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科研 | Microbiome：铁储备通过肠道微生物群影响肥胖患者的非酒精性脂肪肝

2021

08/21

微生态

A-

A+

研究结果显示肠道微生物群、铁储备和肝脏脂肪积累之间存在显著的相互影响。

导读

已知肠道微生物群和铁储备在非酒精性脂肪肝(NAFLD)的病理生理学中发挥作用，尽管它们复杂的相互作用尚不清楚。在这里，我们在2个特征良好的人类肥胖受试者队列(n = 49和n = 628)和由肥胖和非肥胖个体组成的独立队列(n = 130)，结合体外和动物模型，应用一个综合系统医学方法(肝/粪便宏基因组、血浆和尿液代谢组学、转录组)进行研究。血清铁蛋白水平作为肝脏铁储存的标记物，与肝脏脂肪积累呈正相关，与较低的肠道微生物基因丰富度、组成和功能呈正相关。铁蛋白与巴斯德氏菌科、明串珠菌科和微球菌科呈强负相关；与微孔菌属、双歧杆菌属和乳酸菌属呈一致负相关，与拟杆菌属和普雷沃菌属呈阳性相关。值得注意的是，铁蛋白相关的细菌家族与铁相关的肝脏基因有很强的相关性。此外，一些与铁代谢(运输、螯合、血红素和铁载体生物合成)和NAFLD(脂肪酸和谷胱甘肽生物合成)相关的细菌功能也与宿主血清铁蛋白水平相关。这种与铁相关的微生物组特征与转录组和代谢组特征相关联，而转录组和代谢组特征与肝葡萄糖代谢中肝脏脂肪积累的程度相关。特别是，我们发现血清铁蛋白、巴氏杆菌科和微球菌科、参与组氨酸运输的细菌功能、宿主循环组氨酸水平和GYS2和SEC24B在肝脏的表达之间存在一致的关联。血清铁蛋白也与细菌甘氨酸转运体、宿主血清甘氨酸水平和肝脏甘氨酸转运体的表达有关。转录组学的研究结果在人类原代肝细胞中得到了重复，铁补充也导致甘油三酯的积累，并诱导脂质和铁代谢基因的表达与棕榈酸协同作用。我们进一步探讨了通过将粪便微生物群移植到受体小鼠体内，微生物群对铁代谢和肝脏事实积累的直接影响。与人类的结果一致，来自高铁蛋白供体的移植导致了受体小鼠铁代谢和脂肪酸积累相关的几个基因的改变。总之，本文揭示了肠道微生物组、铁储备和肝脏脂肪积累之间的显著相互作用，这对靶向治疗具有潜在的意义。

论文ID

原名：Iron status influences non-alcoholic fatty liver disease in obesity through the gut microbiome

译名：铁储备通过肠道微生物群影响肥胖患者的非酒精性脂肪肝

期刊：Microbiome

IF：14.650

发表时间：2021.5

通讯作者：José-Manuel Fernández-Real

通讯作者单位：赫罗纳医院内分泌、糖尿病和营养科

实验设计

结果

该研究的人类队列和组学分析概述见图S1。在三个队列中测定血清铁蛋白:(a)肥胖受试者的发现队列(n = 49)；(b)意大利和西班牙的肥胖受试者验证队列(n = 628)；(c)西班牙有和没有肥胖的独立队列研究对象(n = 130)。在发现队列和复制队列的亚样本(血浆(n=48和n= 328)和尿液(n=47和n=322)中获得血浆和尿液代谢组学。在发现和复制队列的一个亚样本(n = 86)中分析了转录组。最后，来自复制和验证队列的56名肥胖女性以及来自独立队列的130名肥胖和非肥胖受试者的粪便样本用于进行鸟枪宏基因组学测序。

