科研 | 中大:肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过肠-肝轴调节L-天冬氨酸代谢改善代谢相关脂肪性肝病

2021
09/11

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微生态
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编译:微科盟R.A,编辑:微科盟汤貝、江舜尧。

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导读    
肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)因其在治疗代谢紊乱,包括肥胖症、糖尿病和代谢相关脂肪性肝病MAFLD)方面的治疗潜力而得到越来越多的关注。然而,其参与代谢作用的潜在机制需要进一步研究。本研究通过高脂高胆固醇(HFC)饮食诱导肥胖小鼠模型,探讨嗜粘蛋白阿克曼氏菌对MAFLD的治疗作用及机制。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理小鼠能有效逆转肝脏中的MAFLD,如肝脂肪变性、炎症和肝损伤。在长期停药后,这些治疗效果仍然存在,而在用抗生素治疗的肥胖小鼠中略有减弱。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理可有效提高肠-肝轴线粒体氧化和胆汁酸代谢,改善氧化应激诱导的肠道细胞凋亡,重塑肠道微生物组成。这些代谢改善是在肝脏从肠道运输的L-天冬氨酸水平增加的情况下发生。L-天冬氨酸在体外或小鼠体内均表现出上述类似的有益代谢作用,可有效改善MAFLD。总之,这些数据表明,嗜粘蛋白阿克曼氏菌抗MAFLD活性与脂质氧化有关,通过调节L-天冬氨酸代谢改善肠肝相互作用。嗜粘蛋白阿克曼氏菌有望在将来作为临床干预MAFLD的潜在药物  

 

论文ID


 

名:Gut Akkermansia muciniphila ameliorates metabolic dysfunction-associated fatty liver disease by regulating the metabolism of L-aspartate via gut-liver axis

肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过肠-肝轴调节L-天冬氨酸代谢改善代谢相关脂肪性肝病

期刊:Gut Microbes

IF:10.245

发表时间:2021.5.25

通讯作者:黄志纾&饶勇&陆勇军

通讯作者单位:中山大学药学院;中山大学生命科学学院润泽实验室


实验设计



结果


灌胃 嗜粘蛋白阿克曼氏菌对肥胖小鼠MAFLD具抑制作用
以前的研究表明,嗜粘蛋白阿克曼氏菌可重塑小鼠肠道菌群组成。在本研究中,检测了HFC小鼠在灌胃和未灌胃嗜粘蛋白阿克曼氏菌时粪便中的肠道菌群组成,HFC小鼠和经灌胃嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠在两组之间的微生物群落结构上存在显著差异(图S1A)。小鼠灌胃嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加了肠道微生物群的丰富度和多样性α-多样性分析[用观察到的可操作分类单元(OTU)和Shannon指数表示](图S1B)并改善了微生物群落结构(图S1C-D)。值得注意的是,LEfSe分析表明,嗜粘蛋白阿克曼氏菌是微生物群组成一种重要的的成分(p=0.0096;图S1E)。
然后,我们评价嗜粘蛋白阿克曼氏菌对HFC饮食喂养诱导的肥胖小鼠模型中MAFLD的治疗效果(图1a)。通过qPCR检测发现,与HFC组相比,嗜粘蛋白阿克曼氏菌灌胃处理组中嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加了20倍(图1b)。这导致了小鼠体重下降,具体而言,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠6天后体重下降了约20.8%(图1c)。有趣的是,嗜粘蛋白阿克曼氏菌灌胃处理可有效减轻HFC小鼠的肝脂肪变性,具体表现为肝TG降低(图1d)。二酰基甘油(DAG)是脂质代谢的代表性中间体,能诱导氧化应激激活并对肝细胞产生毒性作用,从而导致细胞凋亡和肝脏损伤。肥胖小鼠中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌显著降低肝脏中的DAG水平(图1e)。血浆肝脏特异性酶水平的测定显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌显著改善HFC小鼠的肝损伤,具体表现为:天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)水平降低(图1f)。此外,病理检查进一步证实了嗜粘蛋白阿克曼氏菌可改善小鼠MAFLD的所有表型,即:肝细胞损伤和气球样变( H &E染色显示)、肝脂肪变性(ORO染色显示)和炎症(IL-6和CD68检查显示)(图1g)。值得注意的是,这种治疗效果并不是由于喂养行为的改变(图S2A)。基因表达分析显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌在转录水平上显著抑制脂肪变性和炎症相关基因的表达水平,如肿瘤坏死因子ɑ(TNF-ɑ),白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)(图1h)。
探讨嗜粘蛋白阿克曼氏菌具有药物依赖性,HFC小鼠用嗜粘蛋白阿克曼氏菌灌胃6周,另一个4周后(图1i)。有趣的是,停止灌胃后小鼠体重(图1j)、肝脏TG水平(图1k)以及血浆AST、ALT和ALP水平(图1l)显著降低,表明停止灌胃嗜粘蛋白阿克曼氏菌后可有效维持其抗MAFLD活性。病理检查进一步证实了嗜粘蛋白阿克曼氏菌戒断引起小鼠持续的抗MAFLD活性(图1m)。这些药物在嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠与较高的嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度相关。(图S2B-F)。
我们进一步测定了抗生素(Abx)处理的HFC小鼠中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(图S3A)。Abx能有效地降低小鼠体内嗜粘蛋白阿克曼氏菌的丰度,及其在小鼠肠道中的定殖(图S3B)。这种活性导致小鼠肝损伤和MAFLD表现的加重,表现为经Abx处理的HFC小鼠的肝重量增加、肝TG大量积累和肝损伤(图S3C-G)。此外,与HFC小鼠和Abx处理的HFC小鼠相比,Abx和嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合处理组仍然存在显著的MAFLD衰减效应。基因表达分析进一步证实了嗜粘蛋白阿克曼氏菌对FASACCTNF-ɑIL-6MCP1基因表达水平的下调作用(图S3H)。以上数据表明,嗜粘蛋白阿克曼氏菌能有效地减轻小鼠MAFLD。
 

