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导读
海洋中的环境条件在多个时空尺度上发生变化。本研究中我们提出了在地中海东部的超寡营养区的六次季节性航行期间（2年），时间、深度和颗粒大小是否会影响细菌群落结构。细菌群落在颗粒大小（游离（free living, FL）vs. 颗粒附着（particle-associated,PA））之间变化最大，随后依次是水深、季节。游离状态的细菌群落在分类学上比颗粒附着的群落更丰富、更稳定，其特征是异养细菌如Alteromonas和Ralstonia的反复大量出现。FL和PA的异养群落也与不同的环境参数相关：FL群落与水深和浮游植物相关，而PA群落主要与采样时间相关。然而，群落结构的很大一部分变异不能用测量的参数来解释。使用PICRUSt从16S rRNA扩增子数据预测的PA群落的代谢潜力在与生物大分子以及塑料、其他石油产品和除草剂的降解和利用相关的通路中十分丰富。FL群落富集了磷酸肌醇（一种潜在的磷源）和多环芳烃的代谢通路。
原名：Particle-associated and free-living bacterial communities in an oligotrophic sea are affected by different environmental factors
译名：寡营养海洋中颗粒附着和游离状态的细菌群落受不同环境因素的影响
期刊：Environmental Microbiology
IF：5.491
发表时间：2021.5.25
通讯作者：Daniel Sher
通讯作者单位：海法大学Leon H. Charney海洋学院
本研究于2年的时间里在R/VMediterranean Explorer的甲板上停靠n-1200站点（32 27.36 N, 034 22.47 E），并进行了6次一日巡航采样。两次航行在秋季（2014年12月1日；2015年11月18日），两次在春季（2015年3月24日；2016年3月30日）和两次在夏季（2015年7月14日；2016年7月25日）。从5到6个深度收集水样，分别在10 m（水体表面），70 m（1/2 DCM），140 m（DCM），200 m和500 m（在2015年11月巡航期间，当叶绿素浓度最大时，样品是在50 m和100 m处收集）。在几次巡航中，从水深140 m（DCM）到200m处（称为“光照区”或TZ）收集了额外的样本。采样后测量了水体色素、营养成分浓度并进行了流式细胞计数；提取水样中的DNA并进行16S rRNA测序。
1. 巡航期间地中海东部（EMS）的物理、化学和生物特性在2014-2016年期间，在EMS中观察到海洋表面叶绿素的明显季节性循环，在冬季和早春达到最大值，在夏季达到最小值，与其他研究的原位测量结果一致（图1B）。我们的采样巡航时间与秋季表面叶绿素的增加、春季随后的减少阶段以及在超寡营养的夏季条件保持稳定的状态相吻合。表面叶绿素的变化与水体结构的变化有关，夏季高度分层，秋季混合深度增加，早春达到峰值（图S1）。常量营养元素分析显示，低至约200米的地表水的硝酸盐+亚硝酸盐和磷含量较低，与秋季和春季相比，7月份的值最低（图S2）。除了2015年11月的一次航行，在所有航行中都观察到DCM的叶绿素a浓度通常在秋季和春季较低，在夏季较高。虽然在表面叶绿素中观察到明显的季节性模式，但在光照区内不同浮游植物群的组成和相对丰度中观察到更复杂的变化模式。根据流式细胞术计数，在一年中的大部分时间里，原绿球藻是数量最丰富的浮游植物，特别是在水体深处（1⁄2 DCM和DCM），而聚球藻通常在海洋表面更丰富（图S3）。光合色素分析证实了主要在DCM中存在大量原绿球藻，但也表明其他浮游植物可能在生物量方面占主导地位（图S4）。具体来说，
19'-
