科研 | Microbiome:一种用于结直肠癌治疗的合成益生菌可调节肠道微生物群

2021
09/14

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微生态
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编译:微科盟书明,编辑:微科盟汤貝、江舜尧。


导读    
成功的化学预防或化疗是通过在恶性肿瘤发生的初始阶段靶向呈递预防药物或治疗药物来实现的。细菌可以用作抗癌剂,但是利用弱化的病原菌会有毒性或感染的风险。乳酸菌可以安全食用,并且通常对健康有益,因此它们是用于呈递抗癌药物的活载体的理想候选者。在这项研究中,我们使用乳酸菌戊糖片球菌开发了一种用于结直肠癌(CRC)治疗的有效细菌药物输送系统。它配备了由强诱导型启动子驱动的双基因盒,编码治疗蛋白P8融合到分泌信号肽和互补系统。在可诱导的CRC细胞来源的异种移植小鼠模型中,相对于对照,我们的合成益生菌显著减少了肿瘤体积并抑制了肿瘤生长。当口服该合成益生菌时,由AOM/DSS诱导的结肠炎相关CRC小鼠表现出息肉消退并恢复了菌群分类多样性。此外,合成益生菌调节肠道微生物群并缓解化学诱导的生态失调。相关性分析表明,特定细菌分类群(如AkkermansiaTuricibacter)与生态平衡或生态失调相关,与其他微生物成员存在正或负相关关系。综上所述,本研究表明,由戊糖片球菌P8治疗蛋白组合的有效且稳定的合成益生菌可以减少CRC并促进再生,以及基于细胞设计生物药物治疗CRC和改善受损微生物群的有效性和可行性。  

 

论文ID


 

名:A synthetic probiotic engineered for colorectal cancer therapy modulates gut microbiota

一种用于结直肠癌治疗的合成益生菌可调节肠道微生物群

期刊:Microbiome

IF:14.650

发表时间:2021.5.26

通讯作者:Jihyun F. Kim & Myung Jun Chung

通讯作者单位:韩国延世大学生命科学与生物技术研究所系统生物学系;韩国京畿道金浦市细胞生物技术研发中心


实验设计



结果


1 设计一种治疗CRC的有效药物递送系统
图1a描绘了使用P8治疗蛋白治疗或预防CRC的合成益生菌的设计原理。为了设计具有增强稳定性和功效的抗CRC治疗益生菌,我们首先采用了alr营养缺陷型互补系统,该系统可以在没有抗生素来维持质粒的情况下阻止P8表达载体pCBT24-2的固化。丙氨酸消旋酶是一种5'-磷酸吡哆醛依赖性酶,参与D-丙氨酸(D-Ala)和L-丙氨酸的相互转化。D-Ala参与细胞壁肽聚糖层的交联,并且在自然界中以极低的量存在。因此,该成分对于细菌生长必不可少,alr基因的缺失会导致细胞死亡。为了得到D-Ala缺陷型的戊糖片球菌SL4(-7),该菌株是SL4缺失了7个天然质粒的衍生体,通过扩增alr基因的上下游1 kb的序列,构建了一个缺失alr基因的同源片段,与染色体相应片段进行同源重组,敲除了戊糖片球菌SL4(-7)染色体上的alr基因(图S1a、b)。由此产生的营养缺陷型突变体既可以在含有D-Ala的培养基中生长,也可以在有表达alr质粒的情况下存活。使用特异性引物验证alr基因敲除成功,这种alr营养缺陷型菌株结合表达alr基因质粒的合成菌株称为PP*。
为了建立一个有效的P8基因表达系统,选择了四种参与核心糖酵解途径的组成型启动子:丙酮酸激酶(PK)、胆碱ABC转运蛋白通透酶和底物结合蛋白、葡萄糖激酶和L-乳酸脱氢酶。使用这些启动子,我们构建了五套双表达系统,含有两个契合基因,编码表达P8蛋白,并在Usp45分泌信号蛋白的N末端相融合。该系统克隆至含有alr基因的质粒载体上(图1b)。然后我们使用Elisa方法测定了这五套双表达系统表达P8蛋白的蛋白量情况,验证了PK-PK启动子具有最佳的稳定性和生产力(图1c)。为了进一步排除宿主基因型可能影响P8分泌性能的可能性,我们分别比对了用pCBT24-2(PP-P8)中的PK-PK启动子系统用于野生型戊糖片球菌SL4(-7)中P8蛋白的表达,和含有alr质粒载体的PK-PK启动子系统表达Δalr突变体分泌的P8浓度,发现SL4野生型和Δalr突变体之间没有P8表达量的差异(图S1d)。
 