1 血清铁蛋白升高与肝脏脂肪积累和肠道微生物组组成和功能有关

在发现组和复制组中，血清铁蛋白随着肝脏脂肪积累的严重程度而增加(图1a, b)。在3个队列中，均未发现高敏c反应蛋白(hs-CRP)和血清铁蛋白之间的显著相关性(图1c，图S2a,b)。我们还进行了宏基因组学、1H NMR和转录组学来表征粪便微生物组、生物液代谢组和肝脏转录组。每个个体处理了> 5 Gb的宏基因组序列数据，我们对来自意大利和西班牙的56名肥胖女性的亚样本进行了分类、基因丰富度、基因功能的定位和注释。我们对来自意大利和西班牙的56名肥胖女性的亚样本进行了分类、基因丰富度、基因功能的定位和注释。铁蛋白最高四分位数(Q3和Q4)的受试者与铁蛋白较低四分位数(Q1)的受试者相比，基因丰富度降低(图1d)。一致地，根据年龄、BMI、国家和hs-CRP调整的多变量惩罚回归模型显示，血清铁蛋白和肠道微生物组之间存在显著相关性，来自厚壁菌门、放线菌门和变形菌门，特别是巴氏杆菌门的家族显著减少，明串珠菌科和微球菌科(图1e,f)。通过单变量偏斯皮尔曼相关(pSC)分析，并根据年龄、BMI、国家和hs-CRP进行校正，通过多变量正交偏最小二乘(O-PLS)回归和后验验证得到类似结果(图S3a f)。值得注意的是，通过定量qRT-PCR检测，所有已鉴定的铁蛋白相关细菌科(除了Leuconostocaceae)均与铁相关基因如TFRC、HAMP、MitoNEET、IRP1和运铁蛋白(SLC40A1)具有很强的相关性(图S4)。我们在130名有或没有肥胖的独立队列中使用DESeq2分析重复了这些发现，经过年龄、BMI、性别和hs-CRP的调整后，他们的血清铁蛋白与细菌科属之间的大部分关联得到了证实(图1g)。最一致的结果是，几种Veillonella、双歧杆菌和乳酸菌(来自厚壁菌门和放线菌门)与血清铁蛋白水平呈负相关，而与拟杆菌和普雷沃菌(来自拟杆菌门)呈正相关。物种水平的DESeq2分析也揭示了在肥胖或者非肥胖中与Veillonella sp. AS16、Veillonella sp. 6_1_27、乳酸菌属、肺炎链球菌属、毛螺杆菌科细菌TF01-11、拟杆菌属GAC:633、粪孢拟杆菌属、massiliensis、massiliensis和普雷沃氏菌属CAG:487持续的联系。值得注意的是，与hs-CRP相关的微生物组与血清铁蛋白相关的微生物组明显不同(图S5a,b)。除微生物组组成外，该队列还通过散弹枪测序来评估其功能。值得注意的是，基于KEGG功能注释的细菌宏基因组分析发现了一些与血清铁蛋白浓度相关的细菌功能，包括铁和氨基酸运输、谷胱甘肽代谢、血红素和铁载体生物合成、脂肪酸生物合成和DNA复制和修复。基于EggNOG功能注释的额外的O-PLS回归分析显示了类似的结果。

图1 血清铁蛋白与肝脏脂肪积累、基因丰富度和肠道微生物组组成的相关性。a发现队列和b复制队列中血清铁蛋白与肝脏脂肪积累程度的关联(Mann-Kendall趋势检验和Wilcoxon检验)。c复制队列中hs-CRP与血清铁蛋白四分位数的相关性(Mann-Kendall趋势检验和Wilcoxon检验)。d在发现和复制队列的肥胖女性亚样本中，微生物基因丰富度与铁蛋白四分位数的关联(广义线性模型GLM)。e在发现和复制队列的肥胖妇女亚样本中与血清铁蛋白相关的细菌家族和f属。以年龄、BMI、国家和hs-CRP等细菌数据为协变量，建立Mnet惩罚回归模型。g不同细菌丰度和h宏基因组KEGG功能与铁蛋白相关的火山图，这是通过对肥胖和非肥胖受试者的独立队列进行shotgun宏基因组测序计算得出的，校正了年龄、BMI、性别和hs-CRP。根据门的不同，明显不同的类群是有颜色的。adaB 甲基化-DNA——(蛋白质)半胱氨酸S-甲基转移酶；cpg；谷氨酸羧肽酶；cycA；D-serine/D-alanine/甘氨酸转运体；3-羟基酰基[酰基载体蛋白]脱水酶/反式-2-癸烯基[酰基载体蛋白]异构酶fabA；fabM；trans-2-decenoyl-[acylcarrier蛋白质]异构酶；gshA glutamate-cysteine连接酶；nei核酸内切酶八世；entF，肠杆菌素合成酶成分F；FTR, FTH1, efeU，高亲和铁转运体；hemG；甲基萘醌-dependent 前原卟啉氧化酶；hutM组氨酸通透酶；mtsC；铁/锌/锰/铜转运系统渗透酶蛋白；mtsA；铁/锌/锰/铜转运系统底物结合蛋白；聚[adp -核糖]聚合酶；seqA；复制起始负调制器；铁螯合还原酶。

