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导读
肠道微生物群正成为人类健康和疾病的关键决定因素之一。肠道微生物群组成的变化影响认知功能并对预防和治疗神经系统疾病提供新的见解。糖尿病认知功能障碍(DACD)是2型糖尿病（T2DM）中枢神经系统并发症之一。滋补脾阴方药（ZBPYR）长期用于治疗T2DM和预防DACD。然而，ZBPYR预防和治疗DACD的效果中，肠道菌群和代谢相互作用还有待解释。在这里，我们通过肠道微生物组学和代谢组学调查肠道微生物群是否在ZBPYR介导的DACD预防和T2DM治疗中发挥关键作用，还研究了ZDF大鼠的微生物群-肠-脑轴对话关系与ZBPYR功效之间的联系。在研究中我们发现随着ZDF大鼠从T2DM发展到DACD过程中，ZBPYR对肠道微生物群落和代谢物产生了持续的改变并远程影响海马代谢变化，从而改善记忆缺陷并逆转β-淀粉样蛋白沉积和胰岛素抵抗。这可能与一系列受肠道微生物群影响的代谢变化有关，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；支链氨基酸代谢；短链脂肪酸代谢；以及亚油酸/不饱和脂肪酸代谢。综上所述，ZBPYR对DACD的防治部分取决于对肠道微生物群的影响，以及肠道菌群衍生代谢物的调节作用，微生物群-肠-脑轴是ZBPYR的重要保护机制。
原名：ZiBuPiYin Recipe Prevented and Treated Cognitive Decline in ZDF Rats With Diabetes-Associated Cognitive Decline via Microbiota-Gut-Brain Axis Dialogue
译名：滋补脾阴方药通过微生物群-肠-脑轴防治ZDF大鼠糖尿病认知功能障碍
期刊：Frontiers in cell and developmental biology
IF：6.684
发表时间：2021.8.18
通讯作者：战丽彬
通讯作者单位：南京中医药大学
UHPLC-ESI-Q-TOF-MS
正离子和负离子图谱（图1A-B；表S1-2）。正离子模式发现123种物质，阴离子模式发现120种物质，其中75种物质共同存在于两种模式中。表1显示ZBPYR的成分。
图1. ZBPYR的UHPLC-ESI-Q-TOF-MS正离子（A）和负离子图谱（B）。
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周和10周后ZDF大鼠出现了糖代谢紊乱。具体来说ZDF大鼠的随机血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素和HOMA-IR与对照组相比，都有提高。高、中剂量ZBPYR显著降低各指标水平并呈剂量依赖性（图2A-D）。实验4周和10周后，低剂量ZBPYR还降低了ZDF大鼠的糖化血红蛋白水平（图2B）；ZDF组有糖耐量降低和胰岛素灵敏度降低的症状（图2E、F）。高剂量和中剂量ZBPYR均有所改善糖耐量降低的情况（图2E），而胰岛素不耐受改善发生在10周后(图2F)。这表明ZBPYR改善了ZDF大鼠葡萄糖紊乱。
图2. ZBPYR对大鼠糖代谢表型的影响。随机血糖（A）；糖化血红蛋白（B）；空腹胰岛素（C）；HOMA-IR（D）；口服葡萄糖耐受曲线下面积（E）；胰岛素分泌曲线下面积（F）。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
