综述 | Environ. Microbiol.：藿烷类化合物在增强根瘤菌对抗气候变化中的作用

2021-09-01 14:48

随着气候变化，根瘤菌对可持续农业的作用是不可否认的。根瘤菌可以减少对氮肥的依赖，而且可以改善极端水势对植物生产力的负面影响。

导读

细菌是全球性的可持续的固氮源，对生命和现代农业至关重要。固氮细菌，包括根瘤菌，参与了全世界的豆科植物促进生长的共生生物。为了成为有效的共生体，根瘤菌必须克服多种环境挑战：从在土壤中生存，到向植物环境过渡，到在根瘤内维持较高的代谢活性。气候变化可能加剧这些挑战，特别是通过土壤水势的波动。了解根瘤菌如何应对环境压力对保持未来的农业产量至关重要。细菌的外膜是抵御物理和化学环境压力的第一道防线，而脂类在决定外膜的坚固性方面起着至关重要的作用。特别是，脂质A和甾醇类似物(即藿烷类化合物)的结构重塑在适应压力方面有重要作用。本研究主要讨论了根瘤菌的独特的外膜脂组成，可以通过增强膜的韧性来应对气候变化导致的渗透压力。本研究说明了研究微生物膜的重要性，并强调了开发可持续的土壤添加剂的潜在途径。

论文ID

原名：The role of hopanoids in fortifying rhizobia against a changing climate

译名：藿烷类化合物在增强根瘤菌对抗气候变化中的作用

期刊：Environmental Microbiology

IF：5.491

发表时间：2021.5

通讯作者：Dianne K. Newman

通讯作者单位：加州理工学院生物与生物工程系

综述目录

1. 根瘤菌的生命循环

2. 根瘤菌外膜

3. 外膜与渗透压力

4. 结论

主要内容

1. 根瘤菌的生命循环

在根瘤菌与植物直接相互作用之前，根瘤菌必须在复杂并且远离静态的土壤环境中生存(图1)。土壤是多样性栖息地，重要的化学和物理参数在区域或局部变化。根据部分粘土的性质和数量非根际土被分成不同的土壤类型。土壤在pH值(酸性到碱性)、矿物和有机物含量、颗粒大小/密度等参数上存在很大差异。土壤有机质含量和粒度与土壤保水能力有相关性，随着时间的推移影响土壤水势。除了非根际土壤之外，土壤中的环境参数(包括微尺度下孔隙的水势)也会对细菌有相当大的影响。植物对土壤环境的影响也同样要重点考虑，特别是在根际—植物根系附近的土壤领域。随着豆科植物的生长，它们会使土壤酸化，这既是固氮的直接结果，也是溶解磷的一种方法。

水势是气候变化对根瘤菌最重要的影响因素之一。降水将变得更加极端：根据地理位置的不同，降水要么减少，导致干旱和缺水，要么增加，导致更严重的洪水。这些降水变化直接影响水势。在干旱期间，水势会随着土壤的干燥而减少，而在降雨期间，水势会增加。改变水势会对当地土壤化学产生影响，例如，由于矿质颗粒的化学风化引起土壤pH值的变化，或由于水饱和或微生物代谢活动的刺激而改变当地的氧浓度。渗透压也可能发生剧烈变化，这是因为改变水势会影响微环境中溶质的浓度：干燥会使残余水囊提高渗透，而淹水会使它们降低渗透。如果我们可以理解细菌是如何应对低渗透和高渗透的改变，那么我们就有可能选择出根瘤菌菌株，这些菌株可以在受气候变化影响的土壤条件下生存。

万一根瘤菌成功地在土壤环境中存活，它们必须向豆科寄主过渡(图1)。具体来说就是，为启动共生关系，根瘤菌和豆科植物宿主交换化学信号，允许根瘤菌在根表面定居并入侵根组织。在根内，一些细菌被植物细胞吸收，这些细菌被植物衍生的共生体膜包围。这种可见的结构被称为根瘤，然后通过植物发育过程和植物细胞质内的细菌增殖发展。

