科研 | 广西大学:加味葛根芩连汤主要活性成分对不同饮食环境下溃疡性结肠炎具有肠道微生物依赖性的保护作用

2021
09/10

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微生态
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葛根芩连汤(GQD)作为治疗急性肠炎腹泻的有效药物,已有2000多年的历史。




编译:微科盟大陈子,编辑:微科盟汤貝、江舜尧。

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导读    
葛根芩连汤(GQD)作为治疗急性肠炎腹泻的有效药物,已有2000多年的历史。然而,GQD保护溃疡性结肠炎(UC)肠道屏障的潜在分子机制尚不明确。肠道微生物群作为结肠内稳态的重要组成部分,与周围环境的动态演变和膳食结构的调整密切相关。目前,加味葛根芩连汤在不同饮食环境下对UC的疗效及机制尚不清楚。选取加味葛根芩连汤的主要活性成分(PBM),构建合理有效的复方方案。采用“5%葡聚糖硫酸钠(DSS)”和“高温高湿+高糖高脂+酒精+5%DSS”分别在普通环境和岭南地区建立UC大鼠模型。我们考察了PBM(89.96 mg/kg和179.92 mg/kg)对两种UC大鼠的治疗作用。通过肠道菌群消耗和粪便菌群移植(FMT)试验确定了肠道菌群在PBM抗UC的作用。随后,我们分别采用16SrDNA技术和靶向代谢组学技术检测大鼠结肠内肠道微生物群和粪便代谢的变化。结果发现,PBM治疗组和FMT治疗组大鼠的结肠炎症均有明显缓解,其表现为在体重减轻、血便、腹泻、疾病活动指数(DAI)评分方面的降低、结肠长度缩短、结肠组织学损伤减少。有趣的是,肠道菌群的减少剥夺了PBM的保护作用,证实了肠道菌群在PBM抗UC作用中的重要性。这表明PBM不仅可以通过增加AkkermansiaRomboutsia来调节肠道菌群,而且可以减少大肠杆菌志贺氏菌。更重要的是,PBM能增加结肠炎大鼠丙酸和总短链脂肪酸(SCFAs)的产生,调节中长链脂肪酸(M-LCFAs),维持胆汁酸(BAs)稳态,调节氨基酸(AAs)代谢。肠道环境的改变可能与结肠黏膜抗炎、抗氧化和紧密连接蛋白表达上调有关。综上所述,PBM通过肠道微生物依赖显示出抗UC活性的潜力,有望成为一种补充和替代药物的草药疗法。  

 

论文ID


 

名:Main active components of Jiawei Gegen Qinlian decoction protects against ulcerative colitis under different dietary environments in a gut microbiota-dependent manner

加味葛根芩连汤主要活性成分对不同饮食环境下溃疡性结肠炎具有肠道微生物依赖性的保护作用

期刊Pharmacological Research

IF:7.658

发表时间:2021.6.2

通讯作者:司红彬

通讯作者单位:广西大学动物科学技术学院


实验设计



结果


1. PBM治疗改善了DSS诱导的结肠炎
为验证 PBM 对炎症性肠病(IBD)的治疗作用,采用DSS诱导大鼠结肠炎模型。PBM治疗组从第20天开始给予不同剂量的PBM。所有UC大鼠从第23天开始随机饮用含5%DSS水7天,观察不同剂量PBM对两种UC大鼠的影响(图1A)。DAI是评价UC严重程度的重要指标。低DAI评分表明体重减轻、粪便性状和出血改善,这表明结肠炎预后良好。与模型组比较,PBM组明显改善DSS引起的结肠炎,如肛门温度降低(图1B)、体重明显减轻(图1C)、腹泻减少、血便次数减少、DAI评分降低(图1D)、结肠缩短减轻(图1E)、结肠黏膜出血改善等。PBM给药后黏膜水肿明显减轻,溃疡面积缩小,出血点减少,CMDI评分降低与上述临床症状呈现一致趋势(图1F)。应用Hype染色系统评估结肠黏膜损伤程度。DSS引起结肠隐窝丢失、肠腺变形、杯状细胞破坏、黏液减少、单核细胞浸润、组织学损伤评分高等现象,岭南大鼠表现更为明显(图1G)。与模型组比较,PBM治疗组结肠腺体和杯状细胞相对完整,肠上皮损伤程度较轻,组织学评分较低。这些结果表明PBM对结肠炎有一定的保护作用,PBM能够维持黏膜超微结构的完整性。为了进一步证实这一推断,本研究评估了结肠屏障的完整性、氧化应激反应和结肠组织中细胞因子的变化。
 