己酰氧基岩藻黄素（‘19-hex’），一种定鞭金藻类的色素特征，在DCM中相对丰富，尤其是在第一年。还观察到与鞭毛藻和可能的硅藻相关的色素，但没有明显的时间模式。这些结果与其他研究一致，表明超微真核生物是浮游植物群落的重要组成部分，特别是球石藻（定鞭金藻类），它在时间和水深上都是动态变化的。浮游植物群落缺乏明确的季节性模式表明存在非季节性（可能是非周期性）成分，这可能会影响异养细菌可用的溶解和颗粒有机物的动态。图1. 地中海东部（EMS）的超寡营养区的季节性模式。A. EMS是超寡营养的，其条件与主要的海洋环流类似。地图显示了1997年和2004年之间的海面以及以色列海岸沿线（2015年3月22-25日平均值）的叶绿素a浓度（mg/m3）。B. 来自卫星数据的海面叶绿素年度动态，显示了秋季（蓝色）、春季（绿色）和夏季（红色）期间六次研究巡航的时间。2. 细菌群落结构随颗粒大小、水深和季节的变化概述接下来我们提出了关于微生物群落结构是否因季节、水深或颗粒大小而异的问题。如图2所示，颗粒附着的细菌群落（PA，> 11 μm）和游离的细菌群落（FL，5-0.22 μm）之间的群落结构有所不同，同样也受水深影响。这些结果与之前关于多个生态系统的研究一致。我们还分析了中等大小颗粒附着的几个样品（11-5 μm，图2A和B中的星号），其群落结构与PA和FL部分有些相似，与之前的研究一致，表明不同尺寸颗粒附着的细菌种群结构不断发生变化。虽然在NMDS排序中没有观察到明显的季节聚类（图2B），但
置换
MANOVA检验表明，季节性仍然是一个重要的解释变量，尽管与颗粒大小和水深相比具有较低的解释度（ADONIS测试，R2分别为0.095、0.078和0.050，对于颗粒大小、水深和季节，所有测试的p < 0.001）。实际上，FL和PA群落之间的Bray-Curtis差异最大，其次是水深差异，在季节之间观察到的变异性最低（图2C）。因此，虽然以前的研究记录了微生物种群结构主要是在沿海地区存在季节性变化，但在开放的EMS中，颗粒大小和水深是造成微生物群落组成差异中更重要的驱动因素。尽管FL和PA群落都随水深而变化，但FL群落的变化更为明显，主要差异来自光照区（此处定义为浅于200 m）和中层（200和500 m，图2A，图S5、S6B、S7B)。分层季节采样深度之间的差异高于春季，这与冬季/春季混合导致的水体部分同质化一致（Kruskal-Wallis检验，p < 0.001，图S6B）。PA群落的变化随采样水深减弱，在NMDS分析（图2）中观察到，但在一维聚类或水深之间的beta多样性比较中未观察到（图S5和S6C）。相反，PA群落似乎划分为以γ-变形杆菌（主要是Alteromonas）为主的样本，以及以
Planktomycetes
、拟杆菌或β-变形菌为主的样本，没有明显的季节性模式。有趣的是，FL和PA群落之间的差异在海洋表面较低，随着深度增加而增加（图2，图S6A）。这与之前的一些研究以及颗粒起源于海洋表面的机制一致，这些颗粒可能是本土形成的，也可能来源于大气来源的颗粒（例如灰尘）。这些颗粒主要由表层细菌定植，随着颗粒下沉，FL和PA种群之间的细菌交换随着深度的增加而减少。与水深变化相反，PA群落的季节性变化高于FL群落（图S6D和E）。在FL群落中，海洋表面和1⁄2 DCM样本的季节性变化比更深的样本更低。我们最初预计海面的季节性差异最大，反映了海面温度全年的主要变化（图S1B），这也被认为是微生物群落结构和功能以及营养浓度变化的主要驱动因素（图S2）。在中等深度（100-200 m）检测到的较高的季节间差异可能与支持多种深部浮游植物种群的光照的质量和强度、或季节混合对营养跃层深度的影响有关。图2. 颗粒大小、水深和季节对细菌群落结构的影响。A, B. 细菌群落的非参数多维标度（NMDS）图，按深度（A）和季节（B）着色。完整形状是FL，开放形状是PA，两组沿NMDS的轴2明显分开。FL和PA群落沿NMDS轴2随深度变化聚类，但不按季节聚集，NMDS stress = 0.11。