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南农 | SBB：微生物网络分析结合后续培养实验揭示了凋落物分解过程中的关键菌群

2021

08/30

微生态

A-

A+

土壤中植物凋落物的分解由定殖在凋落物残体上的细菌和真菌等微生物驱动。

编译：微科盟温水，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读

土壤中植物凋落物的分解由定殖在凋落物残体上的细菌和真菌等微生物驱动，因此，细菌和真菌群落的相互作用可以揭示木质素的分解机制。以往的研究主要是在微生境、异地条件或单一土壤生态系统中研究凋落物分解的微生物群落。而本研究通过为期12周的室内凋落物（秸秆）分解实验，探索（南京市）三种不同利用类型（林地、农田和弃耕地）的土壤中凋落物分解与酶活性和微生物群落变化的关系。本研究发现：（1）三类土壤中林地凋落物的分解程度最高；（2）然后，我们用多种方法证明了这是由微生物群落决定的，林地土壤微生物群落具有更高活性的木质素分解酶，更高的微生物多样性，以及不复杂但更专门化的网络。细菌中的Chryseobacterium（金黄杆菌属）和真菌中的Fusarium（镰刀菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）、Penicillium（青霉菌属）是三类土壤微生物网络中的关键类群；（3）我们随后开展了分离培养实验，进一步证实了这些关键类群具有高的凋落物分解能力和酶活性。本研究首次验证了微生物关键类群在凋落物分解中的作用，网络分析与培养实验的结合被证明是筛选微生物关键类群的可选模式。总体而言，我们的结果说明，土地利用类型通过土壤微生物群落的组成和网络结构进而影响凋落物的分解。我们的研究还揭示了特定的关键微生物类群参与了凋落物的分解，未来或许可以利用这些关键类群来调控土壤生态系统中木质素的分解。

论文ID

原名：Network analysis and subsequent culturing reveal keystone taxa involved in microbial litter decomposition dynamics

译名：微生物网络分析结合后续培养实验揭示了凋落物分解过程中的关键菌群

期刊：Soil Biology and Biochemistry

IF：7.609

发表时间：2021.04.01

通讯作者：徐阳春

通讯作者单位：南京农业大学资源与环境科学学院

实验设计

结果

1. 凋落物分解及其质量的变化

随着时间的推移，土地利用类型对凋落物分解有明显影响，在第2周（图1-a，P<0.001，F_2,6=135.9）和第12周（图1-a，P<0.001，F_2,6=71.24），林地的凋落物分解率最高，而弃耕地的凋落物分解率最低。在第12周后，林地、农田和弃耕地凋落物的分解率分别达到63.42%、53.75%和50.38%（图1-a）。林地凋落物分解常数显着高于耕地和弃耕地（P<0.001，图S2)。土地利用类型和时间对凋落物分解都有显著影响（表S3，P<0.001）。

不同土地利用类型的凋落物组成也有显著变化（图1 b-d）。例如，在整个分解过程中纤维素含量迅速下降。林地的纤维素含量在第2、4和6周最低（图1-b，第2周：P=0.002，F_2,6=20.69；第4周：P<0.001，F_2,6=50.73；第 6 周：P<0.001，F_2,6=33.49）。林地的半纤维素含量在第2周和第12周显著低于农田和弃耕地（图1-c，第2周：P=0.0015，F_2,6=23.38；第12周：P<0.001，F_2,6=519.7）。木质素分解发生在第2周后，并在第4周和第8周之间加速（图1-d）。对木质素而言，林地和其他两种土地间在后期才有显著差异（图1-d，第12周：P=0.002，F_2,6=20.8）。土地利用类型和时间都会影响凋落物质量的变化（表S3）。

图1. 林地（蓝色）、农田（绿色）和弃耕地（红色）凋落物分解及质量变化。（a）凋落物的分解按每个采样时间凋落物生物量损失的百分比计算。图b-d显示了（b）纤维素、（c）半纤维素和（d）木质素的含量变化。 * 表示P<0.05；**表示P<0.01。误差条表示标准误差（n=3），DM表示凋落物的干物质。