图1. 基于乳酸菌的药物递送系统的模块设计以实现最佳P8生产力。a 描绘具有alr互补系统的合成益生菌PP*-P8预期作用模式的示意图,alr,丙氨酸消旋酶基因。b 以多种启动子构建的P8治疗蛋白与27个残基Usp45前导肽融合的双重表达。GK,葡萄糖激酶;LDH,L-乳酸脱氢酶;PK,丙酮酸激酶;ChoS、胆碱ABC转运蛋白通透酶和底物结合蛋白。c 使用ELISA定量PP*-P8分泌的P8浓度,表明PK-PK启动子系统分泌的P8浓度最高。
 
2 PP*-P8DLD-1异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效
为了确定PP*-P8在体内是否具有抗癌活性,我们使用DLD-1异种移植小鼠模型评估了其功效。皮下经DLD-1异种移植的无胸腺BALB/c裸鼠分别经商业化疗药物吉西他滨,PP*或PP*-P8治疗(剂量和给药方案见“方法”),处死前监测肿瘤大小6周,(图2,表S2和S3)。与吉西他滨或PP*-P8治疗组相比,未治疗对照组和PP*治疗组的肿瘤生长速度要快得多(图2a)。实验结束时,对照组的平均肿瘤体积为2680.9±419.7 mm3,PP*组的平均肿瘤体积为2671.1±651.2 mm3,而吉西他滨和PP*-P8治疗组的平均肿瘤体积分别为498.6±192.7 mm3和1371±349.8 mm3(图2a、b;对照与PP*-P8,P=4.9×10-5)。肿瘤重量在对照组中为2.13±0.31 g,在PP*中为2.35±0.32 g,相比之下,吉西他滨中为0.39±0.16 g,PP*-P8中为0.97±0.30 g(图S2a;对照vs. PP*-P8,P <1×106)。与对照组相比,吉西他滨和PP*-P8治疗组肿瘤生长的移植率分别为84.1%和50.8%(图2c;对照与PP*-P8,P=5.3×105)。这个结果证明了我们的合成益生菌PP*-P8与抗癌药类似,可有效抑制肿瘤生长。
接下来,我们进一步研究由PP*-P8诱导CRC异种移植物的生长抑制是否是由于细胞周期阻滞。蛋白质印迹分析显示肿瘤组织中细胞周期调节因子Cyclin B1和Cdk1的表达在经PP*-P8治疗后显著降低(图2d,图S2b)。此外,在PP*-P8治疗后,抑制CyclinB1/Cdk1的p21表达增加,p53的表达量也有所增加。总体而言,数据表明抗癌治疗蛋白P8抑制p53-p21信号通路,导致DLD-1细胞G2期阻滞。

2. PP*-P8益生菌在DLD-1异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效。a 每周记录的DLD-1衍生肿瘤的大小增加。小鼠(n = 10/组)在右后侧皮下接种2×106 DLD-1细胞,然后对照组接受0.9%生理盐水;dFdC组按体重60 mg/kg腹腔注射吉西他滨,每周2次;PP*组进行1×1010 CFU/只的P. pentosaceus alr(pCBT24-2-alr)灌胃,每周5次;PP*-P8组进行1×1010 CFU/只的P. pentosaceus alr(pCBT24-2-PK-p8-PK-p8-alr)灌胃,每周5次;***P < 0.001对照vs. dFdC,对照vs. PP*-P8dFdC vs. PP*PP* vs. PP*-P8b DLD-1异种移植后6周从每个治疗组中提取肿瘤组织。c 由对照组和试验组的平均肿瘤重量计算的肿瘤生长抑制率。d 具有对照的PP*PP*-P8之间细胞周期调节因子表达的相对倍数变化。每个垂直条代表三个重复的算术平均值。*P < 0.05**P < 0.01***P < 0.001

