RCA2：单细胞数据的分析和可视化工具！

2021-08-27 09:28

RCA2是目前比较成熟的单细胞注释和可视化的工具，操作简单，绘图精美。RCA2在相对于RCA1在速度、性能上进行了优化，大大扩展了包含的参考数据集，并且可以更轻松地处理大型单细胞数据集（无监督聚类进行注释的新方法）。

导语

GUIDE ╲

单细胞测序可以详细分析不同细胞类型的转录多样性。RCA2包是一种基于图的聚类算法，可以聚类大型scRNA-seq数据集并可视化。

背景介绍

今天小编为大家带来一个处理单细胞数据的R包——RCA2。RCA2以 scRNA-seq数据作为输入，可以对10X Genomics数据进行质量控制和预处理。RCA允许用户从自己生成自定义参考面板，同时也提供了多个预设的参考面板。RCA考虑选定的参考面板以及查询单细胞数据，以计算相关矩阵，得出单细胞转录组与参考转录组的相似性，可以在热图中聚类和可视化。RCA首个版本发表在Nature Genetics (doi: 10.1038/ng.3818)，RCA2发表在NAR（10.1093/nar/gkab632）。我们可以在Github上学习RCA2的使用方法和源代码（https://github.com/prabhakarlab/RCAv2）。

R包安装

library(remotes)install_github("prabhakarlab/RCAv2")

可视化展示

数据输入

使用作者提供的 10X Genomics 公开数据集，创建一个RCA object。

PBMCs<-RCAv2::createRCAObjectFrom10X("10xPBMCs/")PBMCs

RCA reference class objectRaw data: 5247 cells and 33570 features.

正质量控制（QC）

根据检测到的基因数量（nGene.thresholds），唯一分子标识符的数量（nUMI.thresholds），线粒体reads百分比（percent.mito.thresholds）和任何基因需要表达的细胞的最小数量（min.cell.exp）这些QC指标进行可视化。

PBMCs<-RCAv2::dataFilter(PBMCs, nGene.thresholds = c(300,5000),  nUMI.thresholds = c(400,30000), percent.mito.thresholds = c(0.025,0.2), min.cell.exp = 3, plot=T,                  filename = "PBMCs_filter_example.pdf")

我们可以通过测序深度和log转换进行标准化。

PBMCs<-RCAv2::dataLogNormalise(PBMCs)

将单细胞数据映射到reference数据上

RCA包提供了13个参考面板。当然，我们也可以自己设置reference。

PBMCs<-RCAv2::dataProject(PBMCs, method = "GlobalPanel",                     corMeth = "pearson")

聚类并可视化

聚类有两个参数：deepSplitValues和minClustSize，分别表示聚类的cut和最小细胞数。

PBMCs<-RCAv2::dataClust(PBMCs)RCAv2::plotRCAHeatmap(PBMCs,filename = "Heatmap_PBMCs.pdf",var.thrs=1)

除了热图以外，还可以使用UMAP绘制2D和3D的映射图，非常好看。

PBMCs<-computeUMAP(PBMCs)RCAv2::plotRCAUMAP(PBMCs,filename = "UMAP_PBMCs.pdf")

PBMCs<-computeUMAP(PBMCs, nDIMS = 3)RCAv2::plotRCAUMAP3D(PBMCs,filename = "UMAP3D_PBMCs.html")

当然，我们还可以观察每个聚类的组成（堆叠条形图）。在 a图中，显示每个聚类的相对组成，b图显示每个聚类中的细胞的绝对数量。颜色代码表示最有可能的细胞注释。

#Estimate the most probable cell type label for each cellPBMCs<-estimateCellTypeFromProjection(PBMCs,confidence = NULL)#Generate the cluster composition plotRCAv2::plotRCAClusterComposition(PBMCs,filename="Cluster_Composition.pdf")