图1. 嗜粘蛋白阿克曼氏菌可减轻HFC饮食诱导的肥胖MAFLD。(a-h)8周龄雄性C57BL/6小鼠用HFC饲喂11周诱导肥胖MAFLD。然后他们被随机分为两个组,以PBS作为对照(HFC组)或PBS中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(HFC+A)每隔一天灌胃6个星期。(a)嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理示意图;(b)嗜粘蛋白阿克曼氏菌在粪便中的丰度;(c)第17周小鼠体重;(d-e)肝甘油三酯(TG)和二酰甘油酯(DAG)水平;(f)血浆AST、ALT、ALP水平;(g)苏木精伊红染色、油红O染色及IL-6、CD68免疫荧光检测肝脏病变,拍摄了具有代表性的图像,比例尺:200 μm。(h)脂肪变性和炎症标志物的mRNA表达。将HFC对照组的基因水平设为1,并通过与HFC对照组的比较来确定相对倍数的增加。N=5–8只小鼠/组。*p<0.05,与HFC对照组小鼠比较。(i-m)停止灌胃嗜粘蛋白阿克曼氏菌后疗效的持续性。(i)实验设计示意图。灌胃6周后,从HFC诱导的肥胖MAFLD小鼠中分离出嗜粘蛋白阿克曼氏菌,持续4周以评估抗MAFLD疗效的可持续性。(j)小鼠体重;(k)肝脏TG水平;(l)血浆AST、ALT、ALP水平;(m)肝组织病理学检查采用H&E染色、油红O染色和IL-6免疫组化检测,并采集代表性图像,比例尺:200 μm,N=5–6只小鼠/组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与HFC对照组小鼠比较。
 