图1. 根瘤菌的双重方式-从土壤到植物。左边显示的是土壤或根际中的自由生活阶段。随预测气候变化(由工厂排放的烟雾表示)而发生的降水变化(干旱和洪水)。游离根瘤菌可能会受到干旱(高渗和干燥)或洪水(低渗和低氧)的土壤胁迫。右边是豆科植物(如大豆)的根和圆形根瘤。图示根瘤的近照，显示了根瘤的阶段。共生体膜在共生体空间中被质子激活，其中还包含氨基酸、糖、钙离子和红色螺旋状蛋白。与结核环境(低pH、低氧和高渗透压)相关的应力被注意到。

在共生体膜和细菌外膜之间是共生体空间，植物和细菌的蛋白质和代谢物在此混合。为了充分理解细菌在共生过程中的经历，必须明确共生空间微环境和过渡过程的化学和物理性质。但是，由于缺乏工具，直接描述报告感兴趣的在活体组织中至关重要环境参数，如pH值、渗透压、离子强度等是一个挑战。我们目前的研究在很大程度上依赖于间接证据，利用细菌突变体的适应度来推断细菌所经历的胁迫，特别是在根瘤形成过程中。此外，不同的植物宿主在根瘤菌中产生不同的蛋白质和代谢物，进而影响内化的细菌，所以我们需要根据其中一种豆科根瘤菌的伴生关系来进行抵制。因此，需要对不同的豆类-根瘤菌伴生关系进行比较。

根据前人研究，无论宿主是什么，根瘤环境都最适合高能量固氮过程。豆科植物为高代谢活动提供必需的分子，包括来自光合作用的丰富碳源。植物宿主还利用氧结合蛋白和豆血红蛋白来维持恒定的低纳摩尔氧浓度，豆血红蛋白在提供足够氧气维持细菌有氧呼吸的同时，也保护对氧敏感的固氮酶使其免于失活。为了促进必需营养素(如糖、固定氮、铁)在细菌和植物细胞之间的主动运输，植物将质子泵入共生空间。这个过程使共生空间酸化，可能会导致部分细菌的高代谢率，也增加了相当大的压力。紫花苜蓿共生体空间的酸性已被直接证实，pH值在4.5-5之间。

共生体的总渗透量还没有被直接测量。对大豆根瘤共生体空间组成的代谢组学研究大概估计了共生体空间里低分子量有机化合物的浓度为180 nM。但是，这个值并不能解释无机离子或蛋白质，这说明真正的共生体渗透压可能更高，甚至可能接近细菌细胞质的渗透压。共生体空间渗透压提高的假说得到了间接证据的支持。相容的溶质，如由细菌合成的海藻糖，为了应对渗透压升高，以一种与蛋白质功能兼容的方式来增加内部渗透压。在根瘤菌中，相容性溶质生物的合成和运输突变体的研究表明，从起始到固氮过程，相容性溶质对于有效共生是必要的，这再次说明了共生空间中渗透压的升高。

总的来说，现有的研究数据表明共生空间环境是具有低pH、低氧、高渗透压以及细菌和植物蛋白和代谢物的混合的特点，这可以促进营养物质的转换和交换。虽然共生体空间给细菌带来了许多挑战，但是它可能是促进氮固定的相对静态环境(虽然因外部环境的变化，共生体环境如何而变化尚未深入研究)。对于两种生活方式，特别是随着气候变化，根瘤菌必须要在一定范围的渗透环境中生存，并能够过渡到不同的渗透浓度。

2. 根瘤菌外膜

在环境变化中，根瘤菌采用什么方法来促进生存?它们可以通过调节蛋白质的合成或活性来做出响应，但是在最初的几秒钟里，它们必须依赖于外膜—细胞与环境之间的关键分隔物。外膜对变化条件的即时被动反应取决于外膜的物理性质—主要是流动性和机械稳定性。这些特性是由脂质的组成决定的。稳定性对于维持低渗透性很重要，但高稳定性通常是以牺牲流动性为代价，而流动性对于双分子层内横向扩散的膜蛋白的功能至关重要。因此，最优的生物膜是处于流动性和稳定性两大对立特征之间的(图2)。本研究简要总结了根瘤菌外膜的主要脂质成分以及如何促进根瘤菌外膜的强化并维持流动性和机械稳定性之间的平衡。