水迷宫测试用于评估ZDF大鼠的学习和记忆能力。在定位导向测试中，随着训练次数增加，大鼠的逃离时间逐渐缩短（图3A）。从第1天到第3天，寻找的时间15w-Z组的平台明显长于15w-L组，而逃离时间15w-HZ组明显短于15w-Z组(图3A)。15w-MZ组和15w-LZ组的逃离时间仅在从第1天到第2天与15w-Z组不同（图3A）。经过4天的训练，大鼠已经学会了逃生。在空间探索试验中，15w-Z组大鼠与15w-L组相比，在目标象限停留时间(图3C)和穿越原平台的次数明显减少（图 3D），寻找原平台所花费的时间明显增加（图3E）。使用ZBPYR治疗后，ZDF大鼠表现出显著改善认知功能，尤其是高剂量治疗组（图3C-E）。图3B显示了大鼠探索的路径。基于以上药效学数据，高剂量ZBPYR(high-dose ZBPYR，HZ)有着最好的作用。于是，我们接下来对对照组（L）、模型组(M)、高剂量ZBPYR组（HZ）进行了微生物组学和代谢组学分析。
图3. 采用Morris水迷宫试验评价ZBPYR对大鼠学习记忆能力的影响。定位导向测试中的逃离时间（A）；游泳路线（B）；在每个象限的花费时间（C）；穿越原平台的次数（D）；寻找原平台所花费的时间（E）。与15w-L组相比，****p<0.0001；#与图3A中的15w-Z组相比，*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001；图3C-E中，*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001。4 ZBPYR调节了ZDF大鼠的肠道菌群组成以及关键的菌种我们进行了16S rRNA测序，分析DACD肠道菌群的差异并研究 ZBPYR 对微生物群落的影响。实验4周后，在各组之间肠道微生物群多样性指数Chao1和Simpson没有显著差异（图4A），而经过10周的实验，模型组中总体细菌种类与对照组和ZBPYR治疗组相比相对较少（图4A），表明ZBPYR的干预改变了肠道细菌种类。在未加权的 UniFrac PCA(R2X = 0.459, Q2 = 0.165)和PLS-DA (R2X= 0.463, Q2 = 0.382)得分图中，实验4周和10周的样品被清楚地分为不同集群（图4B）。10周后，模型组微生物群落结构与对照和ZBPYR组显著不同，表明ZDF大鼠细菌群落结构在ZBPYR 处理后逐渐发生变化（图4B）。门水平分析揭示了肠道微生物群随着T2DM发展到DACD而变化，可以明显看出厚壁菌门和拟杆菌门的动态变化（图4C）。相比于15w-L组，15w-Z组的厚壁菌门丰度增加，拟杆菌丰度减少（图4C）。厚壁菌和拟杆菌的比例对肠道微生物群的稳定性至关重要，ZBPYR降低此比例可能是肠道菌群变化的主要原因（图4C）。热图显示属水平最高的前50个显著变化的类群。该结果表明模型组和对照组的微生物群落组成有着较大的差别，ZBPYR治疗组的肠道菌群组成更接近对照组（图4D）。属水平分析表明，6种菌属在从T2DM到DACD发展过程中发生了显著变化。其中，2种（乳酸杆菌和瘤胃球菌）属于厚壁菌门，4种（副杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、普雷沃氏菌属）属于拟杆菌门（图4F）。ZBPYR治疗显著逆转了ZDF大鼠中的微生物失调（图4F）。值得注意的是，通过PICRUSt分析，23个KEGG通路发生了改变，即10条氨基酸代谢途径，3条脂质代谢途径，5条碳水化合物代谢途径，2条人类疾病代谢途径，3条生物系统通路（图4E）。ZBPYR通过调节肠道微生物群结构可能进而参与改善认知功能。