 
3 PP*-P8减弱AOM/DSS诱导的结肠炎相关的肿瘤发生
使用完善的AOM/DSS(氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠)诱导的结肠炎相关结肠癌小鼠模型来研究合成益生菌PP*-P8的抗癌作用。在整个68天的实验周期里,第一天,给C57BL/6小鼠腹膜注射AOM,随后在其饮用水中补加DSS,持续三次。小鼠被分为五组;未处理对照(只经AOM/DSS处理)、五氟尿嘧啶(5-FU)、野生型 P. pentosaceus SL4组(PP WT)、PP*和PP*-P8治疗组(图3a;剂量和给药方案见“方法”)。PP WT、PP*和PP*-P8中戊糖片球菌的相对丰度分析表明,种群维持在0.01~0.03%(图3b)。尽管PP WT中的戊糖片球菌数量在第1阶段增加,在随后的两个阶段直到实验结束,这三组呈现相似的菌群丰度。
在每次DSS给药前后观察到平均出血评分的剧烈变化(图3c;第5天和第10天之间的P=3.12×102,第26天和第31天之间的P=6.40×107,以及第47天和第52天之间的P=1.90×106)。比较各组在DSS给药后第25、45、68天的出血评分时,与未处理对照组的第45天(P=1.32×102)、第68天(P=1.00×105)和PP*的第68天(P=3.53×104)相比较,PP*-P8组症状明显缓解。(图3d,表S4和S5)。严重出血和肛门周围出血通常在对照组中很明显,而PP*-P8只检测到隐血或轻微出血。图4a以及附加文件2中的表S4和S5表明,DSS治疗对5-FU组和对照组的体重增加有负面影响,而PP*-P8组小鼠的体重持续增加直至实验结束。Kaplan-Meier生存图同样显示出PP*-P8处理增加了实验期间AOM/DSS处理小鼠的存活率,无死亡病例发生(图4b)。值得注意的是,5-FU组的存活率在第1阶段大幅降低,与PP*-P8显著不同(P=0.025)。结肠长度是评估结肠炎症严重程度的标志之一,在动物安乐死后进行测量,结果表明与PP*-P8组相比,三个对照组的结肠长度显著缩短,这显示出严重的炎症现象(未处理对照组、PP WT、PP*分别为P<1×10-6P=2×10-6, P=1.8×10-5)(图4c、d)。与仅AOM/DSS处理的模型对照的结肠长度相比,PP*-P8的结肠长度接近健康小鼠组的结肠长度,表明PP*-P8治疗时阻止了因AOM/DSS处理造成的结肠缩短情况(表S4)。
位于中远端结肠的结节性息肉状肿瘤的数量分析,PP*-P8治疗组低于未处理对照组(P=3.08×10-3)和PP*(P=1.68×10-3)组,而PP WT没有显著变化(P=0.3)(图4e)。我们还检测了以原始培养体积的1/10重悬的冻干PP*-P8对AOM/DSS小鼠模型中抗癌活性的影响;结果显示,冻干前后的PP*-P8的息肉数量无显著差异(图S3)。总之,来自AOM/DSS诱导的结肠炎相关癌症模型的这些结果表明,PP*-P8益生菌有效地抑制了结肠炎症相关的致癌作用和肿瘤的发展。

3. AOM/DSS诱导的结肠炎相关结肠癌发生小鼠模型。a AOMDSS诱导肿瘤的实验方案。小鼠(每组n=10)在第1天和第5天腹腔注射12.5 mg/kgAOM然后给予含有2% w/v DSS的水5天,普通水16天,在68天的治疗过程中重复3次。实验组别:对照组(0.9%生理盐水,口服),氟尿嘧啶(5-FU40 mg/kg,腹膜内注射,每周2次),野生型P. pentosaceus PP WT1×1010 CFU/只,口服,每周五次),P. pentosaceus alr (pCBT24-2-alr)(PP*1×1010CFU/只,口服,每周五次)P. pentosaceusalr (pCBT24-2-PK-p8-PK-p8-alr)(PP*-P81×1010CFU/只,口服,每周五次)粪便取样时间表用箭头表示。b 实验期间PP*-P8种群相对丰度的时间动态,虚线代表DSS治疗。c 5天通过潜血试验和可见体征评估出血评分。虚线代表DSS治疗过程。d 每个阶段的最后几天,第254568天的出血评分比较。*P < 0.05**P < 0.01***P < 0.001