图2. 生物膜的物理特性。A.脂膜的三个阶段，从左边无序的液体开始，酰基链可以自由运动，脂酰基可以自由扩散。在中间的液态有序相中，脂酰基仍能扩散，而酰基链的移动受到限制。最后，在右边的凝胶相中，脂酰基和酰基链的移动都受到了限制。含里白醇在液体有序相中显示，由于它能够阻止相变转变为液体无序或凝胶相，并促进液体有序相的维持。B.在渗透压的变化过程中，细胞经历了如图所示的各种变化。

革兰氏阴性细菌的外膜是不对称的，内小叶由磷脂组成，外小叶含有脂多糖(LPS)。脂多糖包括脂质A(LA)，脂质A由一个糖主链和各种脂肪酸组成的(直接与其他外膜的磷脂相互作用)以及一个外部区域(核心寡糖和o抗原多糖)，外部区域有助于植物识别特定的细菌。根瘤菌合成的脂多糖结构多样，但是它们的脂质A的结构都与大肠杆菌存在关键差异(图3)。大肠杆菌中典型的脂质A由葡萄糖胺双糖主链组成，双糖两端有两个带负电荷的磷酸化基。双糖通常与12-14个碳原子的线性饱和脂肪酸进行六酰化。几乎所有的根瘤菌都有一个显著的不同：存在一种或多种极长链脂肪酸(VLCFA)连接到脂质A的主干(部分由酶LpxXL完成)。对于中华根瘤菌(Sinorhizobium)来说，这是与大肠杆菌脂质A的唯一区别，从六种常规脂肪酸变为四种常规脂肪酸和一种VLCFA。VLCFA可能增加了外膜的稳定性和完整性，这是因为VLCFA与外膜脂肪酸之间的疏水作用增加，可能导致两个外膜叶的相互作用。近期的研究表明，具有长、短酰基链的不对称磷脂可以提高酵母膜的稳定性。

LA结构的主要差异是糖主链和取代基的变化(图3)。大多数的根瘤菌(除了中华根瘤菌)都是将双糖主链两端的一个或两个磷酸取代，把带负电荷的磷酸基团交换为带中性电荷的质子羧酸基团或糖。但是，它也减少了LA分子之间的静电斥力。一些根瘤菌的糖主链是大肠杆菌中常见的葡萄糖胺双糖。但是，一些研究表明内消旋、偶氮和慢生根瘤菌菌株改变了葡萄糖胺，使脂肪酸通过酰胺键而不是酯键连接。与大肠杆菌相比，LA的每一种变型都增加了黏结作用，这可能导致膜的稳定性增加。

图 3. 根瘤菌中藿类生物合成与外膜多样性。A. 藿烷类生物合成表明从角鲨烯(黑色)开始，它被SHC转化为C30藿烷类。C30藿烷类通过HpnH、HpnG和HpnO转化为不同的C30藿烷类。然后，这些藿烷类可以被HpnP甲基化。藿烷类可以通过HpnN转运体转移到外膜。在有机质中，C35藿烷类可以附着在A脂上的VLCFA上形成HoLA。B.不同根瘤菌的外膜组成显示，与肠道细菌大肠杆菌(左)进行比较。对LA的每次结构改变，包括藿烷类的添加都被突出显示。从左到右显示了该物种的外膜组成，来增加对多粘菌素的抗性，多粘菌素是一种针对有机质的阳离子抗菌肽。

藿烷类是另一种脂类，可以通过影响外膜的性质来增强根瘤菌对环境变异的耐受性。很多根瘤菌都可以产生藿烷类化合物。在所有测序的细菌中，大约有10%的细菌具有藿烷类的遗传能力，而在集成微生物基因组数据库中，33%的根瘤菌基因组可能含有shc，shc是一种酶，负责鲨烯的循环，从而制造最简单的C30藿烷类、二萜烯或二萜醇(图3)，也被称为“非扩展的”藿烷类化合物。根据这些计算预测，在根瘤菌内部，产生藿烷类化合物的能力主要局限于慢生根瘤菌和伯氏菌支系，以及一些甲基细菌和四分之三的大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)菌株(图4)。研究发现藿烷类化合物C-2位置的甲基化增加了原生细菌膜的硬度，但是在分析中没有确定C-2甲基化酶(HpnP)的系统发育分布，因为HpnP不在Pfam的数据库中。