2 铁相关转录组特征与肠道微生物和肝脏脂肪积累有关

然后，我们在意大利和西班牙发现和复制队列的一个亚样本(n = 86)中探讨了血清铁蛋白与肝脏转录组的关系。从O-PLS模型中鉴定出的48个mRNAs(图2a)中，转铁蛋白受体(TFRC，Pfdr<1.0*10¹⁰)、hepcidin抗菌肽(HAMP，pFDR = 1.95*10⁵)、NCOA4 (pFDR = 0.05)和铁蛋白重链(FTH1，pFDR = 0.003)，均参与铁储备，经过pSC进一步的个体验证后，是与血清铁蛋白最相关的mRNAs (图2b)。富集分析强调了与铁和葡萄糖代谢相关的通路的显著过度代表(图2c)。我们进一步研究了几种溶质载体(SLCs)的表达与血清铁蛋白浓度之间的关系(图2d, e)。SLC51A、SLC11A1和SLC6A9与血清铁蛋白的相关性最强。然后，整合宏基因组和转录组结果，我们鉴定了与微生物组和肝脏脂肪积累程度相关的铁相关转录组签名(图2f-k，图S6)。从铁蛋白相关细菌家族和转录本之间的O2-PLS多变量整合、层次聚类分析和单变量pSC，我们确定了一个明确的聚类，包括NUDT10、NNMT、MTUS1、SOCS2和SBNO2，随着铁蛋白水平的升高而下调(图2h)，并与不同细菌家族的变异相关，而这些细菌家族本身与血清铁蛋白有关(图2g, k)。在第二个聚类中，SEC24B、GYS2、SLC51A、TFRC、RPSX5、LOC100130078和ACSM5的表达也被这些家族所反映。第三组与铁蛋白正相关的基因（USP3、SIX1、PDE7A和SNAPC2）也与这些细菌家族反相关。值得注意的是，这些细菌相关基因的表达随着血清铁蛋白水平和肝脏脂肪积累的比例而改变(图S6)。

图2 转录组数据与血清铁蛋白的关联。对意大利和西班牙发现和复制队列的亚样本中血清铁蛋白和肝脏转录组之间的O-PLS模型进行拟合优度(R2Y)和预测优度(Q2Y)的排列检验(n = 86)。b通过校正年龄、性别、BMI和国家的pSC进一步验证O-PLS显著变量后，与血清铁蛋白相关的显著转录本。c与血清铁蛋白显著相关的通路，通过超几何检验的过代表分析绘制相关转录本。d血清铁蛋白与SLCs间O-PLS模型的排列试验(n = 86)。e通过校正年龄、性别、BMI和国家的pSC对O-PLS结果进行进一步验证后，发现显著的SLCs与血清铁蛋白相关。f与血清铁蛋白相关的微生物家族和基因的联合变异的O2-PLS评分。基于7倍交叉验证，构建了基因和细菌家族块的2个预测分量和1个正交分量模型。g O2-PLS联合载荷图，其中pcorr表示来自基因块的相关比例载荷，qcorr表示来自细菌科块的相关比例载荷。h显示每个受试者铁蛋白相关转录本z分数的热图。聚类方法基于欧式距离和沃德连锁。O-PLS模型中与肝脏脂肪积累相关的基因用粗体标出，而O2-PLS模型中与细菌家族相关的基因用彩盒标出。i经年龄、BMI、性别和国家调整的铁蛋白相关血浆和含铁蛋白相关转录本的j尿液代谢物之间的pSC热图(n = 86)。k显著(p <0.05)经年龄、BMI和国家调整的铁蛋白相关家族和转录本之间的pSC (n = 56)。只有显著关联(p<0.05)显示。pFDR校正后的显著相关性(pFDR<0.05)用黑盒子突出显示。l人原代肝细胞GSK3B、PDE7A、SBNO2基因表达上调，GYS2、SEC24B、SOCS2、MTUS1和SLC51A基因表达下调。数据为平均值 ± SEM。单因素方差分析比较。根据t检验，与对照组比较* p<0.05, * * p<0.01 * * * p<0.001；根据t检验，与PA组比较，# p<0.05，## p<0.01，### p<0.001。Ctrl，对照组；PA，棕榈酸；Fe 48 h，50 μM铁预处理48 h；Fe 72 h，50 μM铁预处理72 h；Fe48h + PA，50 μM铁预处理48h+棕榈酸200 μM预处理24 h；Fe72h + PA，50 μM铁预处理72 h +棕榈酸200 μM预处理24 h。