C. Bray-Curtis差异在不同颗粒大小中最高，其次是深度和季节。计算组内差异，例如在相同的巡航和颗粒大小内进行水深比较。颗粒大小的平均值在统计上具有显著差异（Kruskal-Wallis检验，p < 0.01）在粗粒度和精细的系统发育分辨率下，不同的进化枝在FL与PA种群中或在光照层和无光照层之间占主导地位。正如从寡营养海中所预期的那样，FL种群主要由来自SAR11进化枝（Pelagibacter）的α-变形菌的16S rRNA序列主导，其占约40%的FL部分序列，这些种群主要在表层水中。使用线性判别分析（图S7A）鉴定了几个SAR11的ESVs（代表不同的16S rRNA进化型）在FL和PA群落之间存在丰度差异。其他相对丰富的异养细菌谱系是SAR86（γ-变形菌，夏季和春季在地表水中高达15%）、SAR406（Marinimicrobia，在较深水域高达8%）和SAR202（Chloroflexi，主要在中等深度，高达12%）。此外，属于黄杆菌科和红螺菌科的特定ESVs也被鉴定为在FL种群中富集（图S7A）。相反，PA群落则包含大量的γ-变形菌和浮霉菌门，以及少量有β-变形菌、δ-变形菌或疣微菌门，研究指出这些门以前与大西洋、波罗的海和地中海的海洋颗粒有关。PA种群中富集了4个ESVs，其中3个是Alteromonas macleodii。比较光照层和无光照层时，光照层蓝藻和拟杆菌相对较多，而水深较深的样品中δ-变形菌、Marinimicrobia和绿弯菌门相对丰富。在ESV水平上，聚球藻、酸微菌目OM1进化枝、紫红球菌科和黄杆菌科在光照区显著富集（S7B）。在不同季节中不存在有显著丰度差异的ESVs。值得注意的是，尽管我们主要在FL种群中观察到Prochlorococcus和Synechococcus等超微蓝藻，但它们也占PA群落约6%的16S rRNA读数，以及高达约21%的群落在11-5 μm的颗粒中（图S5）。Prochlorococcus和Synechococcus主要是游离的细胞，然而，先前的研究表明，超微蓝藻确实有助于颗粒沉降通量，尽管这一过程的程度尚不清楚，并且可能取决于特定的海洋条件。一些超微蓝藻ESVs在PA种群中相对更丰富（例如ESV00110和ESV00199），而其他大多数在FL种群中更丰富。这表明一些超微蓝藻更可能与颗粒大小有关。因此，虽然我们不能完全排除实验上的人为因素（例如过滤器堵塞）对这种现象的影响，但PA中Prochlorococcus和Synechococcus的存在表明这些进化枝可能参与EMS中颗粒的沉降通量。4. 颗粒附着和游离的细菌群落具有不同的ESV动态鉴于微生物群落结构主要在颗粒大小之间变化，我们提出这些种群之间的生物多样性（α-多样性）是否不同。几项研究表明颗粒表面的α-多样性高于周围水域的α-多样性，多样性的增加表明生态位数量增加。这些研究大多来自生产力相对较高的地区，例如北海、波罗的海以及地中海西部和大西洋的沿海地区。然而，在EMS中，尽管两者群落均匀度没有显著差异，但FL种群更多样化且比PA种群包含更多的分类群（图3A）。这与来自主要海洋环流和西地中海近海的其他研究结果一致。群落的生产力（营养状态）可能决定了FL或PA群落是否更多样化，这可能是因为生产力更高的区域往往会生成更大的颗粒或更大的浮游植物，并具有更多的微生态位（例如缺氧）。FL种群的Shannon多样性和分类群数量随着整个光照区的深度增加，而PA却不是这样（图S8）。这再次表明，尽管表层水温度存在变化，但中等水深可能比表层水能够为FL细菌提供更多的生态位。除了多样性较小之外，一些PA群落还由少数ESVs主导（图S5）。最丰富的ESV在PA群落中占16S rRNA读数的21%，而在FL群落中不超过约8%（图3B）。我们还观察到FL群落中更高的进化枝内多样性，例如，有9、3和2个ESVs分别属于主导特定PA样本的Alteromonas、Oleibacter和Ralstonia进化枝，FL中丰富的进化枝SAR11、SAR86和SAR406分别有192、71和60个不同的ESVs。