根据热图和堆叠条图，我们可以根据主要细胞类型注释重新标记聚类：

RCAcellTypes<-PBMCs$clustering.out$dynamicColorsList[[1]]RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="blue")]<-"Monocytes"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="green")]<-"Dentritic cells"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="yellow")]<-"B cells"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="grey")]<-"B cells"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="brown")]<-"NK cells"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="turquoise")]<-"T cells"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="red")]<-"Myeloid cells"RCAcellTypes[which(RCAcellTypes=="black")]<-"Progenitor cells"

这里我们以CD56的表达为例，CD56是一个常见的NK细胞标记，基因名称是NCM1。

CD56Exp<-PBMCs$data[which(rownames(PBMCs$data)=="NCAM1"),]RCAv2::plotRCAUMAP(PBMCs,cellPropertyList = list(CellTypes=RCAcellTypes,CD56=CD56Exp),filename = "UMAP_PBMCs.pdf")

为了获得噪声较小的细胞类型标签，还可以在聚类水平上预测细胞类型。RCA2使用上述cluster组成图进行多数投票。要获得基于cluster的细胞类型预测，可以使用函数estimateCellTypeFromProjectionPerCluster：

PBMCs<-RCAv2::createRCAObjectFrom10X("../Documents/10xExample/")PBMCs<-RCAv2::dataFilter(PBMCs,nGene.thresholds = c(300,4500), percent.mito.thresholds = c(0.025,0.1), min.cell.exp = 3)PBMCs<-RCAv2::dataLogNormalise(PBMCs)PBMCs<-RCAv2::dataProject(PBMCs, method = "NovershternPanel", corMeth = "pearson",  nPCs=0, approx= FALSE)PBMCs<-RCAv2::dataSClust(PBMCs,res = 0.15)PBMCs<-estimateCellTypeFromProjectionPerCluster(PBMCs)

此外，RCA还提供了多种聚类方案以应对大型的单细胞数据集，例如shared neirest neighbour (snn)， the Louvain graph based clustering。这里小编就不一一展示了，大家可以根据自己的需求选择聚类方法。

计算cluster的差异表达基因

logFoldChange表示差异表达的FC值。method表示使用哪种统计方法。p.adjust.methods表示多重校正检验。mean.Exp和min.pct表示表达基因的最小表达值以及表达基因的细胞的最小百分比。此外，top基因可以通过绘图热图功能在热图中绘制：

PBMCs<-RCAv2::dataDE(PBMCs, logFoldChange = 1.5, method = "wilcox", mean.Exp = 0.5, deep.Split.Values = 1, min.pct = 0.25, min.diff.pct = -Inf, random.seed = 1, min.cells.group = 3, pseudocount.use = 1, p.adjust.methods = "BH", top.genes.per.cluster = 10)
RCAv2::plotDEHeatmap(PBMCs,scale=FALSE)

GO和KEGG富集

GO富集

doEnrichGo<-function(rca.obj, annotation=NULL, ontology="BP", p.Val=0.05, q.Val=0.2, p.Adjust.Method="BH", gene.label.type="SYMBOL", filename="GoEnrichment.pdf", background.set="ALL", background.set.threshold=NULL, n.Cells.Expressed=NULL, cluster.ID=NULL, deep.split=NULL)

KEGG富集

doEnrichKEGG<-function(rca.obj, annotation=NULL, org="hsa", key="kegg", p.Val=0.05, q.Val=0.2, p.Adjust.Method="BH", gene.label.type="SYMBOL", filename="KEGGEnrichment.pdf", background.set="ALL", background.set.threshold=NULL, n.Cells.Expressed=NULL, cluster.ID=NULL, deep.split=NULL)

小编总结

RCA2是目前比较成熟的单细胞注释和可视化的工具，操作简单，绘图精美。RCA2在相对于RCA1在速度、性能上进行了优化，大大扩展了包含的参考数据集，并且可以更轻松地处理大型单细胞数据集（无监督聚类进行注释的新方法）。那么今天使用RCA2处理单细胞数据的方法小编就全部介绍完啦，有兴趣的同学可以自己尝试一下哦！