2. 酶活性的变化

不同土地利用类型的纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖酶和漆酶的活性也存在显著差异（图2 a-d）。在整个采样期间（包括初始时间），林地中的所有酶活性均显著高于农田和弃耕地，但是每种酶的活性表现出不同的趋势。例如，三类土壤中，β-葡萄糖苷酶活性在第4周之前迅速增加，但随后缓慢增加；而农田中β-葡萄糖苷酶活性从第8周开始增加（图2-b）。纤维二糖水解酶和β-木聚糖酶活性在第6周前有所增加，并在第8周迅速下降（图2-a和c）。漆酶活性最初较低（第4周之前），但之后有所增加（图2-d）。

当四种酶活性汇为总酶活性（Z-score）时，结果显示：林地的总酶活性显著高于其他两个位点（P<0.001，F_2,51=22.57，图S3）。木质素酶活性与凋落物分解呈显著的正相关关系（P<0.001，图2-e)。具体而言，β-葡萄糖苷酶与三种土壤的纤维素和半纤维素显著相关（表S5 和图S4）。漆酶与木质素也显著相关（表S5和图S4）。土地利用类型和时间都显著影响凋落物质量的变化（表S3）。这些结果表明，三种土壤的凋落物分解与相关酶活性之间存在很强的相关性。

图2. 林地（蓝色）、农田（绿色）和弃耕地（红色）中（a）纤维二糖水解酶、（b）β-葡萄糖苷酶、（c）β-木聚糖酶和（d）漆酶的变化。（e）四种纤维素酶活的总和（ Z-score）与凋落物分解的关系。酶活单位为μmol/h/g（秸秆干重）。 * 表示P<0.05；**表示P<0.01。误差条表示标准误差（n=3）。

3. 凋落物分解过程中微生物群落的演替

细菌和真菌群落都随时间显著变化（表S4）。富集培养2-12周后，秸秆表面的微生物群落与初始样品（未培养前）的微生物群落明显不同。在前期（第2周：P<0.001，F_2,24=42.58；第4周：P<0.001，F_2,24=39.53）和后期（第12周：P<0.001，F_2,24=10.71)，林地土壤的细菌总量（绝对丰度）都显著高于农田和弃耕地（图3-a）。凋落物开始分解后，细菌的OTU丰富度立即下降（图3-c），表明掺入秸秆后来自土体的细菌群落开始发挥作用（分解秸秆）。随着分解的进行，细菌OTU丰富度随时间增加，在第6周和第8周达到最高，然后再下降（图3-c）。林地土壤的细菌群落与农田和弃耕地土壤的细菌群落不同（P<0.001，图3-e），并且这些差异在整个采样期间都十分明显（图S6、图S7和图S8）。凋落物分解过程中的优势细菌门为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）（图3-g）。三种土壤中这些优势菌门的变化趋势不同（图S6、图S7和图S8）。另外，在林地中，只有细菌的β多样性（PCoA1）与木质素呈显著负相关关系（P=0.040，F=4.98，R²=0.19，图S11）。这些结果表明，在凋落物分解过程中细菌群落随不同生态系统类型（土壤类型）而变化。

一般来说，真菌群落只受土壤类型的影响（表S4）。我们的结果显示，林地真菌的绝对丰度从第2周到第6周显著下降，从第8周到第12周显著增加（图3-b）。在所有时间点，林地真菌的绝对丰度显著高于农田和弃耕地（P<0.05，图3-b）。与细菌群落类似，在第2周真菌的OTU丰富度显著下降（图3-d）。在第2周和第6周，林地真菌的OTU丰度显著高于其他两种土壤（P<0.05，图3-d)。林地真菌的群落结构与农田和弃耕地也显著不同（P<0.001，图3-f），这种差异在第0、2、6和12周的表现一致（图S9）。凋落物分解过程中（包括三种土壤和所有采样时间）的优势真菌门为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）（占总序列的70-99%；图3-h，图S10）。在第4周和第6周，担子菌门（Basidiomycota）在农田和弃耕地中占主导地位，包括Coprinopsis和Psathyrella属（图S15）。在农田中，这两个属都与纤维二糖水解酶有显著的相关性（图S15-a和b）。在弃耕地，这两个属与β-木聚糖酶有显著的相关性，但只有Coprinopsis与纤维二糖水解显著相关（图S15 c-e）。