此外，FL和PA群落中最丰富的ESV的时间动态变化模式也存在极大的差异，FL群落比PA群落更相似。尽管时间和水深模式不同，但在每次巡航的至少一个水深的样本内都观察到了10个相对丰富、呈游离状态的SAR11 ESVs（图3C）。同样，在所有航行中也观察到了5种最丰富的蓝藻ESVs（也是FL），它们随时间和水深的动态变化与流式细胞计数（图S3）和在其他寡营养海洋中观察到的生态型水平动态一致。相比之下，PA种群中多数局部丰富的ESVs在一两次航行的样本中高度占据主导地位，而在其他航行中很少或几乎不存在，与大西洋沿岸的观察结果相似。例如，在2015年春季和夏季，与Alteromonas macleodii（一种γ-变形菌）密切相关的4个ESVs非常常见，它们共同构成了高达65%的测序读数，在其他采样时间发现这些相同的ESVs的相对丰度要低得多。同样，Ralstonia（一种β-变形菌）在2015年夏季和秋季的中间深度占据主导地位，而Oleibacter（也是一种γ-变形杆菌）在2016年春季和夏季占主导地位。在补充信息中详细描述了与先前定义的生态型相关的SAR11、Prochlorococcus、Alteromonas和Ralstonia。在许多情况下，相同的ESV在同一时间的重复样本或来自同一次巡航不同深度的样本中占据了主导地位（图3C）,这表明特定ESV在样本中占主导地位的情况代表“异养细菌大量出现”，这不仅仅发生在单个颗粒上，而是代表特定时间和深度的PA群落的一般特征。
图3. FL和PA群落的多样性和ESV动态不同。A. FL群落比PA群落更加多样化，包括更多的分类群。香农多样性和分类群数量的差异具有统计学意义（Kruskal-Wallis检验，Shannon p = 0.0002，分类群数量p = 0.01，均匀度p = 0.09）；B. 每个样本中最常见ESV的相对丰度的深度剖面图（巡航、水深和颗粒大小，显示在图表上方）；该面板强调PA样本通常具有单一的主导ESV（每个样本中显示的ESV可能不同）；C. 每次航行中FL和PA群落中20种最常见ESVs的相对丰度的深度剖面图。对于具有重复样本的深度，显示了重复的平均值。当多个门被绘制在一起时，箭头指向单个ESVs，箭头按门水平着色。5. 不同环境因素影响了颗粒附着和游离的异养细菌群落
FL的细菌多样性在中间深度（例如DCM）的增加，以及在PA群落中观察到的“异养细菌大量出现”，促使我们提出异养细菌群落结构是否可能至少部分是由与特定的相互作用的浮游植物群来决定的。浮游植物可以通过提供颗粒生态位和有机物质来源以及通过直接信号传递来影响异养细菌。为此，我们寻求异养细菌群落结构与季节性、水深和浮游植物群落结构相关的三个条件矩阵之间的统计相关性，后者由光合色素浓度的比率定义（图S4)。如图4所示，水深相关参数矩阵解释了FL种群中最大的变异量（16%，使用VPA评估），水深和无机养分浓度（NO3 + NO2)是重要的解释变量。仅与季节和色素相关的矩阵解释的变异量很小，但色素和水深矩阵的组合具有显著的解释力。与其他研究相比，在我们的分析中，温度并不是一个重要的解释变量，这可能是因为我们数据集中的水深和营养成分的共同变化（图1F）。在与FL异养种群结构显著相关的四种光合色素中，两种与蓝藻相关，特别是Prochlorococcus（DVChl-a、Chl-b），一种与定鞭金藻类（19’-hex）相关。与FL异养细菌群落相比，季节相关参数矩阵是PA异养细菌群落的唯一具有统计意义的决定因素，与浮游植物群落的相互作用很小但很重要。然而，CCA分析没有发现任何与季节相关的特定参数是显著的，这与大西洋沿岸的一项研究一致。我们推测PA群落动态（包括“异养细菌大量出现”）主要是由不同时间存在的特定类型的颗粒驱动的。在某种程度上，这些可能是由存在的特定真核浮游植物驱动的，它们不遵循明确的季节性模式。然而，浮游植物和PA群落之间相对较弱的关联表明可能存在其他类型的颗粒。综上所述，FL和PA群落结构的差异，主要的ESVs的动态变化以及与特定环境参数的相关性都表明了驱动EMS中FL和PA的异养细菌群落结构的主要因素完全不同。
