科研 | Gut Microbes：维生素D受体条件性缺失导致肠道病毒群失衡和病毒-细菌相互作用改变

编译：微科盟牛魔王，编辑：微科盟汤貝、江舜尧。

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在对照小鼠（VDR^LoxP，7只雌性和3只雄性）和条件性VDR敲除小鼠（VDR^ΔIEC，VDR^ΔPC和VDR^ΔLyz，每组各5只雄性和5只雌性）的粪便样品（共40）中，总共鉴定了4048种病毒。各组之间存在不同的病毒组成和群落，其在多样性和组成上都不同。作者选取每个样本前10种最丰富的病毒种类进行展示（图1a）。这些样本中最丰富的物种分别是弧菌噬菌体JSF5，弧菌噬菌体JSF6，BVDV-1（牛病毒性腹泻病毒1），大肠杆菌O157分型噬菌体7，人α-疱疹病毒1，乳杆菌原噬菌体Lj771，甲型流感病毒，乳杆菌噬菌体KC5a，和未鉴定的病毒（图1a）。与对照VDR^LoxP小鼠相比，三种VDR KO小鼠模型中弧菌噬菌体JSF5和JSF6丰富度均更高，而VDR^ΔPC小鼠中大肠杆菌O157分型噬菌体7更丰富，VDR^ΔLyz小鼠中乳杆菌噬菌体phiadh显著减少（P<0.01）（图1b）。

条件性VDR基因敲除小鼠与对照小鼠相比，共有12种病毒不同，其中6种q<0.001，2种q<0.01，4种q<0.05(图3a)。在VDR^ΔIEC/VDR^LoxP和VDR^ΔPC/VDR^LoxP的比较中，弧菌噬菌体JSF5(q<0.001)和牛病毒性腹泻病毒1(q<0.05)显著富集；而VDR^ΔPC和VDR^LoxP相比，仅弧菌JSF5显著富集(q<0.01)以彩色直方图显示(图3a)。VDR^ΔLYZ和VDR^LoxP相比，共9种病毒有明显改变(5种q<0.001，1种q<0.01，3种q<0.05)。其中，有3种富集(弧菌噬菌体JSF5/6和牛病毒性腹泻病毒1)，6种减少(乳杆菌噬菌体phiadh，樱桃绿环斑驳病毒，噬菌体KC5a，禽类禽副黏病毒1，分枝杆菌病毒Phayonce，以及短尾噬菌体科的一个未知物种)(图3a)。

为了研究性别对小鼠肠道病毒群落变化的影响，我们用fold-changes和q值说明了雄性和雌性小鼠中病毒物种丰度的显著差异。在我们的研究中，所有调查组都包含了雄性和雌性小鼠，VDR^LoxP：雄性n=3，雌性n=7；VDR^ΔIEC：雄性n=5，雌性n=5；VDR^ΔLyz：雄性n=5，雌性n=5。雌性VDR^ΔIEC/VDR^LoxP小鼠相比较，发现7种病毒显著改变（2种富集：弧菌噬菌体JSF5和牛病毒性腹泻病毒1；5种减少，即乳杆菌原噬菌体phiadh，乳杆菌原噬菌体KC5a，乳杆菌原噬菌体lj771，猕猴α-乳杆菌，猫病毒CTV1），但在相同两组雄性比较中未发现明显改变。然而，雌性VDR^ΔPC与对照VDR^LoxP小鼠相比，只有弧菌噬菌体JSF5富集(图3b)。在雌性VDR^ΔLYZ和VDR^LoxP的比较中，有5种差异显著（q < 0.05）（2种富集：噬菌体JSF5和牛病毒性腹泻病毒1，3种减少，即乳杆菌原噬菌体phiadh、樱桃绿环斑驳病毒和乳杆菌原噬菌体KC5a），而雄性只有弧菌JSF5富集，乳杆菌原噬菌体phiadh减少。总而言之，在条件性VDR基因敲除小鼠中，雌性小鼠比雄性小鼠发现更多变化的病毒，这表明VDR状态对不同性别的小鼠存在影响。