嗜粘蛋白阿克曼氏菌激活肠肝轴的脂质氧化并维持肠屏障的完整性
有研究表明,嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加脂质氧化并激活能量消耗,这是其治疗肥胖症的基础。一直以来,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理小鼠线粒体拷贝数增加(图2a),并激活了参与脂质转运的基因网络(FATP4FAT/CD36)和氧化作用(LPL),过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1ɑ(PGC-1ɑ),解偶联蛋白2(UCP2),肉碱棕榈酰转移酶-1β(CPT-1β),以及肝脏中的LXR(图2b)。免疫印迹分析显示,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理小鼠激活肝激酶B1(LKB1)-AMPK轴,增加肝脏中能量代谢调节因子(PGC-1ɑCPT-1β)和线粒体复合物(I、II、IV和V)的表达(图2c)。
与肝脏有益的代谢特征相一致,嗜粘蛋白阿克曼氏菌还分别激活了回肠和结肠中参与葡萄糖和脂质转运(由FATP4和GluT2指示)和氧化(PGC-1α)的基因网络(图2d,图S4A)。回肠和结肠PGC-1α的免疫组化分析进一步证实了嗜粘蛋白阿克曼氏菌的代谢刺激作用(图2e,图S4B)。这些改善的代谢效应导致回肠和结肠中脂质水平降低(ORO染色显示),并减弱氧化应激诱导的细胞凋亡(C/EBP同源蛋白(CHOP)检测)(图2f,图S4C),从而改善肠道屏障的完整性,通过H&E染色检查细胞紧密连接标记物(E-钙粘蛋白)和肠粘膜厚度(图2g,图S4D)。。此外,HFC小鼠LPS水平的测定进一步支持了嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠血浆LPS水平显著下降,用嗜粘蛋白阿克曼氏菌灌胃处理可以改善肠道屏障的完整性(图2h)。

图2. 嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加HFC小鼠肝脏和肠道脂质代谢相关标志物。以生理盐水为对照,用HFC诱导的肥胖MAFLD(11周喂养)或以嗜粘蛋白阿克曼氏菌(6周喂养)来评估肝脏和回肠参数:a-c为肝脏参数,d-f为回肠参数。e-g,回肠的代表性图像(比例尺,100 µm)。(a)肝线粒体拷贝数测定,(b)小鼠肝脏脂质摄取和氧化相关基因的表达,(c)小鼠肝脏代谢调节因子线粒体复合物和LKB1-AMPK轴的蛋白质水平。蛋白质水平被量化并标准化为小鼠回肠脂质摄取和氧化的负荷控制肌动蛋白(d)基因表达。将HFC组的基因水平或蛋白质水平设为1,并通过与HFC对照组比较来确定相对倍数增加,(e)小鼠回肠PGC-1α的免疫组织化学分析。棕色点表示所检查的蛋白质,拍摄了具有代表性的图像。,比例尺,100 µm。(f)回肠TG水平定量(油红O染色)和氧化应激诱导的细胞凋亡测定(CHOP检测)。拍摄了具有代表性的图像,比例尺,100 µm。(g)HFC小鼠回肠E-cadherin免疫组化分析及H&E检测。棕色点表示目标蛋白,拍摄了具有代表性的图像,比例尺,100 µm。N=5-8只小鼠/组。与HFC对照组小鼠相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
 
嗜粘蛋白阿克曼氏菌减轻肥胖小鼠肠-肝轴胆汁酸代谢紊乱
在体内,胆汁酸主要在肝脏合成,运输到肠道和胆囊组织,然后回流到肝脏。其运输受到基因网络的严格调控,包括胆汁酸合成相关基因(CYP7A1CYP8B1CYP27A1)、胆汁酸转运相关基因(TGR5BSEPMRP2/3)、胆汁酸盐回流调节基因(ASBTIBABP、OSTβ、NTCP)和有机阴离子共转运多肽(OATP)。研究表明,临床上肥胖和MAFLD人群通常表现出胆汁酸代谢水平异常,如肠道和血浆中胆汁酸代谢产物水平高。此外,肠道内胆汁酸的高水平对肠道微生物群的生存有害,导致慢性代谢紊乱的发生。
然后我们探讨了嗜粘蛋白阿克曼氏菌对肠肝轴胆汁酸代谢的影响。如图3a所示,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理小鼠促进肝脏胆固醇转运,表现为肝脏胆固醇转运相关基因(如低密度脂蛋白受体(LDLR))表达水平的提高,并激活参与胆汁酸合成和转运相关基因网络。另外,HFC小鼠灌胃嗜粘蛋白阿克曼氏菌增加了肠道和肝脏中胆汁酸反流调节基因ASBTIBABPOSTβNTCPOATP的表达水平(图3a-b 。此外,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理增强了胆固醇转运(表现为胆固醇转运蛋白NPC1L1水平增加),并降低了回肠中胆汁酸合成相关基因的表达水平(图3b)。与胆固醇转运调节因子(LDLR)表达水平的改变相一致的是:嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理HFC小鼠血浆和肝脏胆固醇水平降低(图3c),表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌有利于肠肝轴胆汁酸代谢。
此外,用嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的小鼠显示结肠中粘蛋白2、粘蛋白4、粘蛋白5ac、粘蛋白5b和粘蛋白20的表达水平提高(图3d),而这些编码粘蛋白的基因是嗜粘蛋白阿克曼氏菌在肠道生长和定殖的关键底物,这一结果与此前已有的报告一致。