1 PBM治疗改善DSS诱导的实验性结肠炎。(A)模型制备的两种方法。UC大鼠口服DSS7d。岭南UC大鼠连续给予湿热因子和/或DSS治疗29d。1:对照组(control),2:UC模型组(DSS),3:UC采用PBM高剂量组(DSS+PBMH),4:UC采用PBM低剂量组(DSS+PBML),5:岭南UC大鼠采用美莎拉嗪组(DH-DSS+MS);6:岭南UC大鼠模型组(DH-DSS);7:用PBM高剂量组(DH-DSS+PBMH)处理岭南UC大鼠;8:岭南UC大鼠采用PBM低剂量组(DH-DSS+PBML)。(B)DSS诱导期直肠温度的变化。(C)DSS诱导期体重变化。(D)DSS诱导期DAI。(B-D):●对照组(Control);■UC模型组(DSS );▲ UC组给予PBM高剂量组(DSS+PBMH);▼UC组给予PBM低剂量组(DSS+PBML):★岭南UC大鼠给予美沙拉嗪治疗(DH-DSS+MS);□岭南UC大鼠模型组(DH-DSS);△岭南UC大鼠治疗PBM高剂量组(DH-DSS+PBMH);▽用PBM低剂量组(DH-DSS+PBML)治疗岭南UC大鼠。(B-D)有代表性的数据n=5组,平均SD。(E)这里显示的结肠长度是从肛门中取出来的。图片显示各组第30天的结肠长度(cm)。红色箭头表示特定长度。(F)结肠黏膜外观及CMDI。红色箭头表示结肠的水肿、粘连、溃疡和出血部位。粘连(-~++):0-2;溃疡和炎症(-~++++++):0-10。(G)根据H&E染色对结肠黏膜进行病理评分。红色箭头表示杯状细胞失去粘液。黄色矩形所示的肠腺缺失;蓝色箭头所示肠上皮形态异常。绿色箭头表示炎性细胞浸润;黄色箭头表示肠上皮空泡。

2. PBM改善DAA诱导的结肠炎肠道通透性
肠黏膜屏障是抵御病原菌和外来物质入侵的重要防线,其破坏是 IBD发生的基础。DAO位于肠黏膜上层绒毛上皮细胞的胞浆内。D-乳酸是由肠道共生菌厌氧糖酵解产生,通常存在于肠道内。正常情况下,血清中DAO和D-乳酸含量极少。当肠上皮细胞受损时,肠黏膜中的DAO和肠腔中的D-乳酸通过损伤部位进入血液,因此血清DAO和D-乳酸水平可作为评估肠屏障损伤的理想指标。因此,我们检测了大鼠血清中DAO、D-乳酸以及结肠组织中ZO-1的变化。UC大鼠和岭南地区UC大鼠血清中DAO活性(图2A)和D-乳酸活性(图2B)显著升高,结肠中ZO-1表达降低(P<0.05)(图2C),证实了两种UC模型的肠黏膜屏障和通透性的变化。PBM可显著降低两种UC大鼠血清中DAO和D-乳酸的活性,增加结肠组织中ZO-1的表达。我们同时证实PBM对UC小鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的影响。免疫组化和Westernblot结果显示,DSS组ZO-1和Occludin的表达量显著低于对照组(P<0.05)(图2D)。PBM治疗显著提高DSSFMT组的ZO-1和Occludin水平(P<0.05)(图2D-CE)。总之,PBM对UC的改善与保护肠屏障的完整性有关。
 
图2 PBM治疗可改善DSS诱导结肠炎的结肠黏膜通透性。(A-C)通过检测血清DAO、D乳酸、结肠ZO-1水平的变化。(D)各组ZO-1和Occludin免疫组化(100)。(E)Occludin蛋白的代表性免疫印迹。A:每组n=3只,(B-C):每组n=9~18只,(D-E):每组n=3只,显示平均值±标准差,采用单因素方差分析计算P值,然后采用Dunnett’s T3检验,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
 
3. PBM可降低两种结肠炎的氧化应激反应促进抗氧化活性
氧化应激与包括结肠炎在内的各种炎症性疾病的进展有关。氧化应激与抗氧化之间的失衡是影响UC严重程度的重要因素。MDA是脂质过氧化的标志。MDA通过变性交联作用破坏膜蛋白,使膜蛋白不能作为受体或酶使用。NO通过修饰蛋白质和脂质参与氧化还原信号。氧化应激产生过量的活性氧(ROS),而NO和ROS之间的相互作用会导致多种活性氮(RNS)的产生,增加细胞的损伤。我们发现两种UC大鼠的MDA和NO活性明显高于对照组(图3A,图3B),这可能表明了氧化损伤的程度。过量ROS的清除主要依赖于CAT、GSH、GST、SOD和CK。为了证实PBM对DSS诱导大鼠结肠炎模型氧化应激的干预作用,我们检测了大鼠结肠组织中MDA、SOD、NO、CK、CAT、GSH、GST的含量。结果发现,口服PBM(128.65 mg/kg和257.30 mg/kg)能够显著降低氧化应激,降低MDA和NO活性,增加CAT(图3C)、SOD(图3D)、GSH(图3E)和GST(图3G)活性,且呈剂量依赖性。PBM高剂量(257.30 mg/kg)效果最好,可能与PBM通过上调抗氧化作用减轻结肠上皮细胞生物膜损伤有关。
 
3 PBM治疗可抑制结肠炎的脂质过氧化,提高机体的抗氧化能力。(A)MPO;(B)MDA;(C)NO;(D)CAT;(E)SOD;(F)GSH;(G)CK;(H)GST;(I)溶菌酶。(A-I)n=每组3只大鼠,显示平均值±标准差,采用单因素方差分析计算P值,然后采用Dunnett’s T3检验,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。数据来源于三个独立的实验,每组n=8只大鼠。
 