霍乱弧菌(弧菌噬菌体JSF5和弧菌噬菌体JSF6的宿主)，在条件性VDR敲除小鼠中大量富集(图1b);与对照小鼠相比，在敲除小鼠中检测到较低浓度的霍乱弧菌，尤其在VDR^ΔLyz小鼠中丰度更低（p<0.05）(图4a)，这与VDR^ΔLyz小鼠富含弧菌噬菌体JSF5/JSF6的发现相一致。在加氏乳杆菌、乳杆菌原噬菌体phiadh和乳杆菌原噬菌体KC5a的细菌宿主中也发现了类似的情况(图1b；图4a)。此外，大肠杆菌（大肠杆菌O157分型噬菌体7的靶宿主）细菌丰度与小鼠体内噬菌体变化相反(图1b；图4a)。微生物群落中细菌丰度的改变支持了我们关于病毒群变化的发现。

为了进一步评估变化细菌的组成，作者对三组小鼠模型进行差异分析，显示了q < 0.1的变化细菌(图4b)。发现与对照VDR^LoxP小鼠相比，VDR^ΔIEC小鼠中杜克雷嗜血杆菌和华葵中根瘤菌显著减少(图4b)。同时，与对照组相比，VDR^ΔPC小鼠体内5种细菌明显减少，3种细菌显著富集。这些减少的细菌是杜克雷嗜血杆菌、康氏嗜血杆菌、微杆菌LKL04、Isosphaera pallida和Actinomyces radingae，3种富集细菌分别为单形拟杆菌、Faecalibaculum rodentium和痤疮丙酸杆菌（q < 0.01）（图4b）。此外，我们还发现，在VDR^ΔLyz小鼠体内，9种细菌显著减少，3种细菌富集。这些减少的细菌是假长双歧杆菌、Bifidobacterium choerinum、动物双歧杆菌、伪欣氏鲍特菌、杜克雷嗜血杆菌、产气荚膜梭菌、链霉菌和产酸拟杆菌，富集的3种菌是青枯雷尔氏菌、Chroococcidiopsisthermalis和痤疮丙酸杆菌(图4b)。数量较少的杜克雷嗜血杆菌是一种革兰氏阴性细菌，也是生殖器溃疡疾病的病原体，在三种条件性VDR基因敲除小鼠中都检测到了这种细菌。与病毒相似，与对照小鼠相比，VDR^ΔPC和VDR^ΔLyz小鼠体内的细菌种类更丰富(总共7种)或更少(总共24种)(图4b)。

7 条件性VDR KO小鼠中病毒和细菌改变的相关性

为了研究病毒群失调的影响，作者评估了结肠中病毒相关受体(图5)。TLR3和TLR7是位于内体中的跨膜PRRs，它们识别核酸并介导细胞外在病毒的识别。作者观察到与对照组VDR^LoxP小鼠相比，条件性VDR敲除小鼠的TLR3和TLR7表达上调，其中VDR^ΔLyz组与对照组有显著差异(P < 0.05)(图5)。

NLR由一个庞大的受体家族组成，其特征是存在一个保守的NOD基序，包括NOD1、NOD2和NLRPs。NLR被激活后不仅对病毒产生应答，也是其他病毒感知途径的重要调节器。与对照组VDR^LoxP小鼠相比，VDR^ΔLyz小鼠中NOD1和NLRP6表达上调，NOD2 RNA显著增加(P < 0.05)；C型凝集素受体(CLRs)通过结合病毒糖链介导细胞对特定病毒的响应。三种条件性VDR敲除小鼠中C型凝集素受体之一的CLEC4L的表达均显著上调，特别是VDR^ΔIEC和VDR^ΔPC小鼠(图5)。条件性VDR敲除小鼠PRRs的显著变化表明VDR对肠道稳态和PRRs表达的影响。

微生物衍生的代谢物能够充当化学信使影响宿主生理机能。因此，作者研究了之前报道过与噬菌体感染相关的细菌代谢产物(图6)。与对照组相比，VDR^ΔIEC小鼠糖酵解途径中的葡萄糖显著降低(P <0.05)；VDR^ΔLyz小鼠的核酮糖/木糖和木糖含量显著增加(P<0.05)(图6a)。此外，与对照组相比，VDR^ΔIEC和VDR^ΔLyz雌性小鼠体内的大部分长链脂肪酸显著增加，而部分脂肪酸仅在VDR^ΔIEC小鼠体内增加。研究表明，10-羟基硬脂酸在感染噬菌体后明显改变，与对照组相比，其在VDR^ΔLyz小鼠中减少，在VDR^ΔIEC小鼠增加(P <0.05)(图6b)。此外，在条件性敲除小鼠中也检测到核苷酸的代谢变化，如VDR^ΔIEC小鼠中的尿苷和VDR^ΔLyz小鼠中的3-urei-doisobtyrate(P <0.05)(图6c)。同样，在条件性VDR敲除小鼠与对照组小鼠的粪便中氨基酸也发生了变化。例如，与对照组相比，VDR^ΔIEC和VDR^ΔLyz雌性小鼠中与噬菌体感染相关的丝氨酸减少，VDR^ΔIEC和VDR^ΔLyz雌性小鼠中与细胞病毒感染相关的谷氨酰胺减少(图6d)。