图3. 嗜粘蛋白阿克曼氏菌促进HFC小鼠肝脏和肠道胆汁酸代谢。HFC诱导的肥胖MAFLD(11周喂养)以生理盐水作为对照或嗜粘蛋白阿克曼氏菌灌胃(6周喂养),来评估肝脏和回肠参数。(a)胆汁酸在肝脏和肠道间穿梭的示意图;(b)mRNAs的表达参与肝脏胆汁酸合成和转运调控的mRNAs的表达;(c)参与回肠胆汁酸合成和转运的调控的mRNAs的表达;(d)血浆或肝脏中胆固醇的水平;(e)HFC小鼠结肠粘蛋白相关基因的mRNA水平。将HFC对照组的基因水平设为1,并通过与HFC对照组的比较来确定相对增加倍数。N=5-8只小鼠/组。与HFC对照组小鼠相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
 
嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过促进L-天冬氨酸从肠道的转运而提高肝脏L-天冬氨酸水平
为了揭示嗜粘蛋白阿克曼氏菌抗MAFLD活性的可能作用模式,我们通过进行代谢组学分析来确定肝脏的代谢情况。主坐标分析(PCA)显示HFC+嗜粘蛋白阿克曼氏菌(与HFC组比较)、HFC+Abx (与 HFC组比较)、HFC+Abx+嗜粘蛋白阿克曼氏菌(与HFC+Abx组比较)的化学成分存在显著差异。(图4a)。与HFC组小鼠相比,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理组表现出不同的代谢特征,检测到247种具有显著差异的代谢物(86种下调,161种上调)(图4b,左图)。根据KEGG数据库对鉴定出的代谢物进行分类。总共有98种代谢物被划分为前20个KEGG二级通路(图S5A)。此外,与单独用Abx处理的HFC小鼠相比,联合用药组的小鼠肝脏中检测到的代谢产物差异更大。总共检测到628种差异显著的代谢物(105种下调,523种上调)(图4b,右图)。这些改变的代谢物被注释为与肝脏代谢相关,如脂解、脂肪消化和吸收、胰岛素抵抗和胆汁酸生物合成(图S5B)。接下来,我们对这些组进行了代谢趋势分析。有趣的是,鉴定出了一些有趣的代谢物,如天冬氨酸、皮质酮、酰基肉碱和反式维甲酸等,并根据KEGG数据库进行了分类(图4c)。其中,L-天冬氨酸水平显著高于(约2.18倍)HFC小鼠(p=0.0000114),与注释的前20个KEGG通路中的大部分相关,如代谢通路、嘧啶代谢、甘油脂质代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及氮代谢。肝脏L-天冬氨酸水平的定量显示,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理显著增加了肝脏L-天冬氨酸水平,而降低了Abx处理的HFC小鼠中肝脏L-天冬氨酸水平(图4d)。另外,Abx处理部分消除了嗜粘蛋白阿克曼氏菌与单用嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的影响。此外,肝脏L-天冬氨酸水平与肝脏TG含量呈负相关(图4d),表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌改善MAFLD可能与L-天冬氨酸有关,L-天冬氨酸是一种潜在的MAFLD治疗剂。
我们进一步测定了血浆和粪便中L-天冬氨酸的水平。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理有效地增加了血浆和粪便中的L-天冬氨酸水平,而Abx处理也增加了粪便中的L-天冬氨酸水平,但降低了血浆和肝脏中的L-天冬氨酸水平(图4d-e)。一致地,回肠或肝脏中L-天冬氨酸转运体(Slc1a1Slc1a2)的基因表达显示,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理增加了Slc1a1Slc1a2的表达水平,而Abx处理降低了L-天冬氨酸转运体的表达水平,并部分消除了嗜粘蛋白阿克曼氏菌对L-天冬氨酸转运体基因表达的刺激作用(图4f-g)。