图4. ZBPYR治疗对大鼠肠道菌群的影响。Chao1和Simpson指数（A）；肠道菌群PCA 和PLS-DA分析（B）；肠道菌群门水平分类学组成（C）；属水平丰度最高的前50个分化类群的分层聚类热图（D）；PICRUSt预测的KEGG代谢通路（E）；组间差异丰富的关键分化类群丰度（F）。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。5 ZBPYR改善脑内胰岛素抵抗和β-淀粉样蛋白沉积先前的研究表明，海马体和皮质执行重要的学习和记忆功能形成。PICRUSt 分析表明，阿尔茨海默病(AD)和胰岛素信号通路主要富集在15周龄的ZDF大鼠中。因此，我们进行了海马和皮层区域的刚果红染色以检测密集的淀粉样斑块。与15w-L组相比，15w-Z组海马和皮层砖红色板块的数量增加（图5A）。15w-HZ组的斑块数量显著低于15w-Z组（图5A），表明ZBPYR治疗可能导致淀粉样斑块减少。β-淀粉样蛋白沉积是淀粉样斑块的主要成分。与15w-L组相比，15w-Z组海马体和皮质中的β-淀粉样蛋白沉积水平显著增加（图5B）。15w-HZ组的β-淀粉样蛋白显著低于15w-Z组（图5B）。这些结果表明ZDF大鼠大脑中淀粉样斑块可能由于ZBPYR治疗而改变。此外，与15w-L组相比，15w-Z组的p-IRS2和 FOXO1表达增加，p-AKT表达降低，证实15周龄ZDF大鼠大脑出现胰岛素抵抗（图5C）。ZBPYR治疗逆转了这些蛋白表达(图5C)，表明ZBPYR可改善ZDF大鼠大脑中胰岛素抵抗。
图5. ZBPYR对脑内Aβ沉积及胰岛素信号通路蛋白表达的影响。海马和皮质刚果红染色（A）；海马和皮质β-淀粉样蛋白沉积（B）；胰岛素信号通路关键蛋白的表达（C）。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001。使用UPLC-MS/MS方法进行靶向代谢组学分析。发现代谢物与肠道微生物有相关性（图6A、B）。共有103个代谢物（包括氨基酸、苯类、碳水化合物、脂肪酸、吲哚、有机酸、苯丙酸、苯丙烷和吡啶）最终被鉴定并量化(图6C)。氨基酸、脂肪酸和有机酸是代谢物的主要类型（图6C）。PCA（R2X = 0.689，Q2 = 0.334）和PLS-DA(R2X= 0.516, Q2 = 0.420)得分图显示实验4周和10周的样品分别有分别聚集的趋势（图6A、B）。实验10周后，对照组和模型组之间的分离趋势明显，说明ZDF大鼠的肠道代谢物与LZ大鼠的肠道代谢物有显著差异（图6A、B）。经过10周的实验，ZBPYR处理的肠内容物代谢组显示出偏离模型组的轨迹（图6A-C）。总的来说，随着时间的推移，ZBPYR治疗显著逆转ZDF大鼠肠内容物代谢状况。正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA是用于最大限度地区分类别并确定组之间的潜在生物标志物。VIP > 1且p<0.05用于鉴定肠道内容物中的差异代谢物。最终，发现9种代谢物的水平在T2DM发展到DACD 的过程中发生动态变化，即4种氨基酸（L-天冬氨酸、赖氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸、L-谷氨酸）和5种短链脂肪酸（丁酸、戊酸、乙酸、丙酸和异丁酸）（图6D）。ZBPYR处理提高了ZDF大鼠中氨基酸和短链脂肪酸（SCFA）的浓度（图6D）。此外，肠道中的代谢组学变化可能通过微生物群-肠-脑轴和脑代谢物引起DACD 的发病。因此，为了确定哪些代谢物可能是诱导认知紊乱的介质，我们还确定了15 周龄大鼠海马体中代谢物的水平。我们专注于海马体，因为它是获取和形成新记忆的重要区域。在肠道内容物和海马中物种之间的代谢产物差异比较小，除了降低的有机酸含量（图7C）。