6. 预测可能导致FL和PA异养群落结构变化的代谢功能
在这项研究中，我们计算了已知会影响实验室细菌生理学的多个环境参数，预计这些参数会推动海洋中的细菌群落结构（图S1-4）。总的来说，异养种群结构变异的大约30%-43%可以通过与季节性/时间、水深和/或浮游植物群落结构的相关性来解释（图4）。解释异养细菌群落结构剩余57%-70%变异的因素可能包括非确定性（中性）因素，例如本研究未测量的物种迁移和/或环境因素。我们使用16S rRNA扩增子数据本身提出了关于可能驱动异养细菌群落结构的其他环境条件的可测试假设来针对第二个选项。我们使用PICRUSt预测了异养细菌群落的宏基因组，并找到了在PA和FL异养细菌群落之间具有丰度差异的特定代谢通路，因为这些微生物种群之间的差异最为明显（图2和图3）。如图5所示，与FL异养细菌群落相比，PA中富含许多代谢通路，这与颗粒附着的细菌通常具有更庞大的基因组和更丰富的代谢能力一致。除了与大分子降解相关的预期通路之外（图5），PA群落中也富集了其他用于降解人为污染物的代谢通路，例如石油和/或塑料工业中广泛使用的有机化合物（例如己内酰胺、苯乙烯、二甲苯、双酚A、乙苯和甲苯/硝基甲苯）。其他通路与除草剂、杀虫剂或参与其合成的化合物（例如氟苯甲酸盐、莠去津）的降解有关。
塑料（包括微塑料颗粒）在许多海洋环境中无处不在。塑料的表面可以供细菌定殖并利用。塑料还会渗出溶解的有机碳，这可能会刺激细菌生长，但这些浸出液也可以抑制关键生物的生长，如微型浮游植物。最后，塑料还被认为会吸附许多其他污染物，例如杀虫剂，导致后者分子的浓度局部增加。我们推测微塑料的存在可能会选择能够定殖和利用这些碳源的PA细菌，同时对有毒渗滤液和吸附的污染物具有抵抗力，从而影响异养PA细菌群落结构。如果这是正确的，那么在颗粒上观察到的“异养细菌大量出现”可能不仅与不同的浮游植物有关，而且与不同时间存在的不同人为颗粒有关。
与PA相比，FL的异养细菌中只富集了两种通路，一种用于降解多环芳烃（PAH），另一种用于降解磷酸肌醇。EMS中的PAH可能来自当地的人为污染和/或PAH可能来自穿过南欧污染地区并沉积在EMS中的气团的气溶胶颗粒。磷酸肌醇是一组普遍存在于动物中的信号分子，是植物种子中磷储存的主要形式，也是一些淡水浮游植物中磷存在的形式。它们在环境中广泛存在，但研究相对不足，表明我们对全球磷循环的理解仍有一定差距。
图4. 不同的环境因素与PA和FL异养细菌的群落结构相关。图中显示了方差分解分析的结果，数字代表了每组环境参数解释的变异分数。当没有显示数字时，这个矩阵没有解释力（零或负）。星号代表统计显著性：* < 0.05、** < 0.01、*** < 0.001，使用典型对应分析评估。当显示色素时，它们与叶绿素a的比率与异养种群结构显著相关。图5. PICRUSt预测的KEGG通路在PA（红色）和FL（蓝色）异养种群中富集。通路按KEGG编号排序，与动物或植物源性化合物降解和人为污染物降解相关的通路分别以绿色和橙色标记。富集的通路具有调整后的p < 0.05和log2差异倍数> 0.58（1.5倍变化）。苯甲酸和乙苯是大量人为产生的，但也可以自然产生（在天然石油或焦油中），因此标记为橙色和绿色。同样，甲苯被广泛用作稀释剂和石油工业，但也可以在某些树脂中找到，因此标记为绿色和橙色。在与人为污染降解相关的异养PA群落中富集的通路数量以及这些通路中的基因数量均高于所分析的全套KEGG通路中的通路数量（Fisher精确检验，对于通路数量，p = 0.0081；对于PICRUSt中KEGG通路中的基因数量，p < 0.001）。