图4. 嗜粘蛋白阿克曼氏菌可提高HFC小鼠肝脏L-天冬氨酸水平。诱导的肥胖MAFLD的鼠(喂养11周)分别进行了:生理盐水处理(HFC),嗜粘蛋白阿克曼氏菌灌胃、抗生素(Abx)处理或Abx+嗜粘蛋白阿克曼氏菌的组合处理,共处理6周,来评估肝脏代谢组学和指示化验结果。(a)主成分分析;(b)嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理组中显著差异代谢物的鉴定。嗜粘蛋白阿克曼氏菌与抗生素处理Abx+A组LC-MS分析比较嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠与HFC或Abx处理的HFC小鼠。根据倍数关系鉴定出显著差异的代谢物≥Q值等于或大于0.05。点代表不同的代谢物,N=5只小鼠/组。(c)HFC、HFC+嗜粘蛋白阿克曼氏菌中已鉴定的重要代谢物的注释。嗜粘蛋白阿克曼氏菌、HFC+Abx和HFC+Abx+嗜粘蛋白阿克曼氏菌代谢组学趋势分析;(d)肝脏L-天冬氨酸和TG水平的比较分析;(e)小鼠粪便和血浆中L-天冬氨酸水平,N=5只小鼠/组;(f)小鼠回肠中Slc1a1基因的表达;(g)小鼠肝脏中Slc1a2基因的表达。HFC对照组的mRNA水平设为1,并通过与HFC对照组比较来确定相对增加倍数。N=5-8只小鼠/组,与HFC对照组小鼠比较,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,。与抗生素(Abx)处理的HFC小鼠相比,p<0.05,##p<0.05,###p<0.001,;与嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠相比,$p<0.05,$$p<0.01,$$$p<0.001。

 
5 L-天冬氨酸直接激活脂质氧化和LKB1-AMPK
我们在油酸(OA)诱导下将L-天冬氨酸暴露于肝细胞(L-02细胞)中,发现添加L-天冬氨酸有效地降低了细胞脂质水平,该结果可经TG和尼罗红染色(图5a-b)鉴定。这种降低的发生伴随着代谢能量调节因子(PGC-1α)、线粒体复合物表达水平的增加以及LKB1-AMPK轴的激活(图5c)(图5c),导致氧化应激的抑制,这可以通过活性氧(ROS)水平的降低来说明(图5d-e)。这种有益的代谢效应也在OA诱导的肠细胞中复制(图S6)。这些新发现与最新的报道一致,揭示了L-天冬氨酸在激活HCT-116细胞中LKB1-AMPK轴的代谢作用。
 

图5. L-天冬氨酸降低肝细胞中的脂质和ROS,同时增加LKB1-AMPK活性和线粒体氧化能力。油酸(0.75 mM)诱导的L-02细胞用L-天冬氨酸(10,40 µM)处理24小时、然后收集细胞进行分析。(a)细胞裂解物中的TG水平;(b)使用最终浓度为5 μM的尼罗红探针进行尼罗红染色;(c)LKB1-AMPK轴关键蛋白与线粒体氧化。蛋白质水平根据负荷控制GAPDH进行量化。将每个独立实验的对照细胞中的蛋白质水平设为1,并通过与对照组比较来确定相对增加倍数;(d-e)使用最终浓度为10 μM的DCFH-DA探针,通过流式细胞术或共聚焦显微镜对ROS水平进行定量。拍摄了具有代表性的图像,比例尺,100 µm。显示的数据是平均值±标准差;N=5个独立实验。与对照组细胞相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
 
