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科研 | Water Research：微塑料颗粒对处理废水中耐药性和致病性细菌传播的贡献

2021

08/27

微生态

A-

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环境中的微塑料颗粒（MPs）会产生特定的细菌群落可居住表面。

编译：微科盟清韵，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读

环境中的微塑料颗粒（MPs）会产生特定的细菌群落可居住表面，被定义为塑料微环境（Plastisphere），其中的细菌群落可能与周围环境中的细菌群落不同。MPs是广泛存在于水生生态系统中的污染物。尽管MPs大多被保留在污水处理厂（WWTPs）中，但大量的MPs到达开放水域，可能导致环境中致病菌和抗生素抗性基因的传播。目前，很少的研究集中在MPs作为污水处理厂潜在的致病菌和抗生素抗性细菌的载体的作用上。因此，本研究对MPs上的生物膜（塑料微环境，Plastisphere）和处理前后（消毒前后）废水中的浮游生物的细菌群落组成（16S rRNA基因扩增测序）、抗生素和金属抗性基因的丰度（qPCR）进行了调查。研究结果发现，在消毒前后，MPs在类型、颜色、大小和化学成分方面都非常相似。MPs上的细菌群落在丰富度、组成和网络结构方面与浮游生物群落不同。潜在的病原菌在处理过的废水中的丰度通常高于在MPs生物膜中的丰度。此外，在测试的抗性基因中，只有sul2（一种常见的抗磺胺类药物的抗性基因）在塑料微环境中的丰度高于浮游细菌群落。本研究结果表明，废水塑料微环境可以促进水生环境中致病菌和抗性基因的传播，尽管其贡献相对低于废水浮游细菌群落。

图片摘要

论文ID

原名：Contribution of microplastic particles to the spread of resistances and pathogenic bacteria intreated waste waters

译名：微塑料颗粒对处理废水中耐药性和致病性细菌传播的贡献

期刊：Water Research

IF：11.236

发表时间：2021.06.16

通讯作者：Andrea Di Cesare

通讯作者单位：意大利CNR水研究所

实验设计

结果

1 MPs的数量、尺寸和特征

所有样品均检出的MPs浓度在IN处理中测得最高（495±61 MPs L⁻¹）。整个污水处理显著降低了POST中的MPs，最终浓度为5.8 MPs L⁻¹（表1）。这种减少发生在第一个处理步骤IN和PRE之间，在处理前和处理后这个阶段没有进一步的变化，相当于98.9%的保留率。分离的MPs主要是碎片（80.0%），少量薄膜（14.2%）和纤维（4.7%），很少出现珠子（表1）。尺寸分析显示，IN、PRE和POST中最常见的尺寸在100到499 µm之间，其次是500-999 µm大小的碎片。MPs的颜色范围很广，但白色和透明的MPs分别占颗粒总数的29.4%和30.2%，在整个过程的各个阶段都是最丰富的。FT-IR分析表明，聚乙烯（PE，55%）是最常见的聚合物，其次是聚丙烯（PP，37%）（图1）。其他不太常见的聚合物有聚苯乙烯（PS）、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯腈和有机硅。如图S2所示，未知颗粒的光谱是通过将吸收带与从光谱库获得的或文献中报道的参比聚合物进行比较而确定的（表S3）。消毒（臭氧）对MPs的影响有限，因为它们的类型、大小和外观在处理过程中没有表现出任何明显的变化，除了蓝色/浅蓝色颗粒的浓度略有下降（表S4）。