4. PP*-P8AOM/DSS小鼠模型中一般健康和肿瘤发生的影响。a 每周记录小鼠体重的变化。b 五个不同治疗组小鼠的Kaplan-Meier存活曲线,进行对数秩检验以测量统计显著性。c 息肉的形态学和组织病理学。68天后测量结肠长度和e息肉数量。*P < 0.05**P < 0.01***P < 0.001

 
4 PP*-P8调节肠道微生物群以缓解AOM/DSS引起的生态失调
我们进一步探讨了合成益生菌PP*-P8对由AOM/DSS诱导结肠炎相关的结肠癌小鼠模型中肠道微生物群的可能影响,C57BL/6小鼠被分为未处理对照组、5-FU、PP WT、PP*和PP*-P8治疗组,接受剂量方案和粪便收集(图3a)。提取粪便中的DNA,对16S rRNA基因的V3-V4区域进行扩增子测序以监测微生物群落结构。使用QIIME2平台,以99%的序列同一性将处理后的读数聚类为 ASV s以计算相对丰度(表S6和S7)。
物种丰富度和均匀度分别通过ASVs数量和逆Simpson指数来衡量受到AOM/DSS处理严重干扰的微生物多样性(图5a)。正如预期的那样,所有实验组α多样性均有所降低,经DSS处理后,ASVs数量均有所下降。直到下次给药ASVs才部分有所恢复。有趣的是,在实验结束时,PP*-P8组似乎比5-FU组和对照组在第3阶段更好地恢复了分类多样性(图5a中的红线)。基于Bray-Curtis差异性的主坐标分析(PCoA)说明了每个治疗组与预处理样本之间粪便微生物群的差异性在第0天和第5天随着治疗阶段的进展而增加(图S4)。对照、5-FU和PP*-P8处理之间的差异在第1阶段不明显(图5b,图S4)。然而,β多样性随着时间的推移而增加,微生物变异的置换多变量分析导致第2和第3阶段的组之间存在显著的统计差异(分别为P=0.012和P=0.001)。PCoA图还显示,与PP*-P8相比,三个对照组在第2和第3阶段变得更加分散。值得注意的是,5-FU和PP*-P8在第3阶段出现相似(图5b)。分析每个阶段每个组的微生物分类群的分布和丰度,结果表明拟杆菌门和厚壁菌门中的细菌主导了小鼠肠道微生物群(表S7)。科水平的相对丰度表明,在第0天, Muribaculaceae 、毛螺菌科、瘤胃球菌科和乳杆菌科是主要的菌群,而在DSS处理期间,阿克曼菌科、拟杆菌科和丹毒丝菌科,以及Muribaculaceae、毛螺菌科、乳杆菌科和瘤胃球菌科(图5c)。每个科的相对丰度波动取决于DSS处理的阶段。与对照相比,在第3阶段观察到显著不同的 β 多样性模式(图5b;P=0.001),5-FU组富含阿克曼菌科和瘤胃球菌科,但缺乏丹毒丝菌科和乳杆菌科。在PP*-P8处理组中,与对照相比,阿克曼菌科和乳杆菌科增加,而丹毒丝菌科细菌减少。来自AOM/DSS小鼠模型的数据表明,PP*-P8益生菌通过调节肠道微生物群结构的α和β多样性以及潜在有益分类群的比例,有助于缓解AOM/DSS诱导的生态失调。
 

图5. PP*-P8处理的AOM/DSS小鼠肠道微生物群的纵向分析。a粪便样本中微生物群落的α多样性指数的变化。物种丰富度和均匀度用检测到的ASVs的数量以及Simpson和Shannon指数来表示。b基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析。每个点表示一个样本,每个组以不同的颜色显示。P值对应于置换多变量方差分析结果。c科水平的微生物组成以相对丰度显示。
 