3 转录组特征在人原代肝细胞中复制

然后，我们试图通过研究铁和棕榈酸(PA)，肝脂肪积累的触发器，在人原代肝细胞中的作用来验证转录组研究结果。我们发现铁、PA和PA在经铁预处理的细胞中补充导致原代人肝细胞中甘油三酯的积累(图S7a, b)。值得注意的是，铁与PA协同诱导脂质代谢基因(FABP4、FABP5、FATP5)和脂肪酸转运蛋白CD36的表达显著增加(图S7c f)，同时铁相关基因(FTL和FTH)的上调。

引人注目的是，与单独使用PA或铁相比，经铁预处理的细胞中补充PA降低了大多数与血清铁蛋白负相关的已鉴定基因的表达(GY2, SEC24B, MTUS1, SOCS2, SLC51A)，与脂肪积累相对应(图2l s)。证实了在不同程度肝脂肪堆积的受试者中观察到的相关性。例外是SBNO2，已知在促炎反应中增加。相反，铁暴露后与血清铁蛋白(PDE7A)和肝脂肪变性呈正相关的基因显著增加。

4 代谢组学识别糖异生底物和酮体与铁相关的微生物组和转录组特征

然后，我们对血清(图3a d)和尿液(图3e h)中的铁蛋白进行了发现和复制代谢组范围关联研究(MWAS)，使用经pSC证实的OPLS多变量回归分析。我们在发现（血浆 n = 48；尿液 n = 47）和复制（血浆 n = 328；尿液 n = 322）队列中鉴定了几种代谢物，例如酮体和糖异生底物转录组特征（图 2i、j）与 NAFLD 的微生物组和严重程度相关。通过O2-PLS回归整合铁蛋白相关代谢物和细菌家族(图3i, j)显示组氨酸、酪氨酸、这些家族也与酮体(3-羟基丁酸酯(3- ohb)和乙酰乙酸酯)有很强的负相关关系。

图3 代谢组学数据与血清铁蛋白的相关性。拟合优度排列测试(R2Y)和善良的预测(Q2Y)从O-PLS获得模型血清铁蛋白和血清之间(n = 48)和e尿液代谢组(n = 47)在发现人群中,和b血清(n = 328)和f尿代谢组(n = 322)复制队列。通过调整年龄、性别、BMI和国家的pSC对O-PLS确定的代谢物进行进一步验证后，显著的c、d血清代谢物和g、h尿液代谢物与血清铁蛋白相关。i与血清铁蛋白相关的血浆和尿液代谢物和微生物家族之间联合变异的O2-PLS评分。基于7倍交叉验证，构建了含有2个预测分量和0和1个正交分量的代谢物和细菌家族块模型。j O2-PLS联合载荷图，其中pcorr表示来自基因块的相关比例载荷，qcorr表示来自细菌科块的相关比例载荷。k经年龄、BMI和国家调整的铁蛋白相关尿液和铁蛋白相关细菌家族的l血浆代谢物之间的pSC热图(n = 56)。只有显著关联(p<0.05)显示。pFDR校正后的显著相关性(pFDR<0.05)用黑盒子突出显示。