表1. 在污水处理厂（WWTP）入口处（IN）、消毒处理前（PRE）和消毒处理后（POST）收集的MPs的平均浓度，按类型、大小和颜色分类。

图1.通过FT-IR光谱分析，对WWTP入口处（IN）、消毒处理前（PRE）和消毒处理后（POST）采集的样品中塑料聚合物的含量进行了分析。

2 抗生素和金属抗性基因和intI1丰度

ARGs在塑料微环境中范围为5.59×10⁻⁵~4.44×10⁻³gene copies/16S rRNA gene copy之间，在浮游细菌群落中范围为1.41×10⁻⁵~6.0 8×10⁻³gene copies/16S rRNA gene copy之间（图S3）。浮游生物群落中测试基因的总体标准化丰度显著高于塑料微环境（表S5）。特别是，ermB和qnrS在浮游生物群落中明显更丰富（图2；表S6），sul2在塑料微环境中明显更丰富，而其他处理测试的ARGs没有显示出任何差异。塑料微环境与浮游生物群落中的标准化czcA丰度无显著差异；在塑料微环境中，intI1的标准化丰度为7.42×10⁻²~1.48×10⁻¹gene copies/16S rRNA gene copy，在浮游群落中为4.57×10⁻²~1.48×10⁻¹gene copies/16S rRNA gene copy，不同环境背景（MPs和废水）之间无显著差异。消毒不影响检测基因的标准化丰度。相反，观察消毒对每个单一环境背景中基因丰度的影响，废水中只有sul2受到臭氧的影响，导致消毒后步骤的基因丰度明显高于消毒前（图S4；表S7）；而在臭氧处理前后的塑料微环境中没有发现明显的差异。

图2. ARGs的归一化丰度与实验变量显著相关。MPs和废水的细菌群落中sul2、ermB和qnrS丰度分布。

3 细菌群落组成和结构

MPs生物膜中最丰富的菌群是Flavobacteriaceae（10.1%），其次是Comamonadaceae（9.5%）和Rhodocyclaceae（7.7%）。废水中优势科也是Flavobacteriaceae（25.3%），其次是Moraxellaceae（8.1%）和Legionellaceae（7.2%）。就整个细菌群落而言，MPs的丰富度高于废水（图S5）；而单独分析环境背景，消毒后废水的丰富度高于消毒前的丰富度，臭氧没有影响MPs上生长的群落（图S6）。从潜在致病菌来看，废水的丰富度高于MPs。PERMANOVA分析结果表明，41.1%的β多样性变异是由环境背景（MPs或废水）解释的，13.5%由采样日期解释的，只有0.6%由消毒解释的（表S8）。环境背景两两比较导致显著差异（图S7）。相反，分别考虑废水和多氯联苯，消毒可以解释22.3%和12.4%的β多样性（表S9）。对于潜在致病菌的β多样性变异分析，PERMANOVA显示，环境背景可以解释26.6%，采样日期解释20.5%，消毒解释0.5%。通过随机森林分析，总细菌群落和潜在致病细菌群落的预测是正确的。在细菌群落总数的情况下，MPs和废水之间主要有16个属的差异分布（图3a），从而提高了群落预测的准确性。在这16个属中，只有Legionella和Tolumonas在废水中含量较丰富，而其他属在MPs上含量较高（图3b）。对于潜在的致病细菌，最重要的群落预测分类群只有7个（图4a）。除Coxiella外，所有这些细菌在浮游细菌群落中都更为丰富（图4b）。

图3. 细菌群落的随机森林分析结果。（a）在分类学预测的准确性中，最重要的细菌属对平均基尼系数下降的贡献。（b）两个分析环境背景（MPs和废水）中最重要的属的丰度。

图4. 潜在致病菌的随机森林分析结果。（a）在分类学预测的准确性中，最重要的细菌分类群对平均基尼系数下降的贡献。（b）两个分析环境背景（MPs和废水）中最重要的分类群的丰度。