5 PP*-P8维持的生态平衡与特定的细菌分类群相关
为了确定哪些细菌最有可能造成治疗组之间的差异,当小鼠从最后一次DSS处理中恢复时,我们应用LDA和LEfSe方法计算最后三个样本在第56天、第63天和68在第3阶段的LDA分数。图6a显示了属水平上根据效应大小排序的分类进化枝列表,在具有统计学和生物学意义的组间存在差异。结果显示,在PP*-P8和对照组之间,AkkermansiaPediococcus和未分类的Bacteroidales细菌在PP*-P8中最具差异性(log10 LDA≥4.0)。类似地,AkkermansiaBacteroides在PP*-P8中的差异最大,而Turicibacter和未分类的 Muribaculaceae 细菌在PP*中差异最大。在5-FU和对照组之间,5-FU中最高的菌属包括Bifidobacterium、一种未分类的Bacteroidales细菌、Ruminococcus 1,和Dubosiella,而对照中最高的是Turicibacter。在PP*-P8和 5-FU 两组之间,PP*-P8组中,杆菌类别中的LactobacillusPediococcus、以及其他的乳酸菌丰富度最为显著。5-FU组中以各种级别的放线菌至双歧杆菌,CoriobacteriiaCoriobacteriaceae UCG-002,和Dubosiella较多(图S5)。肠道微生物群成员之间的相互作用是使用成对Spearman等级相关系数确定的,该系数在第3阶段的第56、63和68天计算,使用20个最丰富的属用于统计分析,并可视化为热图(图6b)。该图显示了两个相互竞争的集群:一个由Akkermansia、一种未分类的毛螺菌科、毛螺菌科NK4A136组、一种未分类的瘤胃球菌科、双歧杆菌和Parasutterella组成,另一个由Turicibacter、一种未培养的拟杆菌属细菌、未分类或未培养的Muribaculaceae成员组成。特定细菌,如Akkermansia和未分类的毛螺菌科,以及Turicibacter和未分类或未培养的Muribaculaceae成员与其他细菌有多种相互作用,因此可以称为关键分类群。Akkermansia是PP*-P8组微生物特征的标志性分类群,与Turicibacter呈高度负相关,Turicibacter是对照组和PP*组的生物标志物,它是一种未培养的Muribaculaceae的成员和一种未分类的Muribaculaceae。另一方面,Akkermansia与毛螺菌科NK4A136、Parasutterella、双歧杆菌和未分类的毛螺菌科有很强的正相关关系。Turicibacter与毛螺菌科NK4A136、未分类的瘤胃球菌科、Akkermansia和未分类的毛螺菌科呈负相关,与未分类的毛螺科呈正相关。这些结果表明微生物成员之间的正负关系塑造了群落结构。
然后,我们探讨了特定细菌分类群的α多样性的可能影响。20个最丰富属的相对丰度与Shannon指数的关联用 Spearman 秩相关法进行测定测量的(图6c)。Turicibacter是唯一与Shannon指数呈显著负相关的属(R=-0.74,P=0.0022)。相反,毛螺菌科NK4A136(R=0.82,P=0.00022)和未分类的瘤胃球菌科(R=0.87,P=2.2×10 −16 )呈正相关。基于这些,我们推测由Turicibacter和Muribaculaceae的一些成员组成的集群与生态失调有关,而包括Akkermansia、毛螺菌科的一些成员、未分类的瘤胃球菌科、双歧杆菌和Parasutterella的集群与恢复生态平衡有关。
基于扩增子测序,在第3阶段的恢复期周期里,第56天,63天,68天,Akkermansia的平均相对丰度为0.09±0.02%,比PP*组和对照组分别高4.16倍和2.77倍。另一方面,这些天中对照组和PP*组中的Turicibacter分别为0.27±0.2%和0.11±0.03%,它们分别比PP*-P8高8.89倍和3.88倍,分别比5-FU高9.39和4.1倍。为了验证基于比例分析的结果,我们使用qPCR确定了两个属的绝对丰度(图6d表S4)。PP*-P8中的Akkermansia在第56、63和68天测量数量为4.21±0.82×109、1.17±0.07×109和3.51±0.06×109个细胞/g粪便样品,比PP*高3.5~4.9倍,比对照高2.74~3.93倍。相反地,在对照组和PP*组中,测得的Turicibacter在这三天的数量分别为1.27±0.02×109、2.08±0.61×109、和1.59±0.22×109,1.75±0.03×109、1.46±0.03×109、和1.14±0.04×109。比PP*-P8组分别高0.99~3倍和0.98~2.11倍,比5-FU组分别高1.45~2.43倍和1.07~1.99倍。这些结果表明AkkermansiaTuricibacter的相对丰度与定量计数一致。
为了确定各组在第3阶段56、63和68天的功能特征,根据LDA效应大小(log10LDA>2.0)列出了PICRUSt2预测的显著富集的KEGG通路(图6e)。与对照相比,PP*-P8中的微生物成员对硫胺素代谢(ko00730)、氯环己烷和氯苯降解(ko00361)、类固醇生物合成(ko00100)和细菌分泌系统(ko03070)有促进作用。在PP*-P8和PP*之间,PP*-P8的富集途径包括辅因子和维生素代谢(ko00785,ko00730)、糖代谢(ko00630,ko00650)、硒代谢和精氨酸/脯氨酸代谢(ko00450,ko00330)。其中包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢(ko00471),肽聚糖生物合成(ko00550),蛋白质生物合成(ko00970,ko03010),以及参与复制和修复的途径(ko03030,ko03440,ko03410,ko03430)。对比可知,硫胺素代谢是共同的。与对照相比,5-FU预测了18条通路:细菌趋化性(ko02030)、C5支链二元酸代谢(ko00660)、6条氨基酸代谢途径(ko00290、ko00400、ko00340、ko00330、ko00260、ko00270)、4条辅因子和维生素代谢通路(ko00860、ko00770、ko00740、ko00730)。值得注意的是,PP*-P8和5-FU具有共同的硫胺素代谢通路。此外,玉米素生物合成(ko00908)在对照和PP*中重复检测到。