5 铁会影响肠道微生物的组成

为了验证铁储备与人体中发现的微生物组之间的相互作用，我们首先测试了膳食铁含量是否会影响小鼠体内的微生物组(图4a)。通过16S rRNA基因扩增子测序，我们发现膳食中铁的变化极大地改变了肠道微生物群的组成(图4b, c)。然后，我们利用宏基因组学研究了高脂饮食和铁含量不同的对照饮食对小鼠的影响(图4d)。随着饲料中脂肪和铁含量的增加，细菌多样性和观察物种发生了显著变化(图4e)。高脂肪饮食降低了低铁饮食下的细菌多样性，而高铁饮食则相反。主坐标分析显示，不同饮食中铁含量不同的微生物群落组成(图4h, i)。有趣的是，高脂饲粮和对照组饲粮微生物组成的差异随着铁含量的增加而减小，在高铁水平下变得不显著(图S8a d)。在O-PLS模型中，与患者血清铁蛋白呈负相关的厚壁菌门的几个科和属被证实受到小鼠饮食铁含量的相应影响。

6 肠道微生物影响铁的代谢

在发现铁可利用性对肠道细菌生态系统有很大影响后，我们评估了微生物群自身是否可能影响铁储备。我们利用我们之前的小鼠研究，即粪便微生物群移植(FMT)触发了肝脂肪积累，以评估人类供体铁蛋白水平和受体小鼠铁相关基因之间的关系(图4n)。O-PLS鉴别分析显示，来自高铁蛋白供体组的微生物群导致了铁代谢相关基因的改变，ftl1、fth1和slc40a1增加，同时tfrc减少(图4or)，这与人类的转录组学结果和人类原代肝细胞的体外结果一致。此外，与体外结果一致，来自高铁蛋白供体的微生物群也增加了受体小鼠肝脏中fabp4的表达，显示了铁蛋白相关微生物群对肝脏脂质积累的影响。

图4 原代肝细胞和FMT小鼠的验证研究。1.实验设计方案小鼠连续喂食含低(LI)、低正常(LNI)、高正常(HNI)、中高(MHI)和高(HI)铁剂量的饲料9周。b显示每只老鼠属相对丰度的热图。c基于unifrac距离度量描述组间差异的主坐标分析(PCoA)。d研究2的实验设计方案小鼠分别饲喂含四种不同铁量(LI、LNI、HNI、MHI)的高脂饮食(HFD)或非HFD饮食10周。e Shannon多样性指数、f Chao1丰富度估计器和g观察不同铁剂量(LI、LNI、HNI、MHI)高HFD和非高HFD小鼠的变化。h PCoA基于堪培拉距离度量的非hfd喂养小鼠和i hfd喂养小鼠不同铁剂量。采用PERM方差分析(PERM ANOVA)，采用999种排列，评估每种饮食中铁剂量之间的微生物组成差异。j, k分别对hfd喂养小鼠铁剂量与细菌科属之间的O-PLS模型进行排列试验。l从O-PLS回归负荷中鉴定出与铁剂量相关的显著家系和m属。n研究3实验设计方案选择低铁蛋白(n = 3)和高铁蛋白(n = 3)微生物群人类供体，每个供体的粪便样本经抗生素处理后移植n = 6 8只小鼠。定植灌胃14天后处死小鼠，用PCR法测定铁和肝脂肪积累相关基因(n = 22)。o小鼠基因与人类供体组(低或高铁蛋白)之间O-PLS-DA模型的排列测试。p O-PLS-DA回归负荷中与供体组相关的显著小鼠基因。q铁运蛋白(Slc40a1)和r Tfrc的表达与供体铁蛋白浓度有关。