为了进一步揭示L-天冬氨酸在体内的直接代谢作用,小鼠口服L-天冬氨酸24小时,结果表明,L-天冬氨酸转运体基因的表达在转录水平上被有效激活,导致肝脏中L-天冬氨酸水平的增加(图S7A-B)。此外,L-天冬氨酸处理激活了与肝脏能量氧化相关的基因网络,如PGC-1αUCP2CPT-1β(图S7C)。免疫组化分析PGC-1αUCP2进一步证实了L-天冬氨酸在肝脏中的直接代谢有益作用(图S7D)。这些代谢改善导致内源性肝TG水平轻微降低,但无肝损伤(图S7E)。
我们还探讨了L-天冬氨酸对肠肝轴胆汁酸代谢的调节作用。有趣的是,L-天冬氨酸处理显著激活了肠肝轴胆汁酸合成和转运相关的基因网络(图S5F-G)。这些数据进一步证实了L-天冬氨酸在调节能量代谢方面的直接代谢作用,如脂质氧化和胆汁酸代谢。
探讨L-天冬氨酸对MAFLD的治疗作用。如预期的那样,HFC小鼠灌胃L-天冬氨酸(200 mg kg-1)可有效防止肝重量增加,并改善肝损伤和肝脂肪变性(图S8A-B)。HFC小鼠肝脏TG水平的量化和血浆肝脏特异性酶水平(AST、ALT、ALP)的测定进一步证实了L-天冬氨酸在体内的抗MAFLD活性(图S8C-D),表明L-天冬氨酸可能是治疗MAFLD的有效药物。

