氯胺酮上调脑源性神经生长因子在创伤后应激功能障碍动物模型中的作用

1郑州大学附属肿瘤医院（河南省肿瘤医院）麻醉科 450008；2东南大学附属中大医院麻醉科，南京 210002；3郑州大学第一附属医院麻醉科 450052

国家自然科学基金（81801081，81801074）；

河南省医学科技攻关计划省部共建项目（SB201902016）

【论著】

氯胺酮是NMDA受体非选择性拮抗剂，为临床常用的全身麻醉药。近年来大量临床及基础研究均证实氯胺酮具有快速、有效的抗抑郁作用，而目前关于其是否具有抗PTSD的作用仍处在探索阶段，明确氯胺酮对PTSD的影响及其潜在机制可为PTSD的治疗提供新的有效且快速的干预手段。

1.1　实验动物与分组

雄性C57BL/6小鼠48只，6~8周龄，体重18~20 g。采用随机数字表法分为4组：对照+生理盐水组（CN组）、对照+氯胺酮组（CK组）、PTSD+生理盐水组（PN组）及PTSD+氯胺酮组（PK组），每组12只。

1.2　PTSD模型建立

小鼠适应实验环境1周后，通过不可逃避足底电击法建立PTSD动物模型。建模方法如下：将PN组、PK组小鼠放入实验箱（30 cm×30 cm×45 cm）中适应5 min后，接受10次随机成对声音和足底电击刺激（声音，30 s，80 dB，6 000 Hz；电击，1 s，1 mA），每次刺激间隔3~5 min。CN组和CK组小鼠也放入该实验箱，给予相同的声音刺激，但不给予电刺激。由图像自动监视系统追踪小鼠僵直反应时间。每次实验结束后用75%乙醇擦拭场地，避免前只小鼠残留气味影响实验结果。

1.3　给 药

CK组和PK组于建模30 min后腹腔注射氯胺酮2.5 mg/kg。CN组和PN组腹腔注射等量生理盐水。均连续注射14 d。

1.4　旷场实验

建模后第15天行旷场实验检测小鼠抑郁样行为。立方形敞箱（40 cm×40 cm×40 cm），底面均分为3×3方格。将小鼠从中央格放入观察箱内，行探索活动5 min。由图像自动监视系统追踪其探索路程和中央格停留时间（中央格停留时间较少时说明有抑郁样行为）。每次测试后用75％乙醇彻底清洁敞箱，避免前只小鼠残留气味影响实验结果。

1.5　高架十字迷宫实验

建模后第16天行高架十字迷宫实验检测小鼠焦虑样行为。高架十字迷宫由一个平台区（5 cm×5 cm）、两个开放臂（35 cm×5 cm）和两个闭合臂（35 cm×5 cm×15 cm）组成。每只小鼠面向开放臂放于十字迷宫中心，让其自由探索迷宫5 min，并用图像自动检测系统记录小鼠开放臂进入次数及开放臂停留时间。开放臂进入次数减少和停留时间缩短代表小鼠焦虑样行为增加。实验结束后用75%乙醇擦拭场地。

1.6　荧光定量PCR

Trizol法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明反转录为cDNA后进行荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR引物购自美国Applied Biosystems公司：脑源性神经营养因子（BDNF）、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）。采用2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.7　高尔基染色

建模后第17天，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠60 mg/kg进行麻醉，快速断头取脑，双蒸水清洗脑组织，将脑组织浸泡在提前配好的混合液（高尔基染色试剂盒中A、B液等量混合，提前24 h配置）中，24 h后更换A、B混合液；室温避光浸泡3周后将脑组织转移至C溶液，4 ℃避光浸泡1周，24 h后换液1次；滤纸吸干脑组织表面液体后行包埋剂包埋，使用冰冻切片机行冠状切片（厚120 μm），并将脑片转移至防脱载玻片，避光晾干；双蒸水清洗脑片2次，每次2 min；将脑片于D、E液和双蒸水混合液（1∶1∶2）中浸泡10 min，然后双蒸水清洗脑片2次，每次4 min；体积分数50%、75%、95%、100%乙醇梯度脱水，中性树胶封片。显微镜下（100倍）盲法观察海马CA1区，每张切片在相应位置选取5个神经元，选取40 μm远端树突，应用Image J软件分析海马组织锥体神经元树突棘（以下简称树突棘）密度，结果以每30 μm树突上树突棘数目表示。选取的神经元需符合以下条件：染色清晰充分；胞体成锥形；单轴突，有较大的顶树突和数量较多的基树突，树突棘明显。