6. 可能与处理组之间的差异相关的特定微生物分类群。 最终 DSS 处理后样本的线性判别分析效应大小。 20 个最丰富的细菌类群之间的正相关和负相关矩阵。 显示了最终 DSS 处理后成对 Spearman 等级相关的结果。 P 值小于 0.05 的相关性用星号标记, Benjamini-Hochberg FDR 方法调整后的 P 值小于 0.05 用黑色表示。 基于欧氏距离的相关属被聚类在一起。 红色,正相关; 蓝色,负相关。 未培养 (unc) 或未分类 (una) 属用其姓氏的首字母标记, [M] [L] [R] 分别代表 Muribaculaceae Lachnospiraceae Ruminococcaceae c 6 个属的相对丰度与 Shannon 指数之间的 Spearman 秩相关散点图。 在最终 DSS 处理后第 68 天,通过 qPCR 测量粪便中 Akkermansia Turicibacter 数量。 *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 对照与 PP*-P8 PP* PP*-P8 以及对照与 5-FU 之间具有丰富的区别性功能通路。

讨论


如今,伴随着癌症机制研究以及诊断、治疗手段的进步,癌症康复率有所增加,但治疗中带来的副反应和耐药性问题依旧是关注焦点,在癌症治疗的生物制药手段中,将活细菌用作治疗剂的效果已在临床前或早期临床试验中得到验证;尽管它们仍然存在毒性问题,但它们在遗传上已减弱至毒性较低甚至无毒的水平。最近,与人体共生的细菌因其抑制或预防CRC的潜力而受到广泛关注,此前,我们发现了一种源自益生菌LAB菌株的新型治疗肽,并使用重组形式证实了其抗CRC功效的临床潜力。在本研究中,我们采用食品级LAB P. pentosaceusSL4(-7)的D-Ala营养缺陷型突变体,在PK-PK双启动子系统的控制下,补充一个含alr的质粒双基因表达盒,构建了稳定高效的DSS。然后我们将鼠李糖乳杆菌CBT LR5中对DLD-1细胞具有强抗增殖活性的新型治疗蛋白P8加载到细菌中,构建用于治疗CRC的 PP*-P8 合成益生菌。使用DLD-1异种移植和AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型,验证PP*-P8合成益生菌治疗效果。异种移植模型表明,我们的合成益生菌可有效抑制肿瘤生长,并且可以成为具有竞争力的治疗菌株。AOM/DSS模型用于纵向评估我们的合成益生菌对致癌作用的抑制作用,与对照组比较分析显示,PP*-P8组小鼠体重和结肠长度正常,死亡率、出血评分和息肉数量均降低。
吉西他滨是一种核苷类似物,已被广泛用作实体瘤的标准抗癌药物,并应用于非小细胞肺癌或胰腺癌患者来源的肿瘤移植模型。然而,它在被呈递到靶位点之前胞苷脱氨酶或脱氧胞苷酸脱氨酶可使其迅速灭活,因此不适合全身治疗。因此,我们在DLD-1异种移植模型中通过腹膜内注射吉西他滨进行治疗,并在 AOM/DSS 模型中使用了5-FU,这是结直肠癌的一线治疗方案化疗药。