4. PBM通过调节细胞因子的表达来调节DSS诱导的结肠炎中的结肠炎症
目前普遍认为UC存在肠黏膜炎症免疫耐受紊乱,肠黏膜免疫反应异常激活是UC发生发展的直接因素。感染或损伤过程中会产生高浓度的趋化因子,趋化因子往往导致炎症性白细胞向损伤区迁移,起到炎症归巢的作用。我们观察到CXCL1在两种UC大鼠中表达增加,推测在结肠可能发生中性粒细胞浸润(图4A)。MPO是一种存在于中性粒细胞中的酶,其活性与炎症区中性粒细胞的浓度成正比。MPO活性的增加是中性粒细胞浸润和炎症的指标,溶菌酶也是中性粒细胞胞质中的一种水解酶。在本研究中,两种UC模型大鼠MPO(图4B)和溶菌酶(图4C)活性的增加与杯状细胞和固有层的丢失、毛细血管充血、粘膜下水肿、炎症细胞浸润、出血和坏死溃疡的出现有关。与结肠组织HE染色结果一致(图4D)。脂质过氧化刺激IBD中炎症介质和细胞因子的释放,引起肠道全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征。已知MIP-1α和MIP-1β是招募多形核白细胞和巨噬细胞不可或缺的中介。在本研究中,IFN-γ通过脂质过氧化刺激巨噬细胞释放(图4E)。MIP-1α可特异性驱动单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞向炎症区增殖和迁移(图4F),并诱导TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的释放。这些促炎因子诱导肠黏膜循环紊乱,并协同IL-17A放大炎症效应,破坏肠上皮层,导致两种UC大鼠肠黏膜局部溃疡。
为了研究PBM对两种环境(正常/岭南)下DSS介导的UC大鼠结肠细胞因子表达的影响。如图4E-K所示,我们检测各组大鼠结肠组织中IL-6、IL-1β、il-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和CXCL1的变化。有研究表明,GQD可下调炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ。我们的结果与这些研究一致。PBM还能下调两种UC大鼠结肠中IL-17A的表达。IL-10控制肠道内微生物和食物抗原的慢性刺激,维持免疫系统的平衡,因此被认为是人类最重要的抗炎细胞因子之一。IL-10可抑制促炎细胞因子如TNF-α(图4G)、IL-6(图4H)、IL-1β(图4I)和IL-12的分泌,使巨噬细胞失活并控制巨噬细胞、T细胞和B细胞的分化和增殖,抑制Th1/Th17的致病反应,而Th1/Th17对肠道稳态至关重要,防止过度免疫反应和组织损伤。实验数据显示,PBM可明显上调正常和岭南环境下结肠炎中IL-10水平(图4L),下调MIP-1α(图4F)、MIP-1β(图4K)和CXCL1水平(P<0.05)。综上所述,PBM治疗显著改善了DSS诱导的两种结肠炎。然而,PBM保护结肠黏膜屏障的机制尚不完全清楚。鉴于肠道菌群已成为IBD的新靶点,而PBM通过胃肠道给药,下一步研究的重点将是肠道微生物群。

4 PBM治疗改变了结肠炎大鼠细胞因子的表达。(A)CXCL1,(B)MPO,(C)溶菌酶,(D)苏木精和伊红(H&E)结肠染色,UC大鼠和岭南UC大鼠DSS给药后可见大量中性粒细胞浸润。(E)ELISA检测各组结肠组织匀浆中IFN-γ、(F)MIP-1α、(G)TNF-α、(H)IL-6、(I)IL-1β、(J)IL-17A、(K)MIP-1β和(L)IL-10细胞因子水平。(A-I)每组n=9~18只,显示平均值±标准差,采用单因素方差分析计算P值,然后采用Dunnett’s T3检验,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
 
5. PBM以肠道依赖的方式减轻结肠炎
本研究采用四联抗生素混合制剂提前5天清除小鼠肠道菌群。值得注意的是,PBM的保护作用似乎在小鼠肠道菌群耗尽时消失,ABX(DSS)组和ABX(DSS+PBM)组的死亡率(图5B)、DAI评分(图5C)、体重减轻(图5D)、结肠长度和大体病变(图5E)以及结肠组织学变化(图5F)无显著性差异,表明PBM依赖肠道菌群在DSS诱导的结肠炎中发挥保护作用。

 图5 (A)给药形式(B)死亡率(C)疾病活动指数(D)体重变化(E)结肠长度和结肠黏膜宏观损伤程度(F)结肠组织学变化;ABX:清除肠道菌群组;ABX(DSS):抗生素UC模型组;ABX(DSS+PBM):抗生素UC模型治疗组;(n=6)。
 
6. FMT证实PBM通过调节肠道菌群保护结肠黏膜的完整性
预先收集 PBM处理的UC小鼠的粪便,并将其冷冻在-80℃冰箱中。将它们分别移植到有或无肠道菌群清除的小鼠体内。结果表明,FMT后小鼠死亡率显著降低(图6B),DAI评分显著降低(图6C),体重减轻程度显著降低(图6D)(P<0.05)。与模型组相比,FMT小鼠结肠挛缩明显改善,黏膜损伤较小(图6E)(P<0.05),HE染色组织学损伤较轻,炎性细胞浸润较轻(图6F)(P<0.05)。因此,PBM通过调节肠道微生物群来改善结肠炎症。然而,PBM对结肠肠道菌群的具体影响尚未被很好地了解。
 