讨论

在目前的研究中，我们评估了肠道微生物群对铁储备和肝脂肪积累的贡献，在肥胖患者的发现和验证队列和另外的独立队列个体有和没有。在动物模型中，我们进一步确定了微生物组作为铁储备调节者的潜在作用，铁储备控制肝脂肪沉积。血清铁蛋白水平与肝脏脂肪积累呈正相关，并与几种细菌家族的减少平行。同时，这些铁蛋白相关家族与参与铁代谢的肝脏基因有关。巴斯德氏菌科与血清铁蛋白水平的负相关最强，这与它们依赖利用宿主转铁蛋白中的铁进行生长和存活是一致的。最近，糖尿病小鼠的肝脂质水平，包括胆汁酸，与微球菌科呈负相关，而脱硫弧菌科与过度喂养诱导的脂肪肝有关。与我们的结果一致的是，在大鼠的盲肠中发现了添加铁后粪球菌的含量增加，这表明它介导了氧化应激和肝组织病理改变。同样与我们的结果一致的是，在接受健康供体FMT的溃疡性结肠炎患者中，低血清铁蛋白浓度与微绒毛菌属丰度的降低同时存在，而在NASH患者中，微绒毛菌属丰度在改善脂肪变性后呈剂量依赖性增加。此外，具有肝脂肪减少70%的群体内有减少甲烷短杆菌的趋势，我们也发现这与血清铁蛋白水平负相关。在肥胖和NASH个体中，拟杆菌属(Bacteroides)和普雷沃菌属(Prevotella)显著显著地增加，而从健康组到NASH组，双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度则逐渐减少。最后，乳酸菌缺铁与几种乳酸菌以及血清铁蛋白水平呈负相关关系是一致的。

虽然我们使用铁蛋白作为铁储存的标记物，但我们必须考虑到它也是一种急性阶段的反应物，在炎症条件下会增加。考虑到我们的研究对象都是肥胖，而低度慢性炎症是肥胖的标志，炎症可能对于铁蛋白水平有影响。重要的是，我们没有发现炎症标志物(hsCRP)和血清铁蛋白之间的任何显著关联，这表明血清铁蛋白可以测量我们队列中的铁储量。为了进一步排除已确认的关联中炎症的影响，我们通过hs-CRP调整了我们的分析。值得注意的是，与hs-CRP相关的微生物组与与血清铁蛋白相关的微生物组明显不同，这证实了观察到的微生物组与铁蛋白的关联与炎症无关。

除了识别铁相关的微生物组特征外，我们还评估了微生物组的功能。不同的细菌途径与宿主体内的铁储存有关，包括血红素和铁载体(铁结合分子)的生物合成、铁运输、谷胱甘肽代谢和DNA复制和修复(已知的铁依赖)。值得注意的是，细菌细胞色素b561功能与血清铁蛋白水平呈强烈的负相关。由于已知细胞色素b561参与铁吸收，这一发现表明，细菌细胞色素b561与肠道中影响铁摄取的酶竞争。结果表明，几种细菌铁转运和螯合功能(FTR、FTH1、efeU；yqjH；mtsC；和mtsA)在高血清铁蛋白水平的受试者中降低。类似地，参与血红素生物合成的细菌酶(尿卟啉原脱羧酶；和hemG(甲萘醌依赖的原卟啉原氧化酶)和铁载体生物合成(entF，肠杆菌素合成酶成分F)也与血清铁蛋白呈强负相关。同样值得注意的是，宿主血清铁蛋白水平与参与谷胱甘肽生物合成(gshA，谷氨酸-半胱氨酸连接酶)和谷胱甘肽前体(cpg，谷氨酸羧肽酶)的细菌功能密切相关。有趣的是，NAFLD患者的血浆和肝脏中谷胱甘肽水平下降，而谷胱甘肽代谢改变已被确定为NAFLD的普遍特征。