讨论


本研究探讨了嗜粘蛋白阿克曼氏菌不同干预对MAFLD和HFC饮食诱导的肥胖小鼠模型的影响及其分子模式。我们的研究表明,用嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理能引起肝脂肪变性,炎症和肝损伤。这些处理效果在很大程度上符合MAFLD治疗的推荐标准。有趣的是,小鼠体内的嗜粘蛋白阿克曼氏菌在处理结束后也一直存在。值得注意的是,嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理促进了L-天冬氨酸从肠道转运到肝脏,进一步激活LKB1-AMPK轴,刺激脂质氧化,从而改善小鼠MAFLD。此外,嗜粘蛋白阿克曼氏菌促进胆固醇转运,改善肠肝轴胆汁酸代谢异常。这些代谢效应可能有利于重塑肠道微生物群组成。我们的研究为解释嗜粘蛋白阿克曼氏菌的代谢效应提供了新的线索。据我们所知,这是第一项用以验证嗜粘蛋白阿克曼氏菌在调节L-天冬氨酸代谢中的有益的作用研究。
嗜粘蛋白阿克曼氏菌是下一代有益微生物,在一些病理条件下(如肥胖、2型糖尿病、炎症性肠病和阑尾炎)会严重减少。直接口服嗜粘蛋白阿克曼氏菌或通过饮食或药物干预提高嗜粘蛋白阿克曼氏菌丰度已被证明是一种切实可行的代谢紊乱治疗策略,包括改善体重和脂肪含量,改善胰岛素抵抗和肝脂肪堆积。酒精性肝病(ALD)患者嗜粘蛋白阿克曼氏菌减少。ALD小鼠中的嗜粘液菌对肝脏脂肪变性和损伤具有保护作用。嗜粘蛋白阿克曼氏菌在MAFLD表型肥胖小鼠中的富集可保护肝脏免受MAFLD的所有表现,进一步表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌是治疗肝病的有效药物。与最新的研究结果一致,我们的研究进一步证实了这一点。有趣的是,由于重塑肠道微生物群的存在,在体内停用嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理4周后,仍能维持其治疗效果。这种持久的改善作用可能大大有利于嗜粘蛋白阿克曼氏菌的临床应用。此外,我们发现抗生素治疗的HFC小鼠中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌轻微减少了,也降低了其在肠道的定殖。尽管这一新发现仍有待进一步证实,但它仍使我们对其潜在的机制产生了浓厚的兴趣。
到目前为止,已经有一些研究试图揭示嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过调节能量消耗和信号传导来发挥其代谢作用。其中,Zhao等人的一项研究表明,嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过灭活LPS/LBP下游信号,降低肝脏和肌肉中脂肪酸的合成和运输,减少慢性低度炎症。此外,在小鼠中使用巴氏杀菌嗜粘蛋白阿克曼氏菌可通过减少碳水化合物的吸收和增强肠上皮细胞的更新来缓解饮食引起的肥胖和降低食物能量效率。值得注意的是,嗜粘蛋白阿克曼氏菌的外膜蛋白“Amuc_1100”,该蛋白与toll样受体2相互作用以改善肠道屏障并部分重现细菌的有益作用。嗜粘蛋白阿克曼氏菌(在肠道内)对靶组织的治疗作用尚不清楚。我们的研究表明用嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理小鼠肝脏中几种代谢物的水平增加,包括SCFAs和L-天冬氨酸。L-天冬氨酸水平的量化显示嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理可提高小鼠粪便、血浆和肝脏中L-天冬氨酸的水平。通过检测L-天冬氨酸转运体,进一步证实了嗜粘液菌对L-天冬氨酸转运的促进作用。值得注意的是,给小鼠服用抗生素会增加粪便中的L-天冬氨酸水平,同时降低血浆和肝脏中的L-天冬氨酸水平。此外,抗生素与嗜粘蛋白阿克曼氏菌组合有效地消除了刺激作用,但与单独使用抗生素的小鼠相比,血浆L-天冬氨酸水平仍然较高,表明肠道微生物群(不仅仅是嗜粘蛋白阿克曼氏菌)可能在调节L-天门冬氨酸的产生和运输中起重要作用。这一新发现与传统理论认为L-天冬氨酸主要在肝脏产生的观点不一致。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理可提高肝脏中的SCFAs水平,包括丙酸盐和醋酸盐,这对抑制肥胖和MAFLD具有有益的代谢作用。升高的代谢物可能单独或共同作用于嗜粘蛋白阿克曼氏菌的治疗作用。至少,嗜粘蛋白阿克曼氏菌介导的肝脏L-天冬氨酸的增加可以为其抗MAFLD提供合理的解释。这个有趣的数据为解释嗜粘蛋白阿克曼氏菌在体内的治疗效果提供了新的线索。
L-天冬氨酸是一种非必需氨基酸,在临床上通过调节氮代谢、核酸合成和Kreb循环参与急慢性肝炎和肝硬化的治疗。最近的一项研究推测,L-天冬氨酸是治疗MAFLD/NASH的有效药物。然而,这一假说尚未在体内外得到证实。最近,一项研究表明,补充L-天门冬氨酸可以改善小鼠的糖尿病肾病。在机制上,Jiang等人的最新研究表明,L-天门冬氨酸可以直接与磷酸化的LKB1相互作用,从而激活细胞中的LKB1-AMPK轴。我们的研究也发现,L-天冬氨酸处理可激活肝细胞和肠细胞中的LKB1-AMPK轴,增强脂质氧化,抑制氧化应激及其诱导的细胞损伤,从而改善MAFLD。此外,L-天冬氨酸水平与肝脏TG水平呈负相关,表明肝脏L-天冬氨酸水平升高可能是MAFLD的一种治疗策略。这一发现进一步支持了我们的研究结论,即:嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过调节L-天冬氨酸代谢改善小鼠MAFLD。在未来,我们将验证L-天冬氨酸在人类MAFLD治疗中的有效性,并进一步探索提高肝脏L-天冬氨酸水平的新的切实可行的干预措施。
另一方面,虽然我们的研究也通过激活脂质氧化来验证嗜粘蛋白阿克曼氏菌的治疗作用,但观察到一些与其他结果不一致的结果,包括:1) 嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理增加回肠和肝脏的脂质和胆固醇转运; 2)嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理的HFC小鼠回肠绒毛缩短说明其吸收养分的能力下降,这与我们的基因结果不一致。据我们所知,这些结果的差异可能部分是由于多种原因造成的。首先,我们目前对HFC饮食给药小鼠的研究表明,胆固醇对诱发非酒精性脂肪性肝炎的肝损伤和代谢综合征至关重要。每日高胆固醇摄入导致回肠氧化应激和肝肠轴间胆汁酸代谢紊乱,导致肠壁变薄(如H&E检查所示)。嗜粘蛋白阿克曼氏菌促进肠-肝相互作用和胆固醇的吸收代谢,从而维持肠道屏障的完整性。其次,L-天冬氨酸是一种重要的氧化燃料,可进入线粒体进行ATP合成以吸收营养物质。肥胖小鼠回肠和肝脏中高水平的L-天冬氨酸可加速脂质和胆固醇的吸收和氧化。事实上,限制能量吸收或促进能量氧化已被证明是治疗代谢紊乱的有效策略。绒毛变短可能是由于高丰度的嗜粘蛋白阿克曼氏菌、肠道菌群结构改变、高胆固醇摄取所引起的复杂结果。
肠肝轴功能障碍与MAFLD的发生密切相关。在肠肝轴活动中,胆汁酸代谢功能紊乱在重塑肠道微生物群组成和调节肝脏葡萄糖和脂质的稳态方面起着关键作用。研究表明,MAFLD或NASH人群常伴有血浆中胆汁酸水平异常,这与MAFLD的程度呈正相关。此外,高脂肪和高胆固醇饮食喂养改变了肠道内胆汁酸的组成,导致肠道菌群失衡,加重胆汁酸代谢紊乱。相反,胆汁酸代谢增强有利于改善MAFLD。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理增加了肝脏中胆固醇的吸收和胆汁酸的代谢,改善了肠肝轴中胆汁酸代谢的循环。胆汁酸代谢的增强可能有助于肠道菌群的重组。此外,最近的研究表明,肠道内氧化应激的激活和细胞凋亡的诱导对肠道屏障有害,导致某些疾病的发展,如炎症性肠病(IBD)、肥胖症和MAFLD。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理能有效地增加肠道脂质氧化,改善脂质累积引起的氧化应激和细胞凋亡,维持肠道屏障的完整性。这些数据进一步证实了嗜粘蛋白阿克曼氏菌可治疗代谢紊乱。
MAFLD的发生涉及多种因素。其中,肝脏脂肪变性被认为是最初的因素,其特征是由于脂肪生成增加和/或外源性FFAs的过量而导致的大量脂肪堆积。肝脏脂肪生成受一系列产脂酶的调节,包括ACC和FAS,FFA的吸收受其转运体(包括FAT/CD36FATP4)的调控。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理不仅显著下调了脂肪生成标志物的表达,而且增加了肝脏中FAT/CD36FATP4的水平,导致累积的脂质氧化。这些数据表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过增加脂质氧化的机制消除HFC小鼠肝脏脂肪变性。这一机制与已证实的通过促进肝脏脂质氧化治疗MAFLD的策略极为一致。
本研究存在一些局限性。(i)在HFC饮食诱导的肥胖小鼠模型中,我们没有揭示L-天冬氨酸治疗MAFLD的机制。基于L-天冬氨酸对细胞和正常饮食小鼠的有益代谢作用,我们有理由认为L-天冬氨酸改善小鼠MAFLD的作用与其代谢调节作用密切相关。(ii)我们没有提供明确的线索来证明L-天冬氨酸增加的来源。(iii)我们的研究使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体有一定的局限性,理想情况下应选择另一种细菌或其他细菌的混合物。这需要进一步利用相关动物模型探讨其抗MAFLD作用及来源。