人们越来越意识到肠道微生物群在影响化疗反应和结果方面的作用,化疗药物介导的微生物群的相互影响也越来越受到重视。在我们AOM/DSS实验时,一个重要发现就是PP*-P8益生菌可调节肠道微生物群结构,以缓解AOM/DSS诱导的从生态平衡到生态失调的变化。多样性的丧失、变异的增加、组成的不平衡以及特定谱系的变化,无论是有益的还是有害的,都是肠道微生物群不健康状态的标志。在PP*-P8组中,三种DSS处理后α多样性的恢复和微生物群落的一致性最为突出,这表明我们的合成益生菌不仅可有效治疗CRC,而且有助于维持微生物群结构并可能确保宿主健康利益。在PP*-P8治疗的小鼠中测得的体重、存活率和结肠长度增加支持了这一假设。除了抗癌作用外,5-FU治疗组的体重迅速下降、生存能力下降和结肠长度缩短与先前研究的病例一致,表明化疗的双面性。
组间LEfSe的结果招募了特定的微生物分类群,这些分类群在AOM/DSS模型中的PP*-P8治疗期间具有统计学和生物学意义。在确定的分类群中,最引人注目的是Akkermansia-Verrucomicrobia进化枝。Akkermansia muciniphila是众所周知的健康肠道微生物群生物标志物,被认为是下一代益生菌的有希望的候选者。根据我们的研究,最近的几项研究报告了该物种对AOM/DSS诱导的炎症和其他临床参数的衰减作用。相反,Turicibacter是未处理对照和PP*组的最大特征。尽管对该属知之甚少,但越来越多的关于它们与疾病关联的报道证实了我们的结果。Turicibacter sanguinis典型菌株是从一名发热的急性阑尾炎患者的血培养中分离出来的;此外,据报道,一些Turicibacter细菌具有致病性生活方式,并且通常与宿主伴有炎症有关。此外,在接受AOM/DSS处理的荷瘤小鼠中大量检测到Turicibacter,或在患有便秘的日本受试者中显著富集。根据Spearma的相关分析,AkkermansiaTuricibacter可能形成拮抗簇,由来自LEfSe和Shannon多样性结果相关的成员组成,因此被确定为关键分类群因此,我们预测在AOM/DSS诱导的结肠炎相关癌变发生过程中,PP*-P8益生菌协调微生物群落以维持菌群生态平衡,并可能有助于改善药物副反应并降低复发率。未来的研究将有必要验证这些假设。有趣的是,在AOM/DSS模型的第3阶段,用PP*-P8或5-FU处理的小鼠的微生物群落是相似的,治疗组呈现高水平的Akkermansia和低水平Turicibacter种群。除了它们对癌症发展具抑制的影响之外,目前尚不清楚这两种本质上不同的治疗如何影响微生物群结构并且彼此相似,它们似乎通过不同的作用机制直接或间接地影响微生物群。事实上,除阿克曼氏菌外,在PP*-P8组中有包括处理过的片球菌在内的乳酸菌,而5-FU中有双歧杆菌。然而,应该注意的是,在AOM/DSS治疗期间施用5-FU对健康有益,因为分子本身会引起多种副作用,包括DNA损伤、炎症,以及在我们的研究中观察到的生存能力下降。

讨论


我们用稳定有效的合成益生菌治疗CRC的方法表明了基于细胞的生物药剂的有效性和可行性。我们的结果也证明了生物药物和化疗药物对肠道微生物群和对整体健康可能的积极或消极影响。考虑到它们的潜在影响,我们建议在开发治疗或预防癌症(包括CRC)的药物期间仔细检查微生物群的动态和相关的健康问题。



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关键词:
微生物群,结直肠癌,益生菌,肠道,科研,调节,小鼠,肿瘤,细菌

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