ZBPYR治疗改变了ZDF大鼠的大脑代谢物（图7A、B）。在海马体中，与15w-L组相比，有8种代谢物在15w-Z 组中显著降低，即2种氨基酸（L-谷氨酸和L-丙氨酸），4种脂肪酸（2-羟基-3-甲基丁酸、亚油酸、二十二碳五烯酸(22n-6)和8,11,14-二十碳三烯酸酸）和2种有机酸（2-羟基丁酸和α-酮异戊酸）(图7D)。ZBPYR治疗逆转了所有这些差异代谢物（图7D），表明这些差异代谢物在DACD诊断中的良好的诊断准确性。所有潜在的差异代谢物都被导入到基于网络的通路分析系统MetaboAnalyst4.0。肠内容物的潜在生物标志物主要是涉及12条代谢途径（图6E和表2)，海马体的潜在生物标志物主要涉及13条代谢途径（图7E和表3)。两者共同受影响的代谢途径为4条氨基酸代谢途径和1条碳水化合物代谢途径。其中，3条氨基酸代谢途径（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢）和2条碳水化合物代谢途径（丁酸酯代谢）被鉴定并与PICRUSt的预测结果一致，验证了结果的可靠性。
图6. ZBPYR对大鼠肠道内容物代谢产物组成的影响。代谢物的PCA分析（A）；代谢物的PLS-DA分析（B）；代谢物的分类分析（C）；肠道中显著变化的代谢物（D）；通路富集分析（E）。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001。
图7. ZBPYR对大鼠海马代谢产物组成的影响。代谢物的PCA分析（A）；代谢物的PLS-DA分析（B）；代谢物的分类分析（C）；海马体结构中显著变化的代谢物（D）；通路富集分析（E）。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001。7 生物信息学分析和相关性网络分析探究ZBPYR抑制DACD的肠道微生物-肠道-脑轴机制我们对DACD中的菌属和代谢物进行斯皮尔曼相关分析。网络图显示了5种差异菌属（Ruminococcus未显示，p>0.05）和17种代谢物（9种肠道代谢物和8种海马代谢物之间的关系）(8A)。在肠道菌群和肠道代谢产物之间的相关性中，乳杆菌属与几乎所有肠道代谢物正相关，并且几乎所有菌属都与L-谷氨酸和乙酸呈正相关；拟杆菌属与L-赖氨酸、丁酸和戊酸呈正相关；副杆菌属与丁酸呈正相关；普雷沃氏菌属与丙酸和戊酸正相关。在肠道代谢物和海马代谢物之间，α-酮异戊酸与几乎所有肠道代谢物呈正相关；2-羟基丁酸与乙酸呈正相关；8,11,14-二十碳三烯酸与L-亮氨酸和L-异亮氨酸呈正相关。此外，热图显示潜在生物标志物和DACD表型之间有相关性（图8B）。在所有相关分析中，菌属中的乳酸杆菌和拟杆菌属，肠道代谢物中的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和L-谷氨酸，海马代谢产物中的2-羟基-3-甲基丁酸、8,11,14-二十碳三烯酸、二十二碳五烯酸22n-6、亚油酸与DACD相关表型呈显著负相关（图9）。ZBPYR干预的DACD相关生物标志物主要参与以下途径：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；支链氨基酸(BCAA)代谢；SCFA代谢；以及亚油酸/不饱和脂肪酸代谢。作为微生物-肠-脑轴中的关键元素，代谢物可以进入循环并影响肠道和大脑之间的交流。因此，在我们目前的研究中，这些生物标志物被预测为潜在的“微生物群-肠-脑轴”的靶标，有助于DACD的前期诊断和ZBPYR防治的潜在机制。