RDA结果显示，在不同土地利用方式下，微生物演替（OTU水平）、酶活性和凋落物分解之间的相关性在不同时间点是不同的（表S7和图S12）。在整个采样期间，三种土壤的微生物演替、酶活性与凋落物分解表现出明显的相关性。在凋落物分解前期（第2周），纤维素与细菌和真菌群落均表现出较强的相关性，而在林地的凋落物分解后期（第8周和第12周），纤维素与细菌和真菌群落表现出较强的相关性（图S12-a和b）。此外，，林地凋落物分解在第12周与其他两种土壤的细菌群落相关，在第8周与与其他两种土壤的真菌群落相关（图S12 c-f）。

图3. 凋落物分解实验（12周）中，林地（蓝色）、农田（绿色）和弃耕地（红色）土壤细菌和真菌的总丰度、多样性、群落结构及分类组成的变化。（a）细菌和（ b）真菌的绝对丰度。（c）细菌和真菌（d）的OTU相对丰度。基于UniFrac距离的坐标分析进行评估（e）细菌和（f）真菌的群落结构。主要（g）细菌和（h）真菌的相对丰度变化（门水平）。初始土壤样本（第0周）为埋袋土壤。*表示P<0.05；**表示 P<0.01 。误差条表示标准误差（n=3）。

4. 微生物共生网络及关键类群

三种土壤的网络复杂度差异较大。与农田和弃耕地相比，林地微生物网络的复杂度较低，比如：林地微生物网络具有更少的边（3368）、较低的平均度（16.84）、以及较低的平均聚类系数（0.63，图4-a和b)。弃耕地的微生物网络最为复杂，其边数、平均度和聚类系数均高出（林地微生物网络）2倍（图4-b）。关键微生物类群主要属于细菌中的放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和变形菌门（Proteobacteria），以及真菌中的子囊菌门（Ascomycota）（表S1）。删去关键类群OTU后，我们重构了三种土壤的共生网络，以评估其对网络的影响。结果表明，如果没有关键类群的OTU，微生物网络就会变得更简单（表S6 和图S14）。例如，删除表S1中的20个潜在关键类群OTU后，网络的节点数、节点度及模块性等重要参数都有所下降。为了进一步验证这些关键类群，我们将筛选出60个关键类群OTU与可培养的34株细菌和17株真菌菌株进行了系统发育地位匹配（表S2）。结果显示，60株中有5株为可培养的林地（TU3451， Penicillium sp. ZJ-F2；TU3409，Fusarium sp. ZJ-F3）、农田（OTU10384，Chryseobacterium sp. QL-B4；TU84，Aspergillus aculeatus QL-F3）和弃耕地（TU1317，Aspergillus sp. BG-F2）菌株（图4-b）。

图4. （a）三类土壤中细菌和真菌 OTUs共生网络。只有Spearman相关系数r>0.8、P<0.01或r<−0.8、P<0.01的节点被展示。以门水平对节点进行着色。绿色边代表正相关，红色边代表负相关。节点大小与OTU的介数中心性成正比，边粗细与加权的相关系数成正比。（b）三类土壤中的网络参数及其与可培养菌株匹配的潜在关键种。平均度是每个节点上的边数，表示网络中有多少其他节点（OTU）与给定节点相连。路径长度表示两个节点之间的最近距离。直径是网络中两个节点之间的最大距离。聚类系数表示节点与其相邻节点的连接程度。

5. 潜在关键物种的（凋落物）分解能力

我们进一步对这5个关键菌株（Penicillium sp. ZJ-F2、Fusarium sp. ZJ-F3、Chryseobacterium sp. QL-B4、Aspergillusaculeatus QL-F3、Aspergillus sp. BG-F2）的凋落物分解能力进行了评估。结果发现，来自林地的 Penicillium sp. ZJ-F2菌株的凋落物分解能力显著高于其他两种类型的土壤（P<0.001，图5-a)。此外，Fusarium sp. ZJ-F3菌株和Aspergillus sp. BG-F2菌株的凋落物分解能力显著高于Chryseobacterium sp. QL-B4和Aspergillusaculeatus QL-F3菌株（P<0.001，图5-a)。Penicillium sp. ZJ-F2菌株还具有最高的纤维二糖水解酶、β-木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和漆酶活性（4.35 μmol/h/g、43.77μmol/h/g、1.66 μmol/h/g、0.73 μmol/h/g，图S13）。用Z-score计算四种酶活的总活性，结果发现：Penicillium sp. ZJ-F2菌株的Z-score最高、凋落物分解能力最强；Chryseobacterium sp. QL-B4的Z-score最低、凋落物分解能力最差（图5-b）。相关性分析进一步证实了凋落物分解与关键类群（凋落物分解与Z-score值正相关）之间的相关性（图5-c）。这些结果表明，可通过构建共生网络初步筛选潜在的关键微生物类群以进一步探索相关的微生物功能。