研究表明敲除小鼠肠上皮细胞(VDR^ΔIEC)、Paneth细胞(VDR^ΔPC)和髓样细胞(VDR^Δlyz)的VDR基因可以显著改变肠道中的病毒分布和病毒与细菌的相互作用（图7）。总体而言，在条件性VDR基因敲除小鼠中，肠道中弧菌噬菌体、乳杆菌噬菌体和大肠杆菌分型噬菌体的组成发生了显著变化。病毒的改变因VDR缺失的不同而不同，如VDR^Δlyz小鼠中有7种病毒发生显著改变，而VDR^ΔIEC小鼠中的牛病毒性腹泻病毒1与对照组小鼠相比显著富集。同时，在条件性VDR基因敲除小鼠中发现了病毒和细菌改变之间的显著相关性。例如，在VDR^ΔPC和VDR^Δlyz小鼠中，弧菌噬菌体JSF5与痤疮丙酸杆菌呈正相关。此外，作者发现VDR缺陷小鼠模型中存在性别差异，雌性小鼠的病毒丰度比雄性小鼠的病毒丰度变化更大。众所周知，噬菌体可以通过影响其死亡率和水平基因转移来直接调节宿主，或通过影响靶宿主细菌来间接调节宿主，从而可能改变微生物群。在有条件地敲除VDR后，肠道中的病毒群和微生物区系的其他方面发生了变化，从而进一步导致微生物生态失调。从功能的角度来看，与感染相关的PRRs和代谢物的显著变化表明VDR对肠道病毒的动态平衡有影响。

Paneth细胞在形成微生物群和宿主防御方面起着不可或缺的作用。Paneth细胞VDR的缺失会损害抗菌功能，影响微生物的聚集，增加结肠炎和感染的易感性。VDR^ΔPC小鼠体内的病毒体变化进一步表明，VDR和Paneth细胞在塑造肠道微生物群和分泌抗菌肽或代谢物方面发挥着重要作用。Paneth细胞可能通过调节细菌数量间接影响肠道微生物群或病毒感染的结果。Paneth细胞还通过TLRs感知微生物，在宿主防御中发挥关键作用。作者研究发现Paneth细胞中VDR缺失可能导致病毒失调，进一步导致上皮屏障受损。

真核病毒，如腺病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒，也存在于一些人的肠道病毒群中，这表明这些真核病毒在宿主中具有潜在的感染能力。BVDV1可感染小鼠并造成显著的组织病理学损害。条件性VDR基因敲除小鼠肠道BVDV1的丰度显著增加，表明VDR在病毒感染和宿主存活中的重要性。此外，维生素D的缺乏与HIV的发病机制和病程相关。缺乏维生素D的艾滋病患者所生婴儿感染风险增加，存活率下降。此外，通过meta分析，VDR基因FokI多态性与呼吸道合胞病毒感染的易感性一致相关。

先天免疫反应是非特异性的，是抵御病原体的第一道防线，引发抗原提呈，包括对病毒感染的反应。作者发现PRRs在VDR^Δlyz小鼠中有显著的变化，包括TLR3、TLR7和NOD2的表达上调，在VDR^ΔIEC和VDR^ΔPC小鼠中CLEC4L的表达增加，这表明VDR对肠道病毒的稳态的影响。组织特异性VDR缺失对肠道受体的影响是不同的。例如，髓样细胞中VDR的缺失会显著增加TLR3、TLR7和NOD2的表达，而肠上皮细胞中VDR的缺失更可能会增加CLEC4L的水平。已知单核细胞和表皮角质形成细胞中的TLR受到VDR的影响。在接受抗病毒药物鸡尾酒疗法的小鼠中，肠道病毒实体的减少可能通过TLR3和TLR7信号增加对右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎的易感性，最终导致有尾噬菌体目病毒水平增加，在IBD患者中也观察到类似的状况。研究表明，VDR缺失会导致更高的感染和慢性炎症风险。

