多组学联合解析胆囊癌免疫逃逸机制

2021
09/08

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派森诺生物
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发表杂志:Journal of Hepatology

影响因子:25.083

发表时间:2021年6月9日

高通量测序方法:单细胞测序,外显子测序,转录组测序

样本设置:11例腺癌和2例腺鳞癌原发病例的癌和癌旁组织分别进行单细胞测序;41例腺癌和11例腺鳞癌病例进行免疫组化和免疫荧光验证。通过外显子测序将样本分为ErbB通路突变组(case组)和ErbB通路不突变组(control组)。

研究思路


主要研究结果

1、肿瘤异质性研究

对13例原发病例的癌组织和癌旁组织的26个样本进行单细胞测序,共获得114927个细胞。鉴定到16种细胞类型,分别是上皮细胞,内皮细胞_VEF,内皮细胞_DCN,肌成纤维细胞,CAF_MFAP5,CAF_ACTA2,肥大细胞,滤泡B细胞,浆细胞,Treg,CD4 T细胞,CD8 T细胞,单核细胞,M1巨噬细胞,M2巨噬细胞和DC细胞。对单细胞测序结果和Bulk RNA测序结果进行对照分析显示两者异质性高,说明单细胞测序结果是具有代表性的。不同细胞类型的数目在癌和癌旁具有较大差异,在肿瘤区域,M2巨噬细胞,Treg和上皮细胞的数目更多,而在癌旁区域,CAF_MFAP5,内皮细胞_DCN和单核细胞的数目更多,说明胆囊癌病人中肿瘤内和肿瘤间均具有较大的一致性。

2、上皮细胞亚群分析

绝大多数胆囊癌都是起源于上皮细胞,因此对上皮细胞进行进一步分析。上皮细胞可分为四个亚群,其中亚群1,2,3是腺癌病人特有的,亚群4是腺鳞癌病人特有的。不同亚群的高表达基因和信号通路不尽相同。利用拷贝数变异分析对上皮细胞进行分析结果显示,癌组织具有更高的拷贝数变异。

对四个亚群的上皮细胞进行细胞演化分析结果显示,亚群1在癌旁至癌区域呈现逐渐降低;亚群2则呈现相反趋势。利用拟时序分析针对正常态,中间态,肿瘤态的细胞鉴定其恶变前状态,鉴定到type1和type2的中间态临界点。临界点相对于亚群1高表达了肿瘤促进基因,如MYC,CXCL5等,亚群2相对易临界点2高表达了 ENO1,CDK1等基因。通过该分析找到了肿瘤发生和进化的功能基因。


3、胆囊癌病例的外显子测序分析

与此同时,对上述病例进行了外显子测序分析,发现3个病例的ErbB通路发生体细胞突变,因此,将病例分成ErbB通路突变组(Case组)和ErbB通路无突变组(control组)。

4、ErbB通路突变组和ErbB通路无突变组的差异分析

对两组病例的细胞数目比较发现,case组的Treg和M2细胞等免疫抑制细胞数目增多,并通过另外一个队列的21例case组和20例control组的免疫组化结果进行验证,获得了一致的结果。Case组表达更高Treg marker基因FOXP3和M2巨噬细胞的marker基因CD163,与单细胞测序的细胞数目统计结果一致。

针对case组和control组的细胞通讯分析结果显示,上皮细胞亚群1和亚群2在case 组与Treg,单核细胞以及巨噬细胞的细胞通讯更强。上皮细胞亚群2是在肿瘤区域高度富集的细胞,对这些细胞的分泌蛋白分析显示,CD24,MDK和SERPINA1等在case组的表达更高,这一结果也经过bulk RNA测序进行验证。通过细胞通讯分析显示case组的巨噬细胞通过MDK-LRP1,MDK-SORL1的受体-配体关系与上皮细胞具有强的细胞通讯。

5、MDK-LRP1促进免疫抑制巨噬细胞分化

MDK在肿瘤微环境中有不同的细胞间通讯,鉴于case组具有更多的免疫抑制巨噬细胞,我们推测MDK可能参与了免疫逃逸反应。发现case组的STAT及其下游基因CXCL9和CXCL10在免疫抑制巨噬细胞中的表达以及通过CXCL10-CXCR3与CD4+ T细胞和Treg细胞的通讯高于control组,说明case组的上皮细胞对免疫细胞的免疫逃逸,可能依赖于M2巨噬细胞招募或激活CD4+ T细胞和Treg细胞。

为进一步验证MDK对M2巨噬细胞分化的作用,用MDK重组蛋白以及胆囊癌肿瘤细胞的条件培养基处理巨噬细胞细胞系THP-1,通过细胞形态观察、M2 marker基因的WB,以及流式验证M2巨噬细胞增加。在case组的M1和M2巨噬细胞中高表达MDK的受体LRP1。用LRP1的中和抗体处理PBMC细胞,或在THP1细胞系敲低LRP1,MDK均无法促进THP1的分化。以上结果说明MDK-LRP1参与免疫抑制细胞的分化。

为进一步验证MDK激活的M2巨噬细胞是否招募Treg细胞,用transwell实验(上层培养PBMC细胞,下层培养MDK处理的THP1细胞)进行验证。共培养后的下层细胞可以用流式检测到Treg细胞,说明MDK诱导的M2巨噬细胞可以招募Treg细胞。

最后,对MDK的预后分析结果显示,MDK在case组的表达高,并且MDK的高表达与更低的整体生存率显著相关。免疫荧光实验显示case组高表达MDK,CD163和FOXP3,进一步验证在case组中,MDK促进免疫抑制细胞的浸润以及招募Treg细胞。以上结果均说明ErbB信号通路突变上调MDK,促进免疫抑制巨噬细胞的分化而招募Treg细胞到肿瘤微环境,导致免疫逃逸和肿瘤进展。

总结

本文利用单细胞测序获得了胆囊癌的肿瘤微环境图谱,利用外显子测序结果设置case组和control组,获得了单细胞测序结果比较分析的策略。比较分析涵盖细胞数目统计、基因表达、信号通路、拟时序和细胞通讯等所有的单细胞测序分析结果。此外,对单细胞测序结果进行RNAseq、免疫组化和免疫荧光的验证,获得了更强的数据支持。通过单细胞测序聚焦到MDK-LRP1这对受体和配体,通过这对基因在case和control表达情况差异以及两者对应的细胞数目、基因表达等的差异,推测MDK-LRP1参与免疫抑制M2巨噬细胞的分化及对Treg的招募和激活。通过组学分析获得的结论,通过传统分子生物学实验进行验证,获得了更强有力的数据支持。

这种大规模 GBC 转录组数据构建了一个宝贵的资源,揭示了个体肿瘤细胞和免疫细胞的遗传特性发生变化,这些细胞和免疫细胞协同驱动肿瘤恶性转化。


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关键词:
巨噬细胞,胆囊癌,MDK,亚群,上皮,基因

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