图8. 整合菌属、肠道代谢物、海马代谢物和DACD表型的相关分析。（A）网络图显示菌属（绿色圆圈表示拟杆菌；青色圆圈表示厚壁菌），肠道代谢物（黄色菱形表示脂肪族氨基酸；橙色菱形表示短链脂肪酸），海马代谢产物（紫色三角形表示不饱和脂肪酸；粉红色三角形表示脂肪族有机酸）之间相关性。（B）热图显示潜在生物标记物和DACD表型之间的相关性。相关度由红色（正相关）和蓝色（负相关）的梯度变化表示。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，****p<0.0001。RBG，随机血糖；糖化血红蛋白（HbA1c%）；FSI，空腹血清胰岛素；HOMA-IR，评估胰岛素抵抗的内稳态模型；OGTT-AUC，口服葡萄糖耐量试验曲线下面积；ITT-AUC，胰岛素分泌试验曲线下面积；BW，体重；AC，腹围；D1-D4，Morris水迷宫定向导航测试中4天训练过程中的逃避潜伏期；TS，Morris水迷宫空间探索实验中寻找原始平台位置的时间；1/TQ，Morris水迷宫空间探索测试中每个象限花费时间的倒数（%）；1/CN，Morris水迷宫空间探索试验中原始平台位置交叉数的倒数；Inte，肠；Hip，海马体；Cor，皮质。
图9. ZBPYR处理对分化细菌和代谢产物结构成分网络的调控示意图。（A-D），富集的代谢途径；①-⑤，差异菌属；粗体，差异肠道代谢物；下划线，差异海马代谢产物。BCCA，支链氨基酸。SCFA，短链脂肪酸。
近年来，人们认识到微生物-肠-脑轴是神经疾病研究领域的一个新概念。强有力的证据表明，中医药在调节肠道菌群方面发挥重要作用。我们以前的研究表明ZBPYR可以改善T2DM和DACD的表型，在肠道菌群中调节益生菌和病原菌。然而，ZBPYR在DACD发展过程中的防治作用及其与微生物-肠-脑轴上的潜在作用之间的关系尚不清楚。阐明中医药的作用机制是一个挑战，因为这是未知的复合物协同作用。此外，单个微生物组学或代谢组学策略不能完全说明病理生理过程。于是，我们寻求确定ZBPYR防治DACD的功效及与DACD进展相关的关键微生物组和代谢组调节之间的关系。近年来，T2DM 的中枢神经系统并发症引起了广泛关注，学习和记忆相关分子机制取得了长足的进展。目前的结果表明，ZDF大鼠在9周出现T2DM的迹象，并且15周时出现与DACD相关的认知能力下降。在ZBPYR治疗下，ZDF大鼠的DACD症状和认知行为趋于正常，大脑中的β-淀粉样蛋白沉积和胰岛素抵抗也被逆转，表明表明ZBPYR具有一定的防治作用。有趣的是，ZBPYR可以显著恢复DACD改变的微生物群组成和肠道代谢物，以及远程影响海马体代谢变化，从而影响认知行为。其中，丹参中的丹参酮和丹参素等、白芍中的芍药苷、石菖蒲中的β-细辛醚等挥发油成分已被证实可以直接穿过血脑屏障（BBB）改善认知障碍。此外，ZBPYR中的主要活性成分，如红参中的人参皂苷、山药中的山药多糖、远志中的远志皂苷等，不能直接穿过BBB需要通过肠道菌群介导作用将大分子物质代谢转化为小分子代谢物，进而穿过血脑屏障发挥改善认知功能的生物学效应。据我们所知，这是第一个证据表明随着DACD的进展中枢神经系统的认知功能受到显著影响，ZBPYR的防治作用与ZDF大鼠一系列微生物-肠-脑轴事件有关。健康的肠道微生物群对于维持正常的大脑发育和功能非常重要。越来越多的证据支持转移健康的微生物群到不同的认知障碍模型动物中可提高学习和记忆能力，证明了微生物群-肠-脑轴的概念的存在。在目前的研究中，肠道微生物群在15周龄的ZDF大鼠与9周龄的ZDF大鼠不同，表明ZDF大鼠的肠道菌群在 DACD的发展过程中是变化的。肠道微生物菌群失调与菌群丰度减少密切相关，尤其是在代谢和神经系统疾病中。