噬菌体的多样性和丰度被认为影响肠道中的细菌群落。作者发现VDR状态改变的病毒群与细菌之间存在显著的相关性。噬菌体和相关细菌的富集是一致的，如噬菌体及其宿主霍乱弧菌。动物双歧杆菌是临床上广泛使用的益生菌之一，其与BVDV1和JSF6弧菌呈负相关。动物芽孢杆菌对肠道屏障的保护受损可能会进一步增强宿主对BVDV1等致病病毒的感染，以及对JSF6噬菌体等噬菌体的肠道细菌的感染。同样，被发现对结肠炎有很强保护作用的产酸拟杆菌含量较少，因此与BVDV1呈负相关。同时，伪欣氏鲍特菌与JSF5噬菌体呈正相关。作为波氏杆菌属的一个新成员，Bordetella pseudohinzii假鼻疽杆菌最先从实验室饲养的小鼠中分离出来，目前已在世界各地的小鼠设施中检测到。感染小鼠的支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞数量增加，组织病理学检查显示炎症征象增加，但没有明显的临床症状。这些病原体可能通过与肠道微生物合作而诱导更严重的炎症。同样，VDR^ΔPC和VDR^Δlyz小鼠的噬菌体JSF5和伪欣氏鲍特菌的丰度与对照组小鼠相比也发生了变化。

微生物代谢产物在不同的细胞过程和功能中起着重要的作用。我们发现病毒相关的代谢物和途径发生了显著的变化，比如脂肪酸代谢。致病性真核病毒以脂滴为复制平台，许多非致癌真核病毒在感染过程中与糖酵解、核苷酸合成、脂肪酸生物合成和谷氨酰胺降解等代谢改变有关。这一发现可以解释我们的研究结果，即VDR^ΔIEC和VDR^ΔLyz小鼠中许多长链脂肪酸和脂肪酸代谢物增加。

虽然噬菌体是肠道中数量最多的微生物之一，但也是最不为人所知的。研究发现，噬菌体捕食不仅直接影响敏感细菌，而且通过细菌间的相互作用对其他细菌物种产生连锁效应。此外，正如代谢组学所揭示的那样，噬菌体捕食引起的微生物群落的变化对肠道代谢组有直接的影响。与对照组相比，条件性VDR基因敲除小鼠体内一些与噬菌体感染相关的代谢物水平发生了变化。例如，VDR缺失减少了粪便中的丝氨酸。此外，特定病毒引起的精确新陈代谢变化往往与周围环境相关，甚至在同一病毒家族内也可能有所不同，或者在很大程度上取决于单个宿主。因而，慢性病中病毒新陈代谢调控的复杂性是未来的一个研究领域。

图8. 宿主、细菌和病毒之间的相互关系。

作者目前研究的主要局限在于它的描述性。目前，噬菌体和病毒体及其与细菌相互作用的宏基因组学研究尚处于起步阶段，尚需开展关联性研究以探索新的动物模型。本研究的目的之一是建立一种合适的统计方法来分析宿主、噬菌体、病毒和细菌之间的相互作用。目前的研究没有从相同的小鼠身上收集相同的粪便样本进行微生物群和代谢物分析。无法研究来自同一宿主的病毒和细菌的变化以及新陈代谢的变化。综上所述，第一，条件性VDR基因敲除会导致病毒丰度和多样性的改变，以及病毒肠道受体功能的改变，这可能会进一步导致肠道生态失调和感染风险(图8)。第二，在组织特异性缺失的小鼠中，相关的粪便代谢产物发生了改变，这进一步证实了微生物失调的后果。VDR状态对肠道病毒(尤其是噬菌体)的显著改变可能有助于发展肠道噬菌体-细菌或肠道病毒-细菌疗法来对抗病原体。第三，填补了VDR如何以组织特异性方式影响病毒的知识空白。这些变化的生理学相关性将在未来的消化系统疾病和感染模型中得到评估。值得注意的是，越来越多的证据表明VDR的激活在肠道病毒-宿主的相互作用中具有调节作用，需要更多关于维生素D的感知和VDR之间的相互作用的信息。