图5. 秸秆液体发酵实验（7天）中，凋落物分解的关键类群和四种纤维素酶活的总和（Z-score）。三类土壤中分离的关键类群的（a）凋落物分解情况及（b）纤维素酶的活性。（c）四种纤维素酶活的总和（Z-score）与凋落物分解的关系。小组c：凋落物分解与木质素降解酶活性之间的线性回归。误差条表示标准误差（n=3）。图（a）、（b）中不同的字母表示P<0.05的统计差异。

讨论

土壤微生物区系在凋落物分解中起着重要作用。研究发现，凋落物的分解受到土地利用方式的影响，一般而言，林地的分解速度比农业生态系统更快。然而，森林生态系统中凋落物分解如此之高的潜在机制尚不清楚。本研究通过多因素方法，发现了林地凋落物分解能力强的主要原因是木质素酶活性高、微生物多样性高、微生物网络复杂程度低但专一性强。

在大多数生态系统中，土壤酶是驱动植物残体降解的主要因素。然而，不同类型土壤的凋落物分解和酶活性间的关系很难确定。我们的结果表明，木质素酶的活性（纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖酶和漆酶）与三种利用类型土地的凋落物分解和凋落物质量变化显著相关，这证实了酶活性与凋落物分解能力具有协同效应。木质素酶的活性越高，凋落物分解速度就越快。在林地中，这些酶的活性和微生物OUT的丰度显著提高，解释了林地土壤凋落物分解程度较高的原因。正如前人报道的凋落物分解随着土地利用集约化而减少的现象。这不仅是因为真菌群落在森林生态系统的凋落物分解中发挥着重要作用，还是因为原生生态系统中的真菌多样性通常高于农业生态系统。此外，林地微生物总生物量和酶活性（如β-葡萄糖苷酶和漆酶活性）也较高。较高的真菌相对丰度与较高的漆酶活性相关。虽然本研究只测定了漆酶，但值得注意的是，除漆酶外，其他酶如过氧化物酶和锰过氧化物酶也对木质素分解非常重要。未来的研究中应当考虑加入这些酶，同时还要评估微生物对凋落物分解的贡献。总之，我们的结果表明，凋落物分解因土地利用类型而异，这种差异可能是由于不同类型土壤中微生物群落和酶活性存在差异导致。

在凋落物分解过程中，土壤细菌和真菌群落的变化取决于富养菌和寡养菌的相互作用。添加凋落物后，林地土壤中变形杆菌、拟杆菌和子囊菌等富养菌明显增加，而放线菌和酸杆菌等寡养菌明显减少。这表明，在凋落物分解过程中，基于资源获取和营养状态的微生物发生了变化。以往的研究表明，变形菌和放线菌也是分解有机物质的关键类群。就真菌而言，我们的结果表明，子囊菌在凋落物分解中起着重要作用，这与之前的研究结果一致。的确，有研究在林地的枯枝落叶层发现了子囊菌门的纤维素分解类群。此外，有研究还发现Penecillium sp.菌是森林中丰度较高的菌群之一，其有较高的秸秆降解效率，这间接支持了我们对关键菌株的鉴定结果。在本研究中的三类土壤中，尽管担子菌的丰度高居第二，但我们并未发现该菌的可培养菌株。未来的研究也可能尝试应用更通用的培养基（如麦芽琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂）来分离担子菌和其他可能的关键类群。总之，我们的研究发现，不同的微生物类群会导致凋落物分解和木质素酶活性发生变化。

网络分析可以用来研究某些微生物出现在同一生态位的原因，并筛选出群落中高度相关的微生物类群。为了进一步明确凋落物的分解机制，需要深入了解细菌和真菌群落内部和之间的联系。据我们所知，本研究是第一个探索微生物共生模式（网络）并结合后续关键微生物菌株的分离培养实验的研究。我们的研究表明：林地微生物网络比农田和弃耕地更为简单，这说明林地中的微生物受到异质残留物的高度选择；此外，由不同细菌和真菌关键类群介导的更简单且专门化的微生物网络导致林地的凋落物分解程度更高。有趣的是，弃耕地的网络边数远多于林地和农田，弃耕地的微生物群落可能已从过去农业集约化的管理状态中复原，类似于河岸生态系统。

