中科院 | EI：深入了解真菌和原生生物在大熊猫肠道微生物群和抗生素耐药性中的作用

编译：微科盟图南，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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1 大熊猫肠道微生物的组成、多样性和功能

大熊猫肠道细菌主要由厚壁菌门(63.7%）和变形菌门组成(23.6%；图S1a)。卧龙地区的大熊猫肠道放线菌丰度显著高于成化地区(P<0.05；图S1a)。大熊猫肠道真菌以子囊菌门(55.9%)和担子菌门(37.7%)为主(图S1b)。大熊猫肠道原生动物中最具优势的原生动物超类群是来自纤毛门(Ciliophora)的囊泡虫类(Alveolata，73.4%)，其次是有孔虫界(Rhizaria，15.8%)、泛植物界(Archaeplastida，5.4%)、古虫界(Excavata，2.9%)、茸鞭生物界(Stramenopiles，1.4%)、后鞭毛生物界(Opisthokonta，1%)和变形虫界(Amoebozoa，0.1%；图S2)。不同个体的肠道病毒群落组成差异较大(图S3)。

卧龙地区的大熊猫肠道细菌多样性显著高于成化地区(P<0.05；图S4a)，而真菌多样性和原生生物多样性在不同部位之间差异不显著(P>0.05；图S4b和S5)。主坐标分析(PCoA)结果表明，大熊猫肠道真菌按采样地点聚类(图1)。PERMANOVA进一步揭示了采样地点和年龄对大熊猫肠道微生物的影响，包括细菌、真菌和原生生物的相对贡献(P<0.05；表1)。采样地点可以揭示14%的真菌变异，高于细菌(10%)和原生生物(7%；表1)。性别和饮食对大熊猫肠道原生生物无显著影响(P>0.05；表1)。

中性模型可以预测大多数微生物ASV(85.7-88%)在大熊猫肠道中的分布(图2和图6)。中性模型中的真菌和细菌ASVs增加的数量是减少数量的两倍，而原生生物的增加和减少的比例相似(5.8–6.2%)。细菌(0.675)和原生动物(0.69)的R²高于真菌(0.45)(图S6)。共现网络显示真菌在大熊猫肠道微生物中占主导地位(真菌-真菌：37.7%，真菌-细菌：40%，真菌-原生动物：4.7%；图S7)。

大熊猫的肠道微生物代谢是最丰富的KEGG系统(10.7%；图S8a)，其中糖苷水解酶(0.5%)和糖基转移酶(0.3%)是两种优势酶(图S8b)。病毒宏基因组分析显示，病毒参与了大熊猫肠道的许多功能(如发育阶段)(图S9)。

图1. 分别基于加权Unifrac距离和Bray Curtis距离的PCoA揭示了大熊猫肠道细菌、真菌和原生生物的群落结构。括号中列出了PCoA轴可以解释的变化程度。

2 原生生物在大熊猫肠道微生物中的作用

共现网络分析确定了三个与真菌和细菌产生大量相互作用的原生生物属(Chrysophyceae_X，Cercomonas和Paratetramitus) (图S7)。不同年龄段大熊猫的优势原生生物组成和丰度差异不显著(P>0.05；图S10)。在原生生物功能组中，分解者(93.3%)占主导地位，其在老年组中的丰度高于亚成年组和成年组(P<0.05；图S11)。不同年龄段的共生网络表明，成年组(边：497，模块性：2.645，平均度：5.316)的网络复杂性(这里由网络属性的平均变化定义，特别关注边、模块性和平均度)高于亚成年组和老年组(图3和表S1)。网络分析显示成年熊猫肠道中也存在负相关度最高的联系(41.2%)(表S1)。共现网络进一步显示了原生生物与其它微生物之间的复杂关系，例如成年组(原生细菌：22，原生真菌：37)，亚成年组(原生细菌：23，原生真菌：24)和老年组(原生细菌：35，原生真菌：8)。

通过病毒宏基因组学分析预测了病毒的潜在宿主，三个原生生物属((O)Hypotrichia，Cercomonas和Apatorics)在共现网络中与这些潜在宿主呈现出复杂的相关性(图4)。KEGG和CAZy注释结果显示，大熊猫肠道中变形虫的丰度与多种微生物功能呈显著负相关(P<0.05；表S2)。

图3. 大熊猫肠道微生物(相对丰度>0.001)的共现网络分析，包括不同年龄大熊猫的细菌、真菌和原生动物。只有当相关性R>0.7或<−0.7，P<0.01时才被纳入分析中；节点的大小与连接数(度)成正比。

图4. 大熊猫肠道原生生物和潜在病毒宿主之间的网络共生分析。只有当相关性R>0.7或<−0.7，P<0.05时才被纳入分析中；节点的大小与连接数(度)成正比。

3 大熊猫肠道微生物中ARGs的组成和丰度

在所有大熊猫样本中共检测到128个ARGs和35个MGES，其中ARGs的相对丰度为0.036-0.467，检测到的ARGs数量为18-54(图5)。根据抗生素耐药性等级将检测到的ARGs分为12种类型，其中多重耐药(MDR)是大熊猫肠道内ARGs的优势类型，分别占ARGs相对丰度和相对数量的81.4%和46.8%。与其它年龄段相比，幼年大熊猫微生物组的ARGs相对丰度和数量(0.43，47)及MGEs丰度(0.24，表1)最高(P<0.05)。在两个采样地点中，成化大熊猫肠道微生物的ARGs相对丰度和数量(分别为84.9%和48.2%，P<0.05)及MGEs丰度(97.3%)显著高于卧龙大熊猫(P<0.05；图S13)。图S12显示大多数样本是按PCo1轴上的采样位置分开的，这解释了44.2%的变异，并根据年龄类别对其进行了聚类。PERMANOVA分析进一步表明，饲粮、性别、年龄和地点均显著影响大熊猫肠道微生物组中ARGs的组成，饲粮是引起ARGs变异的最主要因素(34%，P<0.05，表1)。

图5. 每个大熊猫样本中ARGs的相对丰度和数量。

4 大熊猫肠道微生物与ARGs丰度的关系

大熊猫微生物中MGEs的丰度与ARGs的丰度呈显著正相关(R=0.75，P<0.001；图S14a)。细菌多样性与ARGs丰度呈显著负相关(R=-0.48，P=0.0024；图S14b)，细菌、真菌多样性与ARGs丰度相关性不显著(P>0.05；图S14c和S14d)。加权相关网络分析将大熊猫肠道微生物分为39个微生物模块(通常包括多营养群落)，模块28(R=0.443，P=0.0054)和模块30(R=0.425，P=0.0077)与精氨酸的丰度和含量呈显著正相关(图S15a，图S15b和S15c)。图6显示了模块28和模块30的微生物分类群之间的相互作用。子囊菌门(真菌)在两种共发生网络中占主导地位，囊泡虫、后鞭毛生物(原生生物)和放线菌门(细菌)在两种共发生网络中均与细菌、真菌和原生生物存在复杂的相互作用。与细菌、真菌和原生生物相比，中性模型可以预测两个模块中微生物ASV的数量较少(图2)。

图6. 大熊猫肠道微生物包括细菌、真菌和原生生物的共现网络分析，与ARGs丰度显著相关。该网络只仅包含相关性R>0.7或R<−0.7，P<0.01的类群。节点的大小与连接数(度)成正比。