在网络相关性分析中，两种细菌群落表现出不同的模式：在浮游群落中，共出现的元素数量几乎是塑料微环境计算的元素数量的4倍（图5和6a；表S10）。浮游生物群落中计算的边缘数高于MPs群落中观察到的边缘数。两种细菌群落都表现出模块化的网络结构（表S10）。两个细菌群落中的模块数量相似（塑料微环境中15个，浮游群落中17个）。然而，对于这两个网络，都有一个明显的主要模块，浮游细菌群落中22.7%的网络节点（部分由潜在致病菌组成）和塑料微环境中14.3%的网络节点。有趣的是，只有在废水中，潜在病原菌之间才能共存，相关网络中有ARGs和intI1基因（图6b）。考虑到臭氧的影响，在消毒后的废水网络中观察到共生现象的损失大约一半（消毒前和消毒后分别为136个节点、231个边和70个节点、88个边）（图S8；表S10）。相反，在臭氧处理前后，MPs显示出稳定的状况（消毒前和消毒后分别为54个节点、91个边和68个节点、138个边）（图S9；表S10）。

图5. MPs的相关性网络图。

图6. 废水的相关性网络图。（a）废水细菌群落网络。（b）废水中潜在致病菌的网络。

讨论

本研究中采样的污水处理厂（WWTP）在减少MPs方面效果很好：IN废水中计数的MPs有98%以上由WWTP保留，与之前研究中观察到的结果相似。与之前的发现相反，臭氧消毒并没有减少MPs的丰度：当比较PRE和POST样本时，MPs在数量、类型和尺寸方面的特征完全重叠。事实上，发现的唯一区别是蓝色/浅蓝色颗粒的浓度略低，这可能是因为臭氧对这种特定颜色的聚合物的破坏作用。与采样点无关，大多数被分析的MPs是由PE和PP组成的，只有IN样品中有相关百分比（19%）的MPs是由PS组成的。这些发现与在其他污水处理厂中观察到的相似，并与PE和PP是欧洲工业需求最高的聚合物的事实一致。

塑料微环境显示出比浮游细菌群落更丰富的细菌属，这与以前的一些研究相反，可能是由于所调查的环境具有完全不同的生态参数和干扰因素。基于群落组成的聚类也突出了塑料微环境和浮游细菌之间的结构差异，该聚类描述了不同聚类中的塑料微环境和浮游细菌群落，与其他测试变量（采样日期、消毒）无关，解释了群落组成变化的一半。这一结果并不令人惊讶，因为之前有报道称，MPs可以被认为是一个独立的空间生态位，容易被不同于构成浮游细菌群落的细菌定殖。这一结果表明，与通常只针对浮游细菌群落的污水处理厂污水研究检测到的细菌属相比，释放到环境中的细菌属数量更多。