DACD微生物群改变的病理基础似乎涉及转变到更有利于有害细菌成长不利于有益细菌生长的环境。16S rRNA测序结果表明，在DACD发展构成中厚壁菌门的丰度增加，并且拟杆菌门的丰度降低，这与T2DM和认知障碍患者的菌群变化相似。此外，ZBPYR处理影响了一些关键菌属的丰度，如乳杆菌属、瘤胃球菌属、副杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属和普氏菌属。我们推测这些属的变化可能是认知功能发生变化的主要原因。据报道，乳酸菌改善了Aβ42诱导的AD大鼠和AD患者认知能力，这可能与其酸化肠道环境，产生必需氨基酸，维持屏障完整性，并减少β-淀粉样蛋白沉积在大脑有关。副杆菌属是一种抗炎并产生SCFA的细菌。目前的研究还没有将其与人类认知障碍联系。然而，之前已经证明移植健康大
鼠的肠道微生物群到 T2DM 模型可以增加肠道副杆菌属的数量。瘤胃球菌能够参与某些胃肠道疾病和肠道代谢疾病，最近的研究证实它可能参与认知功能障碍的发展过程。此外，拟杆菌属、丁酸单胞菌属和普氏菌属均已在认知障碍动物模型或患者中被证实丰度降低。这些肠道微生物群结构的变化表明ZBPYR治疗通过改变菌群具有对ZDF大鼠的DACD的发病明显的改善作用。代谢组学信息是生物功能的最终结果，可直接指示异常生理变化，因为它是基因组、转录组和蛋白质组变化的“下游”。哺乳动物大脑的特点是高水平的代谢活动以及相应的代谢调节机制来确保能量充足供应进而确保大脑活动。本研究专注于了解从肠道到大脑代谢物流动对于记忆改善背后的代谢机制。与以往的研究一致，DACD富集的代谢途径主要参与氨基酸代谢和脂肪酸代谢。氨基酸代谢直接影响机体神经系统。例如，我们观察到ZBPYR治疗后L-谷氨酸和L-天冬氨酸的增加，这是神经元特异性的生物标志物，用来检测中枢神经系统相关的神经元损伤疾病，尽管它们对任何特定疾病都缺乏特异性。谷氨酸是一种兴奋性神经递质，以其在学习和记忆中的关键作用而闻名，尤其是促进突触传递以及海马神经元中长时程增强的诱导和维持，并助于抑制大脑中的GABA能调节。T2DM患者大脑中GABA水平失调与认知功能受损有关。在本研究中，L-谷氨酸水平在ZDF大鼠的肠道和海马结构中均下调，表明改变的谷氨酸信号。类似的谷氨酸信号改变也在啮齿动物AD 模型中有报道。作为兴奋性神经递质，海马体和皮层中的谷氨酸能的功能障碍已被确定为重要的认知受损的中介。它在学习和记忆中起着关键作用，特别是在促进突触传递和维持海马神经元的形态和功能。
天冬氨酸，另一种兴奋性神经递质，直接来源于
TCA循环中间体草酰乙酸，并与认知衰退密切相关。我们发现天冬氨酸的浓度在ZDF大鼠中减少，在认知能力下降的db/db小鼠中也观察到的TCA循环水平降低。丙氨酸不仅是甘氨酸受体的潜在兴奋性神经递质，而且也是肌肽的成分和牛磺酸运输的抑制剂。有证据表明，在哺乳动物海马体中乳酸丙氨酸循环的紊乱的可能引导产生氮交换和有关空间记忆的恢复。支链氨基酸是是具有脂肪族侧链和分支的必需氨基酸，几乎占人体所有氨基酸的三分之一。已知3种支链氨基酸，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，可以穿过BBB并参与脑组织结构的成分并发挥功能。此外，支链氨基酸参与神经递质代谢（谷氨酸代谢），影响淀粉样斑块，神经元存活率和成年海马神经形成，显著影响中枢神经系统的整个功能。在这项研究中，我们观察到ZDF大鼠肠内容物中亮氨酸和异亮氨酸的水平变化，而在海马中发现其上游α-酮异戊酸和羟基丁酸的水平变化，推测ZDF大鼠认知功能障碍的改善可能是肠道代谢产物的远程作用。研究证实，乳酸菌可以通过调节支链氨基酸代谢途径来影响氨基酸水平。脂质是大脑的组成部分并在细胞信号传导各种生理过程中起关键作用。作为脂质家族的一员，SCFAs与脑功能和神经生物学相关，这可能会减轻大脑中的β-淀粉样蛋白沉积和胰岛素抵抗。在我们的研究中，ZBPYR治疗显著增加ZDF大鼠肠道内容物中SCFA，包括乙酸、丁酸、异丁酸、丙酸和戊酸，以及主要产生SCFA的相关细菌属的丰度，包括副杆菌属，普氏菌属和瘤胃球菌。其中，乙酸和丁酸因其对神经元健康和认知功能方面的有益影响而闻名。此外，有研究提供了将DACD与亚油酸代谢紊乱联系起来的证据。