图4. 根瘤菌中藿类产生的系统发育树。发育树利用整合微生物基因组(IMG)数据库中的306个小亚基rRNA序列，使用Silva Alignment方法构建树，并使用交互式生命树程序(iTOL)进行显示。环识别每个物种的类别以及他们的基因组是否包含与藿烷类相关的基因。这些基因可以产生任何藿烷类和/或C35藿烷类，以及根据来自IMG的同源数据将它们运输到外膜的能力。

在两个与根瘤菌密切相关的物种中HpnN类藿烷转运体，类藿烷优先运输到外膜，而不是停留在内膜，表明类藿烷在外膜功能的重要性。在大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)中，由于缺少hpnN，任何C30藿烷类化合物的合成都可能局限在内膜。慢生根瘤菌产生了LA的变种，其中一个扩展的藿烷类化合物附着在LA的VLCFA上。这个变种被称为藿烷类附加LA(HoLA)。由于代表这种改变的酶不清楚，所以无法通过计算的方式发现其他可以产生HoLA的物种。

细菌合成的藿烷类化合物的结构具有多样性，这表明不同的藿烷类化合物对细胞内不同的功能进行了优化，但这些功能是什么还有待确定。“疏水性”藿烷类化合物可能会从膜中挤出水，对膜的渗透性比流动性或稳定性更重要。但是，在“亲水”藿烷类化合物中也存在差异。二萜醇和二叔丁基对甲酚都被证明可以浓缩和重组含有饱和磷脂的膜，进而降低膜的渗透性。与胆固醇不同的是，二萜醇对不饱和脂质没有任何重组或凝聚作用。这些结果表明，对藿烷基环结构的重组可以改变其功能。

胆固醇对真核生物很重要的原因之一是它能够通过侧向脂质流动来维持一定流动性的能力。胆固醇通过形成一种有序的液态相来消除流动性和稳定性之间的关系。虽然BHT的这种能力没有进行测试，但双蝶呤已被证明可以防止脂质进入凝胶阶段，并保持侧向脂质扩散(图2)。具体来说，藿烷类化合物与LA有很强的相互作用。

试管研究表明HoLA可显著增加膜的刚度。尽管HoLA只存在于脂质体的外小叶中，但是HoLA对脂质体的内外小叶均有显著的硬化作用。在含有LA的脂质体中，游离藿烷类物质被添加到外叶中，附加藿烷类物质没有被添加到外叶中，表明单纯的藿烷类物质没有交叉排序效应。但是由于没有检查内小叶的藿烷类化合物，所以不清楚HoLA会不会比单独的藿烷类化合物完成更大的排序。虽然藿烷类化合物不同结构的变异作用还需要进一步了解，但是无论藿烷类化合物是游离的还是结合在LA上，都有对维持膜稳定性和流动性之间的最佳平衡有帮助。

3. 外膜与渗透压力

外膜是任何环境变化的首要部分，但是渗透压的变化对膜有特殊的影响(图2)。试管实验表明，在高渗透期间，脂质囊泡硬化，水离开囊泡，囊泡表面积减少，膜被压缩。另一方面，低渗透导致水冲进脂质囊泡，囊泡膨胀。根据推测，在初始低休克过程中，膜变得更加液态，这可能是由于囊泡扩张容纳了更多的水，表面积增加所导致。但是，这些实验使用的甘油和聚乙二醇也会影响膜的水化。这一证据说明细胞和细胞膜对渗透胁迫反应是复杂的。

但是，无论是在最初的过程还是在适应过程中，保持最佳的膜状态对于细菌在渗透胁迫下的生存至关重要。应对膜状态变化的一种方法是调整膜组分的位置进行补偿，称为恒黏适应性。根瘤菌利用了恒黏适应性，但是根瘤菌与沙门氏菌等其他细菌不同，本综述讨论的膜变异是不是在精确的调控下还不清楚。目前，本研究认为改性的LA和藿烷类化合物是由根瘤菌在“正常”实验室条件下产生的，但是仍然需要对根瘤菌中不同类型的藿烷类化合物的调控进行系统探索，特别是扩展的藿烷类化合物和HoLA。对与根瘤菌密切相关的有机体进行研究，如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，未扩展的藿烷类化合物可以在多种生长条件下生成，但是它们的丰度在固定阶段增加，C-2甲基化的藿烷类化合物是受一般应激反应途径的调控。由于缺乏扩展藿烷类化合物会使细胞在固定阶段很容易受到各种外膜应力的影响，所以在触发外膜应力的条件下，扩展藿烷类化合物和HoLA也可能富集。双蝶呤(以及可能的其他亲水藿烷类化合物，包括BHT)可以通过增加稳定性来保护外膜免受压力(如前所述)。