需注意的是，网络分析可能不完全代表微生物间实际的相互作用。因此，通过网络分析识别的关键类群是“理论上”的，还需要实证验证。在本研究中，我们首先根据网络的连接性和中心性初步确定了潜在的关键类群（Penicillium、Fusarium、Aspergillus），然后我们通过后续培养实验进一步确认这些关键类群的凋落物分解能力。重要的是，网络分析得到的关键类群并非具有很高的相对丰度。这与优势菌群因其高丰度影响影响微生物群落功能、而关键菌群因其对其他菌的筛选特性从而影响微生物群落组成的事实并不矛盾。在我们的研究中，培养实验还证实了真菌的关键类群Penicillium（青霉菌属）和Fusarium（镰刀菌属）具有更高的凋落物分解能力和酶活性。这也解释了林地土壤凋落物分解效率和酶活性最高的原因。之前的研究也发现了Penicillium（青霉菌属）和Fusarium（镰刀菌属）可以产生一系列有效降解木质素的酶。据报道，Penicillium（青霉菌属）可以利用分解树叶是产生的胞外酶来使用木质素。有研究显示，Penicillium（青霉菌属）、Fusarium（镰刀菌属）、Aspergillus（曲霉菌属）能够产生过氧化物酶，这是分解木质素的重要酶。因此，在今后的工作中，对这些关键类群及其他尚未分离的潜在类群进行（分解木质素的）过氧化物酶的分析十分重要。事实上，真菌可以通过分泌水解酶分解复杂的木质素，这在凋落物分解中发挥关键作用。从农田中分离的关键细菌Chryseobacterium（金黄杆菌属）是具有高葡聚糖酶和木聚糖酶活性的纤维素酶菌株。该菌株与凋落物分解、纤维素和半纤维素降解显著相关。虽然Bacillus、Arthrobacter、Paenibacillus等关键菌未能被分离纯化，其仍具有较高的纤维素分解能力。未来的研究中应该有选择地排除关键类群以验证物种间的相互作用和整体微生物组功能的变化。此外，其他关键类群的重要性也有待验证，可以通过更改分离培养基（如调整pH值）来验证，因为培养基可能会限制一些重要功能微生物的生长。

一些关键种会通过对筛选其他菌群进而影响微生物的群落组成，因此，移除这些关键种可能会导致微生物组成和功能的显著变化。有研究发现真菌和细菌的关键类群与农业土壤中有机物的分解。我们的研究不仅支持了这一发现，而且还进一步地揭示了这些关键种的离体培养状况。有以下两个方面：首先，关键类群与凋落物分解之间有强烈的相关性。这一点尤为重要，因为微生物生物量信息已被证明可以提高我们对土壤有机质的估算。其次，我们的结果强调了通过利用关键类群来改变微生物组的组成。然而，需要指出的是，由于土壤微生物本身的多样性和复杂性，土壤微生物群落中的关键类群仍处于理论发展阶段。在此基础上开展接种实验以识别这些关键类群在群落中的真实作用十分重要。例如，在未来的工作中，可以接种多个类群（整个或部分微生物群落），然后有选择地排除关键类群，以测试去除它们对群落功能或组成的影响。虽然可培养的合成群落可行性较高，但其并不能代表原位实际的微生物群落。本研究迈出了对参与凋落物分解的关键类群实证验证的第一步，下一步我们将继续开展包括原位和室内合成群落实验在内的培养组学的研究。

结论

在凋落物分解过程中，木质素分解酶活性、微生物群落结构和共生模式（网络）发生了变化，这些变化受土地利用类型的影响。具体而言，林地土壤凋落物分解程度较高的原因是木质素降解酶活性较高、微生物多样性较高、微生物网络不那么复杂但更为专门化。因此，我们的结果表明，土地利用类型影响的土壤微生物演替介导的土壤凋落物分解。基于共生网络分析和后续的分离培养实验，我们确定了土壤凋落物分解相关的关键类群。这些类群表现出很强的凋落物分解能力和酶活性。网络分析与培养实验的结合是筛选微生物关键类群的可选模式。此外，强调了通过网络评分确定的关键分类群可以通过培养筛选来表征。此外，这是一次利用统计经验验证微生物工程和代谢模型中关键类群的成功尝试。