亚油酸是一种重要的多不饱和脂肪酸，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。相对高浓度的亚油酸可能会对神经元有保护。二十二碳六烯酸是一种必需的
omega-3长链多不饱和脂肪酸并参与神经系统的发育。它已被证明参与T2DM患者脑中的神经递质传导、信号转导、神经发生和抗炎等重要功能。总的来说，目前的证据支持ZBPYR通过改变肠道代谢物来调节ZDF大鼠的DACD。虽然目前无法解释脑的代谢组学和肠道代谢组学的这些差异，这些代谢物的体循环分析可能会成为肠道和大脑之间联系的一个强大的工具来解释微生物群-肠-脑轴的交流。在人类和动物中均有报道肠道微生物群紊乱可能导致脑部疾病，特别是，肠道微生物群与认知功能之间的新联系。我们发现ZDF大鼠表现出空间学习和记忆障碍，因此使我们能够确认认知缺陷是T2DM的表型（其他如慢性高血糖和胰岛素分泌不足）。除了葡萄糖利用和胰岛素敏感度受到破坏，胰岛素是对多个核心代谢流程必不可少的，包括对认知至关重要的信息处理过程。在记忆编码和检索中，胰岛素受体信号可以调节谷氨酸能的传递（通过增强NMDA受体）和 GABA能（通过GABA受体招募到突触后膜），从而调节海马体的突触可塑性和影响认知能力。通过差异物种和代谢途径相关性分析，我们观察到潜在的机制可能与AD和胰岛素信号通路有关。可以想象，T2DM认知障碍患者因持续性高血糖导致肠道细菌代谢产物发生改变，从而刺激胰岛素抵抗，使脑内Aβ病理的增加。淀粉样蛋白沉积是DACD和AD发病机制的标志，也是认知能力下降的一个重要原因。最近的研究也证实了ZDF大鼠脑部的改变与AD患者脑部改变有相似之处，即，大脑中淀粉样蛋白积累和胰岛素抵抗导致神经元损伤并最终导致认知能力下降。胰岛素依赖的IRS2-AKT信号通路是胰岛素抵抗的主要通路。IRS2和AKT是与神经元生长和记忆有关。脑室内注射淀粉样蛋白会通过 IRS2和AKT的过度磷酸化诱导大脑胰岛素抵抗。ZBPYR逆转相关蛋白表达。这些发现与先前的研究结果是相似的，DACD诱导的IRS磷酸化可能会减少海马和皮层胰岛素敏感性。因此，ZBPYR可能是一种新的防治策略，通过调节肠道微生物群，改善脑胰岛素抵抗，并预防与DACD 相关的早期病理。
总之，本文描述了ZDF大鼠DACD的发病机制并表明这些认知缺陷与肠道微生物群代谢和海马体代谢有关。有趣的是，我们发现ZBPYR能够调节DACD相关肠道菌群失调，逆转大脑中的淀粉样蛋白沉积和胰岛素抵抗。这些特点可能与一系列受肠道微生物群影响的代谢变化有关，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；支链氨基酸代谢；SCFA 代谢；和亚油酸/不饱和脂肪酸代谢。据我们所知，这是第一个研究显示肠道微生物群及其代谢活动以及中医药的功效，如ZBPYR，可能与DACD的发展有关。我们有充分的理由相信微生物群-肠道-脑轴可以提供一个新的视角来探索与DACD相关的致病变化并促进对以中医为基础的防治方法的了解。
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