那样迅速（每年一次），而且物种之间的周转率会有所不同。然而，拥有病原体进化的纵向基因组记录对于设计新疫苗和预测其使用的潜在风险/益处具有巨大的价值。

数学模型是预测传染病风险的有用工具。整合细菌病原体的进化参数一直是一个挑战，特别是由于多菌株物种水平基因转移产生的复杂性，使模型输出具有高度的不确定性。最近的模型试图利用纵向种群基因组数据集提供的详细的进化知识。基于病原体种群个体基因频率平衡的模型，被称为负频率依赖选择，已被用于为种群对疫苗的反应和致病性菌株的出现提供可信的解释。这种方法还被应用于假设PCV制剂可以适应现有人群并提供更好的疾病预防。这一方法的一个关键优点是，它可以允许针对区域设计疫苗，宣传世界各地病原体种群可能存在显著差异的现实，而且一种方法适合所有全球疫苗可能不是最佳方法。世卫组织还列出了一些正在研制的疫苗，还有许多其他疫苗正处于早期设计阶段。群体基因组学在疫苗设计中日益受到重视，并被进一步作为其他强有力的组学方法的基础，如通过完整的蛋白质组阵列调查潜在的免疫原性。

5.5 基因组学在临床微生物实验室的潜在应用

基因组技术有潜力为疾病病例中分离病原体的固有挑战提供解决方案。无法从临床样本中培养活病原体的情况并不少见，目前正在开发分子技术，目的是直接提取和分析病原体DNA，而不是依赖活病原体细胞的存在。如果这些技术可以丰富整个基因组，那么一些物种的临床病原体基因组方案就可以“免培养”了。基因组学的另一个潜在好处是重要病原体表型的相关性和衍生性，这些表型通常是通过一系列湿式实验室技术确定的，通常具有特定物种的协议，每一项都需要实验室基础设施的维护和消耗品的支出。许多研究表明，直接从基因组数据获得此类表型具有高度的一致性，许多公共卫生实验室选择基因组学作为主要或唯一的测定方法。

总之，克服上述挑战需要多学科的专业知识，政府的支持和充足的资金。本文中讨论的GPS项目所采取的方法和吸取的经验教训-监测重点和基础设施、合作模式、能力建设和生物信息学培训组合以及LMICs面临的挑战的解决方案，基因组学的最新进展-可指导国家和国际一级的通用监测网络。