图6 FMT减少结肠炎的炎症。(A)给药形式;(B)死亡率;(C)DAI;(D)体重变化;(E)结肠长度和结肠粘膜宏观损伤程度;(F)结肠的组织学变化;对照:空白组;DSS:UC模型组;[ABX(DSS+FMT)]:抗生素FMT组;(DSS+FMT):粪便细菌移植组(n=6)。
 
7. PBM处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成
为了确定PBM处理是否改变了菌群,我们对两种UC大鼠粪便细菌DNA中的16S rDNA进行了高通量基因测序。Pan/Core曲线显示了所有样本中共有/核心物种的数量,达到了平台的曲线表明测序样本量合理达到标准(图S1A~B)。基于Shannon多样性指数和Chao多样性指数的稀释曲线如图S1所示,表明本研究采集的样本测序数据量充足(图S1C~D)。为了鉴定肠道菌群的丰富度和多样性,我们对5组粪便样品的α-多样性和β-多样性进行了评价。基于OTUs的不同指标,包括Sobs、Chao、Shannon、 Ace 、Coverage和Simpson,均显示出DSS降低普通大鼠和岭南大鼠结肠微生物α-多样性具有相似趋势(表S1)。而PBM处理可以扭转这种现象。我们采用ANOSIM对五组间主成分分析(PCA)的差异进行分析(图7A),并对五组间基于bray-curtis距离的PCoA进行分析。以上两种方法表明,两个模型组与对照组是分开采集的,说明这些样品在成分结构上是不同的(图7B)。与模型组相比,PBM处理组的细菌组成更接近于对照组。
为了进一步研究五组样本在群落组成上的差异,我们采用了一系列可视化方法,如韦恩图(图7C)、柱状图(图7D)、热图(图7E)和圆图(图S1G),直接评价UC大鼠的群落组成和PBM对肠道微生物的影响。如图5C所示,5组共有370个OTU重叠,对照组673个OTU,DSS组631个OTU,DSS+PBMH组701个OTU,DH-DSS组516个OTU,DH-DSS+ PBMH 组604个OTU(图7C)。在属水平上,对照组和DSS+PBMH组主要由RomboutsiaAllobaculumLactobacillusLachnospiraceae-NK4A136组成,而DSS组主要由Escherichia-ShigellaRomboutsiaBacteroidesLactobacillus组成。DH-DSS组主要由Escherichia-ShigellaAllobaculumSubdoligranulum组成。DH-DSS+PBMH组主要由Escherica-ShigellaBacteroidesNorank-f-MuribaculaceaeMegamonas组成(图7D)。通过可视的圆图可以了解五组中丰度大于1%的细菌的具体分布比例(图S1G)。Escherichia-Shigella丰度由高到低依次为DH-DSS+PBMH组、DH-DSS组、DSS组、DSS+ PBMH组和对照组。 Bacteroides 的丰度由高到低分别为DSS组、DH-DSS+PBMH组、DSS+PBMH组、DH-DSS组和对照组,说明PBM可能对Bacteroides有双向调控作用。根据属水平的OTU丰度,对丰度排名前20位的菌种和样本进行分级聚类和热图,以分析5组间的肠道菌群。我们发现,在一般环境下,3组样品中的Lachnospiraceae-NK4A136度相对较高,而在湿热环境下,2组样品中的Escherichia-Shigella显著富集,这与之前的柱状图和圆图分析结果一致。
我们采用 LEfSe 对高维类别进行比较,发现5组间细菌群落优势度存在显著差异。分析结果显示,BacteroidetesPEscherichiacoli-Shigella是导致DSS组肠道菌群失衡的关键菌型。DSS+PBM组中Desulfovibrionaceae属的LDA评分最高,为4.34(P=0.0387),这可能与PBM介导的结肠炎缓解有关(图7F)。AllobaculumEscherichiacoli-Shigella是导致DH-DSS组肠道菌群失衡的关键细菌类型。而BacteroidesMegamonasBlautia、Akkermansiaceae和Erysipelatoclostridiaceae在DH-DSS+PBMH组中相对富集(图7cG)。其中,Bacteroides的LDA得分最高,为4.7(P=0.0127),Erysipelatoclostridiaceae的LDA得分最低,为4.0(P=0.0001)。
为了验证PBM治疗后哪些细菌发生了明显变化,进而影响了结肠炎的病情进展。我们采用Wilcoxon秩和检验和双尾检验进行两两比较,比较5组之间的物种丰度差异。差异显著性检验用FDR对多重检验进行校正,用bootstrap0.95计算置信区间。结果发现,PBM能有效降低UC大鼠结肠中BacteroidesEscherichia-Shigella的丰度,增加MonoglobusNorank-f-norank-o-Clostridia-UCG-014Colidextribacter的丰度(P<0.05)(图S2)。PBM显著增加了BacteroidesMegamonasBlautiaAkkermansiaErysipelatoclostridiumRoseburia的群落丰度,降低了Allobaculum、[Ruminococcus]-gauvreauiiRomboutsia的群落丰度(P<0.05)。PBM减少Escherichia coli-ShigellaP<0.05)(图S1I)。这与LEfSe分析的结果一致。总体而言,PBM处理显著改变了肠道菌群的多样性和组成。
 