群落组成的差异是由数量有限的属决定的，其中只有两个属在废水中含量较丰富（Legionella和Tolumonas），而其他属（Chryseobacterium、Steroidobacter、Byssovorax、Nannocystis、Acidibacter和Piscinibacter）在塑料微环境中含量较丰富。除Acidibacter外，后者都与活性污泥有关，其中一些细菌，如Chryseobacterium和Byssovorax，以前曾被报道为机会性致病细菌或抗生素耐药性细菌。可以推测，所有能区分塑料微环境组成的细菌属都来自活性污泥。考虑到MPs在生物处理阶段减少了专用于脱氮除磷的细菌的丰度，塑料微环境可能主要由活性污泥中选择的细菌组成。关于区分浮游细菌群落的两个属，Tolumonas最初是从缺氧的淡水沉积物中分离出来的，其主要特征是能够将取代的芳香族化合物转化为甲苯，而另一个属Legionella普遍存在于城市污水处理厂的细菌群落中，显示了其对废水处理的生存能力。潜在致病菌Legionella主要存在于浮游细菌群落中。此外，当只关注相关的潜在人类致病菌时，同样，塑料微环境和浮游细菌之间的差异是解释差异的主要因素，占26.6%。几种潜在致病细菌（Aeromonas、Bacteroidetes、Escherichia-Shigella、Legionella、Prevotella、Streptococcus）被认为是浮游细菌群落的判别者。这与之前一项研究相反，与暴露在高人为压力下的河流中的浮游生物群落（以及有机环境背景上的生物膜）相比，塑料微环境富含潜在致病细菌。在本研究中，直接在污水处理厂进行，潜在致病菌附着在MPs上的条件与开放水域非常不同。通过处理对细菌群落施加的剧烈变化，以及从入口到污水的有限暴露时间，为在限制因素不同（如温度、捕食、对自然资源的竞争）的环境中进一步定居留下了空间。在这里，竞争力较弱的菌株（如病原菌）可以在MPs上找到避难所，在那里限制因素的影响被平滑，提高了这些细菌的优势。两个细菌群落之间的另一个显著差异是在属间的共生性以及ARGs和intI1基因的共生性。虽然这两个细菌群落都显示出模块化结构，具有相似的模块数量，但如果与塑料微环境的细菌群落相比，形成浮游生物群落的属之间的相关性更大（无论是涉及的节点数还是边缘的数量）。有趣的是，浮游细菌群落的主要模块有超过22%的网络节点，其中含有丰富的含有潜在致病菌（如Bacteroides、Citrobacter）的分类群，在第二主要模块中还有ARGs（sul2、tetA和ermB）和intI1基因，以及潜在的致病菌（如Aeromonas、Escherichia-Shigella)。在塑料微环境的主要模块中，约有40%的网络节点，没有潜在的病原菌和ARGs。这一差异再次突显出，与污水处理厂中的浮游细菌群落相比，从采样污水处理厂中分离出的MPs不是允许病原菌生长的有利环境。此外，无论环境背景和采样日期如何，臭氧消毒过程不会影响细菌总数和潜在致病菌的组成。然而，独立分析每个单一的环境背景，只在废水中消毒引起细菌群落丰富度的增加。此外，观察到消毒后废水中的共生模式明显减少。然而，为了了解消毒对塑料微环境及其周围水的影响，还需要使用不同的方法学方法进行其他研究，如仅检测活细菌。

关于水环境中塑料微环境和浮游细菌群落中ARGs和/或MRGs丰度的比较研究很少，表明MPs生物膜一般都富含ARGs。在我们的研究中，细菌群落内ARGs和MRG的标准化丰度并没有遵循一个明显的趋势。ermB和qnrS在浮游细菌群落中含量较高，而sul2在塑料微环境中含量较高。臭氧处理后废水中的sul2含量也较高，说明这种消毒方式可能有助于在污水处理厂浮游细菌群落中选择该基因。为了全面比较相关基因的分布，有必要调整在不同研究中使用的方法，这里将本研究结果（qPCR量化的基因，从而提供了抗生素和金属耐药的部分信息）与其他使用鸟枪法宏基因组或高通量实时定量PCR的研究进行了比较。考虑到被广泛认为是人为污染指标的intI1基因的相似比例和ARGs丰度，根据观察到的潜在致病菌的有限选择，本研究可以推测，在塑料微环境和浮游生物群落中，MPs上的ARGs和MRGs的选择是有限的。事实上，这一猜测并不排除一旦环境背景的生态条件发生变化，这种底物在环境中的进一步定殖。此外，为了得出处理废水中的塑料微环境对水生态系统中病原菌和抗性基因传播的作用的一般结论，需要基于来自不同国家和不同季节的污水处理厂的样本收集进行广泛调查。

结论

这项研究证明了MPs上生长的细菌群落与WWTP中的浮游细菌群落之间的差异。此外，臭氧消毒过程并不影响MPs的含量和特性、塑料微环境中细菌群落的组成以及MPs上的ARGs和MRG丰度。总的来说，本研究表明MPs可以被认为是潜在病原菌（在塑料微环境中富集的Chryseobacterium）和ARGs（在塑料微环境中选择的sul2）的载体，以无柄形式（其中的细菌能更好地抵抗压力，而且水平基因转移率通常高于浮游细菌群落）存在于处理过的废水中，对人类健康构成严重关切。然而，与处理过的废水浮游生物群落相比，它们对病原体和ARGs在水生环境中传播的贡献相对较低。