图6. 嗜粘蛋白阿克曼氏菌改善HFC饮食诱导的肥胖小鼠MAFLD的机制。嗜粘蛋白阿克曼氏菌处理增加肠-肝轴的L-天冬氨酸水平,激活LKB1-AMPK轴,增加肠-肝轴的脂质氧化和胆汁酸代谢,导致脂质积聚减少和氧化应激诱导的细胞凋亡。这些代谢改善可维持肠道屏障的完整性,并重塑肠道菌群组成,以治疗小鼠MAFLD。

总之,我们目前的研究表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌是一种治疗MAFLD的潜在药物,它通过增加肝脏中L-天冬氨酸的水平来治疗MAFLD。在细胞和小鼠中用L-天冬氨酸治疗,在很大程度上复制了嗜粘蛋白阿克曼氏菌在小鼠中的有益于代谢作用,包括增加脂质氧化、激活LKB1-AMPK轴和改善肠肝轴中的胆汁酸代谢,从而改善肠道和肝脏组织中脂质积聚引起的代谢紊乱(图6)。我们的发现表明嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过调节L-天冬氨酸代谢改善小鼠肠-肝相互作用,从而减轻MAFLD。




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关键词:
脂肪性肝病,阿克曼氏菌,天冬氨酸,HFC,胆汁酸,水平

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