图7 IlluminaMiSeq测序数据评价表明PBM调控肠道菌群的整体结构。(A)不同实验组在属水平上的细菌组成;(B)不同实验组在OTU水平上细菌组成的相似性和差异性;(C)属水平群落热图;(D)采用ANOSIM分析五组间PCA的差异;(E)基于五组间的PCoA。每个符号代表一只老鼠。差异分析方法与PCA一致。(F)对照组、DSS组、DSS+PBMH组,通过LDA的支链图和分布直方图分析各组优势微生物的差异。(G)对照组、DH-DSS组、DH-DSS+PBMH组。

8. PBM处理增加了代谢物SCFAs
在这项研究中,我们给一些大鼠提供了高脂肪和高糖的饮食。据报道,脂质摄入与TG/HDL_C水平相关。为了明确该饮食引起的变化及PBM的干预效果,我们检测了几个与高脂血症相关的因素(表S2),如TG、CHOL、HDLC、LDL_C、GLU。结果显示,一般环境下大鼠的TG、CHOL、HDL_C、LDL_C和GLU水平无显著差异。而在湿热环境下DH-DSS组大鼠血清中TG、CHOL、HDL_C、LDL_C含量显著高于对照组,提示岭南UC大鼠存在高脂血症。GQD通过调节脂肪细胞PPARα和PPARγ信号系统来维持糖脂代谢平衡,以产生抗糖尿病作用。我们的实验结果显示,PBM通过降低岭南大鼠血清中TG、CHOL、HDL_C和LDL_C的含量来调节血脂水平,这与前人报道一致。高糖高脂饮食增加了合成脂肪酸的原料数量,包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、乙酰辅酶A和三磷酸腺苷(ATP),有利于脂肪酸的合成。脂肪酸按碳链长度分为SCFAs、MCFAs和LCFAs。
短链脂肪酸是肠道菌群的代谢产物,在维持肠道正常形态和功能方面起着重要作用。一方面,SCFAs为肠上皮细胞提供能量,维持水电解质平衡。另一方面,抑制炎症,维持肠上皮的屏障功能。肠道菌群通过肠道菌群-宿主共代谢影响宿主IBD的状态。我们之前已经证明了PBM对肠道菌群的调节作用。为了进一步证实改变的细菌群落是否对微生物SCFAs的代谢产生影响,我们采用靶向代谢组学评估结肠内容物中SCFAs的浓度(表S3)。我们发现UC模型组和PBM处理组的SCFAs谱显著不同(图8A)。其中,DSS组结肠丙酸、丁酸、乙酸、己酸、异己酸和总短链脂肪酸含量显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,岭南UC大鼠结肠中8种SCFAs和总SCFA含量均显著降低(P<0.05)。与UC大鼠相比,PBM能显著提高大鼠结肠中丁酸、丙酸、己酸、异己酸和总短链脂肪酸的含量(P<0.05)。与岭南UC大鼠相比,PBM可显著提高大鼠结肠丙酸和总SCFA含量(P<0.01)。
然后,我们使用Spearman相关分性析来确定改变的肠道菌群和SCFAs之间的潜在关系。我们的结果揭示了肠道菌群和SCFAs之间的存在一些重要关联。如图6C所示,乙酸、丁酸、丙酸和总SCFAs与RoseburiaLachnospiraceae_NK4A136呈正相关,而与Ruminococcus_gauvreauiiAllobaculumLachnoclostridiumEscherichia-Shigella呈负相关。
 

图8 PBM上调SCFAs以加强肠黏膜屏障。(A)GC-MS法检测结肠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸等SCFAs的含量;(B)不同剂量PBM喂养UC大鼠不同结肠粪便中总SCFAs含量;(C)热图显示几个显著变化的粪便短链脂肪酸和属细菌之间的Spearman相关系数,P<0.05。红色代表正相关,蓝色代表负相关。
 
9. PBM处理改善MCFAs代谢
MCFAs是含有7-12个碳原子的饱和脂肪酸。众所周知,MCFAs可以改善肠道微生物的结构。除了作为一种能量物质,MCFAs还具有抗菌和消炎作用。检测大鼠结肠内容物中MCFAs的浓度(表S4)。DSS+PBMH组癸酸、十一酸、月桂酸浓度略高于DSS组,但差异无统计学意义(P<0.05)。DS-DSS+PBMH组的十一酸显著高于DS-DSS组(P<0.001)(图9A)。
我们同样使用Spearman相关分析来确定改变的肠道菌群和MCFAs之间的潜在关系。我们的结果揭示了肠道菌群和MCFAs之间的一些重要关联。如图9B所示,十一酸和月桂酸与Roseburia呈正相关,与Allobaculum呈负相关。此外,十一酸与MegamonasNorank_f_DesulfovibrionaceaeBlautia呈正相关,与AlloprevotellaRomboutsia呈负相关。
 

图9 PBM调节MCFAs增强肠道黏膜屏障。(A)通过气相色谱-质谱联用法检测结肠粪便中MCFAs的确切含量,包括辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)、癸酸(C11:0)、月桂酸(C12:0);(B)显示Spearman相关系数的热图,几个显著变化的粪便MCFA和属细菌之间的P<0.05。红色代表正相关,蓝色代表负相关。
 