2.1　旷场实验

4组小鼠探索路程差异无统计学意义（P>0.05）。与CN组比较，PN组中央格停留时间缩短（P<0.05）；与PN组比较，PK组中央格停留时间延长（P<0.05）。CN组、CK组、PK组中央格停留时间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2　高架十字迷宫实验

与CN组比较，PN组开放臂进入次数和开放臂停留时间减少（P<0.05）；与PN组比较，PK组开放臂进入次数和开放臂停留时间增多（P<0.05）。CN组、CK组、PK组开放臂进入次数和开放臂停留时间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3　荧光定量PCR检测

与CN组比较，PN组海马组织BDNF mRNA水平降低（P<0.05）；与PN组比较，PK组海马组织BDNF mRNA水平升高（P<0.05）。CN组、CK组、PK组海马组织BDNF mRNA水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.4　高尔基染色检测

镜下显示，CN组、CK组树突棘密度较高，PN组小鼠树突棘密度较低，PK组树突棘密度中量（图2Ⓐ）。与CN组比较，PN组和PK组树突棘密度降低（P<0.05）；与PN组比较，PK组树突棘密度降增高（P<0.05）。CN组和CK组树突棘密度差异无统计学意义（P>0.05）。见图2Ⓑ。

本研究结果显示，PTSD模型小鼠中央格停留时间缩短，开放臂进入次数和停留时间减少，表明PTSD小鼠存在明显的焦虑抑郁样症状；同时PTSD模型小鼠海马组织BNDF mRNA水平和树突棘密度明显降低。给予小剂量多次氯胺酮治疗后，海马组织BNDF mRNA水平升高，树突棘密度增加，小鼠的焦虑抑郁症状有所改善。

目前，氯胺酮抗PTSD的作用及机制尚未明确。McGhee等研究显示，手术期间使用氯胺酮作为镇痛药的烧伤患者术后PTSD发生率显著低于未使用氯胺酮组。一项随机双盲临床试验发现，单次亚麻醉剂量氯胺酮静脉给药与PTSD核心症状及共病抑郁的改善相关。动物研究表明氯胺酮可促进恐惧记忆的消退，其机制可能与海马突触可塑性和脑内谷氨酸代谢有关。本研究也发现，多次小剂量氯胺酮注射后，PTSD模型小鼠焦虑抑郁样症状明显改善。因此，氯胺酮有望成为新的 PTSD的防治药物。

本研究发现，PTSD小鼠海马组织BNDF mRNA水平降低，同时伴树突棘密度减少。海马作为应激反应的整合部位，与PTSD发病有着重要的相关性。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。大脑影像学证据表明，PTSD患者背外侧前额叶皮质、海马、扣带皮质脑区的体积减少，这可能与突触丢失有关。此外，Moda‑Sava等发现，给予单次氯胺酮治疗后可在慢性应激诱导树突棘丢失的位置再次形成树突棘，表明突触再生可以维持氯胺酮的抗抑郁作用。BDNF是中枢神经系统中广泛存在的一类参与神经元发育、分化和存活的营养因子，可通过作用于酪氨酸激酶受体B调节树突棘的生长。临床研究表明，PTSD患者血液中BDNF水平较低，同时伴随BDNF Val66Met多态性。BDNF mRNA表达水平的改变影响PTSD大鼠对创伤刺激的恐惧记忆形成、巩固和再摄取。因此，我们推测BDNF介导的突触再生可能涉及PTSD的病理生理过程。