参与降解人为污染物的通路的富集对于PA与FL的比较是特定的：随深度共同变化的通路在这些功能中没有富集（Fisher精确检验，p = 0.702），虽然这些通路富集可能存在一些季节性信号，但并不显著（Fisher精确检验，p = 0.054）。了解决定海洋微生物群落结构和功能的无数因素需要两个不同的观点，并在不同的尺度上运作。一方面，受季节变化等行星现象驱动的海洋学过程决定了水体的物理结构（例如温度、分层）。这些反过来又会影响化学条件，例如营养物质的供应和可用性以及细菌在不同地点之间的移动。另一方面，决定生物体可以在哪里生存的生理特征以纳米或微米的尺度运作。例如，这些包括对营养物质的亲和力或生物体游泳、执行趋化性和定植颗粒的能力。这些想法虽然很简单，但提供了一个框架，即可以根据物理和生物驱动因素解释和理解观察到的群落结构模式。在这项研究中，我们旨在弥合这两种观点，描述EMS中的微生物群落如何在PA和FL群落之间、跨深度和跨季节变化。我们的结果表明，与季节性相比，细菌“生活方式”（游离状态或与颗粒附着）和水深是细菌群落结构的更强驱动因素。此外，PA群落表现出与FL完全不同的动态，多样性较低，并表现出“异养细菌大量出现”，其中不同的细菌进化枝在特定时间和水深占主导地位。
在这项研究中，我们能够使用“非生物”环境条件（深度和季节矩阵）解释FL和PA群落结构中不到30%的变异。这与大多数其他海洋环境中浮游细菌的研究一致，表明未测量的环境变量或过程（包括迁移等中性过程）在解释群落组成方面的重要性。我们提出了一种过程：即使在寡营养区域生物体的相互作用也可能影响微生物种群结构。为了支持这一假设，只有仅包括深度和浮游植物群落结构矩阵，才能解释FL异养种群结构中20%的变异性。重要因素包括与定鞭金藻和原绿球藻相关的色素。先前的实验室研究表明，这两种生物都与共生的异养细菌相互作用，反过来又受到它们的正面或者负面影响。我们发现这些浮游植物类群的存在主要与异养FL种群结构相关，表明EMS中的主要相互作用是通过生产和利用溶解有机物发生的，而不是通过接触介导的相互作用，例如在藻际环境中。
我们推测人造污染物（包括杀虫剂、石油产品和塑料）代谢的预测通路在PA群落中比在FL群落中更为丰富。这些结果基于群落宏基因组的推论，这是一种最近被提出来识别浮游细菌生物地理学基础代谢变化的方法。然而，这种方法可能会受到许多因素的影响，包括基因组数据库中不同异养细菌谱系的不同代表以及16S rRNA序列密切相关的分类群之间的基因组变异。此外，人造污染物的降解途径与核心细胞代谢高度交联，我们无法确定任何明确的人造污染“标记基因”。目前我们没有从EMS跨时间和空间测量此类污染物，这对于测试此类分子的潜在影响至关重要。我们注意到，可能由于分析原因（成本、检测限等），人造污染物很少被纳入海洋航行或时间序列观测站期间的测量指标中。因此，它们的分布和动态的全球地图是稀缺的，类似于营养物、微量金属或有机碳的地图。然而，人造污染物会影响海洋微生物的生理机能，尽管可以为某些生物群提供营养，但也可能会毒害其他生物，包括位于寡营养食物网底部的微微型蓝细菌。我们的结果表明，需要更好地理解人为污染物作为海洋微生物群落的潜在驱动因素，并提供关于可以通过实验解决的特定类别的人造污染物的潜在影响的新假设。最后，这项研究的结果和假设在多大程度上可以从EMS推广到其他寡营养海洋？EMS在寡营养海洋环境中是独一无二的，因为它严重消耗磷源，无机养分与溶解和颗粒有机物的N:P比> >16:1，而在大多数其他海洋环境中约为16。这可能解释了在异养FL群落中利用磷酸肌醇的预测代谢通路的富集。此外，EMS靠近陆地可能会增加人造污染的输入通量，尽管这种污染在海洋的最偏远地区也很普遍。鉴于EMS的相对可及性及其作为为数百万人提供生态系统服务的海洋的重要性，我们预计它将成为一个有用的模型系统来研究影响寡营养微生物群落的过程以及这些过程如何在不断变化的世界中变化。
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