10. PBM处理改善LCFAs代谢
LCFAs是含有超过12个碳原子的脂肪酸。结肠游离脂肪酸受体1和游离脂肪酸受体4可被LCFA特异性激活,可作为IBD的药物靶点。不同种类的LCFAs对IBD肠道炎症有双重作用。它们通过促进或抑制TLR/NOD信号通路,影响促炎转录因子NF-κB和抗炎转录因子PPAR-γ之间的平衡来保护或抑制肠道屏障。
我们测定大鼠结肠内LCFAs含量(表S4)。与DSS组相比,DSS+PBMH 组油酸盐含量显著升高,亚麻酸浓度显著降低(P<0.05)。与DH-DSS组比较,DH-DSS+PBMH组结肠中十七酸酯、 芥酸、 γ-亚麻酸和神经酸酯浓度升高(P<0.01)。
我们使用Spearman相关分析来确定改变的肠道菌群和LCFAs之间的潜在关系。我们的结果揭示了肠道菌群和LCFAs之间的一些重要关联。如图10C所示,十七酸与BlautiaAkkermansiaSubdoligranulumRuminococcus_torques呈正相关,与Alloprevotella呈负相关。油酸与Escherichia-ShigellaBacteroides呈负相关,与Lachnospiraceae_NK4A136呈正相关。linnoelaidateLachnospiraceae_NK4A136呈负相关。芥酸与BlautiaDobosiella呈正相关,与BacteroidesLactobacillus负相关。神经酸酯与AllobaculumDobosiellaRuminococcus_gauvreauii呈正相关,与BacteroidesLactobacillusMegamonasnorank_f_Desulfovibrionaceae呈负相关。
 

图10 PBM上调LCFAs以加强肠黏膜屏障。(A)GC-MS法检测的结肠粪便中35个LCFAs的含量;(B)不同剂量PBM喂养UC大鼠不同结肠粪便中总LCFAs;(C)热图显示几个显著变化的粪便长链脂肪酸和属细菌之间的Spearman相关系数,P<0.05。红色代表正相关,蓝色代表负相关。

11. PBM处理改善BAs代谢
肝损害是UC常见的并发症。检测两种UC大鼠血清中ALP、LDH、ALT、AST的浓度(表S5),证实PBM对两种UC大鼠肝脏损伤及改善作用。初级胆汁酸由胆固醇构成。岭南UC大鼠高胆固醇有利于初级BAs的合成。次级BAs需要通过肠道细菌的转化产生,因此菌群紊乱可能会影响次级BAs的合成。基于以上两点,我们使用靶向代谢组学评估肝脏中BAs浓度(表S6)。与DSS组相比,DSS+PBMH组鹅去氧胆酸(CDCA)含量升高,去氧胆酸(DCA)含量降低(P<0.05)。DH-DSS+PBMH组牛磺胆酸(TMCA)和DCA浓度低于DH-DSS组(P<0.05)。
我们使用Spearman相关分析来确定肠道菌群改变与BAs之间的潜在关系。我们的结果揭示了肠道菌群和BAs之间的一些重要联系。如图11D所示,T-MCA与Escherichia-ShigellaSubdoligranulumDobosiellaLachnoclostridium呈正相关,而与RoseburiaPrevotellaLactobacillus呈负相关。DCA与Escherichia-Shigella正相关,与Norank_f_DesulfovibrionaceaeRoseburia负相关。CDCA与Lachnospiraceae_NK4A136正相关,与Norank_f_Muribaculaceae负相关。
 

图11 PBM通过BA代谢调节湿热环境引起的血脂异常。(A)LC-MS法检测五组肝脏中23个BAs的含量动态变化;(B)各组UC大鼠不同肝脏中总初级胆汁酸和次级胆汁酸含量;(C)不同剂量PBM喂养UC大鼠不同肝脏的总次级BAs;(A-C)数据显示为显示平均值±标准误(n=8),ns表示差异不显著。(D)热图显示Spearman相关系数,几个显著变化的肝胆汁酸和属细菌之间P<0.05。红色代表正相关,蓝色代表负相关。
 
12. PBM处理改善了AAs代谢
肠道菌群可调节并参与肠道AAs的代谢,调节氨基酸可减缓结肠炎的发展。为了确定PBM是否干扰肠道AAs代谢,我们采用LC-MS评价结肠内容物中AAs浓度(表S7)。PBM对结肠内AAs代谢有干预作用,主要体现在PBM对一般环境下UC的影响。PBM降低UC大鼠精氨酸(Arg)含量,增加酪氨酸(Tyr)含量(P<0.05)。PBM对岭南UC大鼠AAs代谢无显著影响。PBM增加了两种UC大鼠结肠中支链氨基酸(BCAA)和芳香族氨基酸含量,但无统计学意义(P>0.05)。总的来说,PBM治疗后UC大鼠 的氨基酸代谢水平有可能恢复到与健康大鼠相似的状态。
我们使用Spearman相关分析来确定肠道菌群改变与BAs之间的潜在关系。我们的结果揭示了肠道菌群和BAs之间的一些重要联系。如图12C所示,Arg与Escherichia-ShigellaSubdoligranulumLachnoclostridium呈正相关,而与Lachnospiraceae_NK4A136呈负相关。Tyr与Lachnospiraceae_NK4A136正相关,与Escherichia-Shigella负相关。

图12 PBM通过胆汁酸代谢调节湿热环境引起的血脂异常。(A)采用HPLC法检测5组结肠粪便中22种AAs的含量动态变化;(B)不同剂量PBM喂养UC大鼠的总AAs;(C)热图显示Spearman相关系数,几个显著变化的粪便AAs和属细菌之间P<0.05。红色代表正相关,蓝色代表负相关。