此外，限制水和溶质的移动是另一个潜在的保护方法。根瘤菌对渗透胁迫的适应是通过合成糖来平衡渗透势的。在高渗胁迫时，细胞质中产生海藻糖等相容的溶质；在低渗胁迫时，细胞质周围产生-葡聚糖。为了使这些相容的溶质具有有效性，需要保持膜的渗透性。藿烷类化合物和根瘤菌对LA的改变可以通过从膜中挤出水分，增加脂质堆积，降低膜渗透性来实现。实际上，BHT已被证实在低渗时能减少脂囊泡的扩张程度。

藿烷类能使根瘤菌适应与生活方式相关的渗透胁迫范围吗?研究人员利用突变体分析来解决这一问题。同时也有一些重要的提示：(i)任何生物合成步骤的缺失都有可能导致前体细胞的积累或诱导脂质重构进行补偿；(ii)膜蛋白的功能是根据自身的脂质环境进行调整，所以去除一个膜组分可能导致膜蛋白功能的减少。

HoLA的特异性损失尚未被检测，因为将藿烷类与脂质A结合的酶仍然不清楚。到目前为止，还没有研究表明藿烷类是否能保护细菌免受低渗透条件的影响，这一方面是未来研究的前沿。但是在富介质条件下观察到的高渗透生长缺陷很可能在环境中被放大。研究认为藿烷类化合物和HoLA/LPS可能是土壤中根瘤菌生存和竞争的关键。

研究表明HoLA缺陷突变体在和七叶藻(Aeschynomene)寄主的共生中也存在缺陷。与野生型相比，B. BTAi1 Δshc菌株或B. ORS278 ΔlpxXL菌株与A.evenia的共生关系同样存在缺陷，所以产生了大量的根瘤，这些根瘤在固定氮方面基本无效，而且开始老化。B.diazoefficiens ΔhpnH突变体也显示出了和不同物种在共生关系中的缺陷。但是，与前两项研究不同的是，经长期研究发现，虽然共生初期固氮率较低，但随着时间的推移，B.diazoefficiens ΔhpnH突变体最终达到了WT的效果。对于那些不能制造HoLA的物种来说，LA上的VLCFAs同样重要。突变体无法在LA中添加VLCFAs，这使得在应对不同的外膜应力方面存在缺陷，比如高渗透压或根瘤发育迟缓。这些结果阐述了一个关于根瘤菌外膜组分突变体的重复主题：对环境应激源的敏感性显著增加，特别是与外膜屏障功能相关的应激源，同时在初始阶段共生效率降低。

4. 结论

随着气候变化，根瘤菌对可持续农业的作用是不可否认的。根瘤菌可以减少对氮肥的依赖，而且可以改善极端水势对植物生产力的负面影响。为更好发挥根瘤菌的潜力，生物工程是有潜力的方式：选择、优化或建立具有提高共生效率的根瘤菌。而生物工程的目的是为了确定改善共生本身的特征，本研究建议维持一个全面的观点：提高植物保护生物在气候变化中的适应性，还必须关注有利于植物保护生物在土壤中生存的特性。这种观点会促使我们提高对土壤环境动态变化背景下根瘤菌适应性的机制进行理解。鉴于以上研究，我们认为改变水势是需要考虑的最重要的参数之，无论是在植物内部还是在土壤内部，因为它对土壤细菌种群和植物生产力的产生主要影响。土壤的水势分布范围很广，而且不确定一个地区是否会因为气候变化而导致更加干旱或洪水泛滥。由于藿烷类化合物可以在一系列环境挑战中增强根瘤菌的外膜，而且调整藿烷类化合物的性质和表达也可以提高重要生物的能力，所以藿烷类化合物为农业作物应对气候变化的挑战提供了有效途径。