讨论


UC的主要病理改变是乙状结肠和直肠黏膜及黏膜下层的炎性病变。本研究中DSS诱导的结肠炎模型与UC疾病的病理改变一致。随后,我们采用“高脂高糖饮食+饮酒+饥饱交替+湿热气候”的复合因子模拟岭南地区的饮食环境,再经5%DSS诱导成功构建岭南地区UC大鼠。结果表明,PBM对DSS诱导的结肠炎症有明显的保护作用,表现为降低肛温、减轻体重、腹泻率、缩短结肠长度、DAI评分,降低CMDI评分和组织学评分。此外,我们还研究了PBM通过抗氧化、抗炎和降低结肠通透性来减轻两种UC大鼠的结肠炎症,且呈剂量依赖性。最重要的是,我们通过肠道细菌清除和FMT实验证明PBM能以肠道依赖的方式减轻结肠黏膜损伤。PBM处理后肠道微生物多样性和区系组成更加丰富,有利于SCFAs的产生,调节M-LCFAs、AAs和BAs的代谢,从而改善结肠黏膜屏障。我们的数据支持PBM有望成为一种通过肠黏膜屏障修复预防和治疗IBD的潜在自然疗法。
肠黏膜屏障是结肠内抵御病原体和外来物质入侵的重要防线,维持着机体的稳态。肠黏膜屏障包括机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障。导致肠黏膜屏障损伤的因素包括肠通透性增加、氧化应激的过度激活和肠道细菌的易位。值得注意的是,我们在抗炎和抗氧化方面的许多研究结果,包括MDA、NO、SOD、GSH、MPO、TNF-、IL-6、IL-17和IL-1β,与之前的报道一致。此外,我们的研究也拓宽了对GQD抗氧化和抗炎作用的已有认识,即PBM可获得CAT、GST和IL-10,以及抑制CXCL1、MIP-1α和MIP-1β。
肠道菌群包括共生菌、益生菌和致病菌,对人体健康起着重要作用。如果将侵入性抗原引入机体,激活免疫细胞和产生细胞因子,肠道菌群的平衡会被破坏。多项研究发现IBD群体具有相似的肠道微生物变化模式,包括微生物多样性下降,IBD的严重程度与Proteobacteria(Enterobacteriaceae)的相对增加以及ClostridiumAkkermansia的相对减少密切相关。与上述报道一致,在我们的研究中,两种UC大鼠呈现出微生物多样性下降,而Escherichia-Shigella增加的情况。根据既往报道,GQD显著增加了急性肠炎大鼠Akkermansia的数量,减少了Clostridium_sensu_stricto_1的数量。葛根芩连汤对肠湿热证腹泻小鼠的LactobacillusBifidobacterium有促进作用。因此,我们假设PBM通过肠道菌群干扰不同的生理过程来维持宿主肠道稳态。
肝-微生物-代谢轴是UC治疗的未来发展方向。肠道中的生物活性代谢物可以直接从膳食或细菌或宿主来源的底物转化而来,包括SCFAs、支链脂肪酸(BCFAs)、BCAAs、色氨酸和次级胆汁酸。代谢物之间存在相互作用,创造出独特的肠道代谢环境。例如,SCFA介导的G偶联受体43(GPR43)的激活,其可以抑制脂肪细胞中的胰岛素信号传导并减少脂肪积累。岭南地区UC大鼠血脂异常。众所周知,脂质摄入影响脂肪酸和BA的合成,BA促进脂质的消化和吸收。而肝病是UC的常见并发症。血清生化结果表明普通UC大鼠和岭南UC大鼠存在肝功能损害。肝脏与菌群和代谢物似乎没有联系,但肝细胞分泌的初级胆汁酸需要通过肠道菌群转化为次级胆汁酸。宿主菌群与代谢产物相互作用调节肠道环境。我们进一步推测PBM可能通过细菌组分与脂肪酸、AAs和BAs之间的代谢网络干预肠黏膜屏障损伤。为此,我们采用“微生物组学+靶向代谢组学”的策略,寻找可能发生改变的菌群和代谢物。这种方法对于揭示细菌成分与肠道中复杂代谢网络之间的关系具有很大的潜力。
我们以前注意到PBM给药组增加了产生SCFA的细菌的相对丰度,例如RoseburiaAkkermansiaClostridium。SCFA参与维持肠上皮屏障功能,改善葡萄糖和脂质代谢,调节肠道基因表达,改善肠道微生态平衡,抑制癌细胞和肠道炎症反应。因此,我们通过GC-MS准确定位了SCFAs的含量。与预期的一样,PBM确实增加了UC大鼠肠道内SCFAs的数量。之前的一项研究也报道了这一发现。我们的相关分析显示,乙酸、丁酸、丙酸和总SCFAs与RoseburiaLachnospiraceae_NK4A136呈正相关。这说明Lachnospiraceae_NK4A136Roseburia有助于PBM处理组粪便中SCFA的增加,这一观点得到了前期研究的支持。
不同长度脂肪酸对IBD的影响不同。我们发现PBM促进了结肠中MCFAs的产生。十一酸酯具有良好的抑菌活性和抗生物膜活性。月桂酸具有降低氧化应激和调节巨噬细胞的潜力。这可能是PBM减轻岭南UC大鼠肠道炎症的潜在因素之一。亚麻酸属于多不饱和酸,易被氧化产生活性氧和氢过氧化物,对Caco-2细胞造成损伤。此外,亚麻酸在IBD人群中也表现出丰富。在本研究中,PBM降低了UC结肠中亚麻酸酯的含量,增加了反亚麻酸酯的含量。
虽然有报道称反式不饱和脂肪酸可以激活巨噬细胞内的NLRP3炎症小体,加剧小鼠肠道炎症。PBM仅在结肠中恢复与对照组相同水平的反油酸脂。我们的研究发现PBM增加了岭南UC大鼠的十七酸、γ-亚麻酸和神经酸含量。结肠是一个细菌、真菌和寄生虫共存的复杂环境,十七酸酯显示出抗真菌代谢潜力。一项研究表明,神经酸能增加肝脏PPARα和PGC1α的表达,改善酰基肉碱的分布和高脂饮食小鼠的代谢参数。在其他几项研究中,γ-亚麻酸填补了高不饱和脂肪酸(HUFA)的减少,平衡阿霉素引起的大鼠心肌细胞损伤。这些发现似乎说明了γ-亚麻酸对身体有益。我们推测PBM可能通过这些脂肪酸的变化来维持肠道稳态。
在本研究中,我们发现了一个有趣的现象,即结合胆汁酸是大鼠肝脏中的优势物种,无论饮食、环境差异或身体健康(是否有IBD)。岭南地区饲喂高脂高糖饲料的大鼠肝脏胆固醇升高,有利于初级胆汁酸的合成。我们的研究结果,TMCA的增加,也支持这一理论。在最近的一项研究中,GQD显著降低血清TG、CHOL和总胆酸(TBA),并通过抑制TLR4信号通路的抗氧化应激和抗炎反应,减轻Nash相关的肝损伤。我们的研究也支持GQD在降低血脂和减轻肝功能损伤方面的作用。原发性硬化性胆管炎(PSC)患者血清CDCA浓度降低。CDCA激活胱硫氨酸-γ-裂解酶(CSE)产生硫化氢,削弱了二硝基苯磺酸(DNBS)诱导的大鼠结肠炎的氧化应激反应。PBM补充了降低的CDCA浓度。
DCA是一种疏水二级胆汁酸。过量的DCA会破坏肠道上皮细胞的完整性,对机体健康造成不良影响。肠中的DCA可能通过肝肠循环储存在肝脏中,导致肝细胞损伤。我们的结果显示,PBM降低了普通UC大鼠肝脏中DCA的含量,增加了CDCA的浓度。PBM可降低湿热证UC大鼠肝脏中牛磺酸胆酸(T-MCA)和DCA的含量,提示PBM可降低DCA引起的UC细胞毒性。在肠肝循环中,肠道菌群引起胆酸(CA)和CDCA的7α-脱羟基化,分别产生DCA和石胆酸。因此,BAs可用于评价UC患者肠道菌群的变化。我们的分析显示,PBM处理组Lachnospiraceae_NK4A136有利于CDCA的形成,而Roseburia抑制T-MCA和DCA的形成。这些结果表明,PBM可以维持肝脏中BA代谢的平衡。
前人的研究表明,GQD可显著改善2型糖尿病大鼠的脂质代谢、AA代谢和肠道微生物代谢紊乱。AA可降低IBD中氧化应激的生物学反应。Tyr是芳香族氨基酸之一。我们的数据表明,PBM可以有效提高UC大鼠肠道Tyr的浓度。脑-肠轴在IBD肠道炎症中起关键作用。多巴胺能系统的损害似乎是IBD发病机制的一个特征。我们推测PBM通过Tyr修复多巴胺损伤系统,并在UC中发挥有益作用。PBM对色氨酸的促进作用呈上升趋势。肠道细菌代谢物与芳香烃受体AHR联合激活相关免疫细胞和信号转导,减轻肠道炎症。持续的代谢组改变是严重创伤后慢性危重症的特征。虽然DH-DSS+PBM组AA代谢没有什么特别之处,但PBM仍有将岭南UC大鼠AA代谢拉回正常的趋势。肠道菌群失调引起AA代谢异常。我们的相关分析显示,Tyr与Lachnospiraceae_NK4A136呈正相关,而与Escherichia-Shigella负相关,说明PBM通过调节肠道菌群促进Tyr的产生,参与维持肠道内稳态。


结论


总之,我们的数据表明了PBM通过肠黏膜屏障改善结肠炎症;其潜在的保护机制与改善高脂血症、恢复肝功能、提高抗氧化能力、加强肠道紧密连接、抑制肠道促炎因子表达、调节肠道菌群、恢复肠道菌群、增加SCFAs含量、调节MCFAs和LCFAs、维持BAs稳态、调节AAs代谢、改善肠道通透性、促进肠黏膜愈合有关。这是首次报道加味葛根芩连汤的主要活性成分PBM通过肠道菌群及上述四种代谢物增强UC大 鼠和岭南UC大鼠的肠黏膜屏障功能。本研究结果将为GQD的临床应用提供理论支持。该方法为中药复方的二次研发、优化创新提供了新的思路和帮助,解决了中药复方成分和机理不明的问题,突破了研究和应用的局限。

 


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关键词:
溃疡性结肠炎,微生物依赖性,肠道菌群,葛根芩,结肠炎,大鼠,黏膜,屏障,细胞,炎症,含量

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