我们还评估了血清铁蛋白与肝脏转录组和血清和尿液代谢组的相关性。值得注意的是，我们确定了与微生物组和肝脏脂肪积累程度相关的铁相关转录组特征，我们通过向人类原代肝细胞补充铁和 PA（肝脏脂肪积累的触发因素）证实了这一点。重要的是，过量的糖异生与人类的NAFLD有关，铁也被证明影响糖异生信号。与之前的结果一致，我们发现了参与葡萄糖代谢的基因的改变。因此，从参与微生物组铁相关转录组特征(也与肝脏脂肪积累有关)的mRNAs中，GYS2(催化糖原合成的限速步骤)显示出与NAFLD最强的负相关。众所周知，GYS2的破坏通过增加SREBP1c的表达，改变从头脂肪生成，从而导致小鼠葡萄糖沉积受损、肝脏胰岛素抵抗和肝脏脂肪积累。胰岛素也通过抑制GSK3向SREBP1发出信号，我们发现这与铁蛋白水平呈正相关。与这些结果相一致，我们发现用铁或棕榈酸处理人原代肝细胞后，GSK3B表达上调，而共同处理后这种上调加剧。有趣的是，我们发现铁蛋白和胰岛素作用之间存在负相关(r = 0.31, p = 8.9e-4)。GYS2与SEC24B聚集在一起，SEC24B负责蛋白质的ERto-Golgi运输，而ER- to-Golgi运输的中断已被证明有助于内质网应激、肝损伤和NAFLD。这些转录组学的发现得到了代谢组学结果的支持。因此，我们鉴定了一些铁蛋白相关的代谢物(肌氨酸、瓜氨酸、谷氨酸)，这些代谢物此前与铁诱导的葡萄糖代谢损伤有关。我们一致发现，高铁蛋白浓度的受试者血清中谷氨酰胺、丙氨酸和甘油水平较低，这是肝脏糖异生的主要底物，肝脏转录组学记录了这一点。值得注意的是，谷氨酰胺与明串珠菌科(Leuconostocaceae)有很强的正相关，而明串珠菌科是与血清铁蛋白水平负相关最多的细菌家族之一。然而，最一致的影响是发现和复制队列中血清铁蛋白与组氨酸水平的负相关。组氨酸通过激活STAT3抑制肝糖异生，而不依赖于胰岛素的中枢作用。值得注意的是，宿主血清铁蛋白水平与细菌功能组氨酸透酶(hutM)、巴斯德氏菌科和微球菌科密切相关，两者也与肝脏GYS2的表达呈正相关。这些家族也与SLC51A表达密切相关。该基因参与胆汁酸运输，最近被发现与NASH有关。重要的是，肠道微生物群可以调节胆汁酸池大小和组成，而胆汁酸在NAFLD的发病和进展中发挥重要作用。有趣的是,大多数胆汁酸结合甘氨酸和我们确定了甘氨酸消极与血清铁蛋白(图3c, d)。此外,血红素生物合成的甘氨酸是病原的关键组成部分，主要由甘氨酸转运体1(GLYT1)由SLC6A9编码，这与血清铁蛋白呈正相关。这种增加的甘氨酸需求可能解释了与高铁蛋白浓度相关的低血清水平。此外，在NAFLD患者中，甘氨酸是谷氨酸合成谷胱甘肽的限制性底物。值得注意的是，我们发现血清铁蛋白水平与细菌甘氨酸转运体(cycA)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶(gshA)的表达之间存在强烈的负相关，gshA是谷胱甘肽生物合成途径中的第一个酶。最后，血清丙酮和3-OHB也与血清铁蛋白浓度呈正相关，与高胰岛素血症一致，高胰岛素血症导致能量供应从NAFLD中的葡萄糖转移到酮体，同时增加后者的循环水平。血清3-OHB水平也与肝脏SLC51A和SBNO2表达呈强负相关，二者均与巴氏杆菌科和微球菌科正相关。一致地，在LPS 诱导的全身性内毒素血症后 SBNO2表达显著增加。相反，SOCS2(另一种阴性炎症规律)对LPS信号的控制是最小，这也与我们观察到的细菌家族与该基因在肝脏的表达缺乏关联相一致。

我们试图通过铁和棕榈酸治疗人原代肝细胞来验证这些结果。对于发现队列(GSK3B, PDE7A)中与血清铁蛋白正相关的基因转录本，包括不同程度肝脂肪积累的受试者，我们发现无论是软脂酸治疗还是铁治疗后，这些基因的表达均呈一致的上调。与软脂酸和铁共同处理加剧了这些影响。一些与血清铁蛋白和脂肪变性程度负相关的基因在铁或铁+棕榈酸治疗后持续下调(SLC51A, MTUS1)。然而，该脂肪变性队列中与血清铁蛋白负相关的其他基因(GYS2、SEC24B、SOCS2)的结果似乎不同。因此，与我们的预期相反，铁和/或棕榈酸治疗导致这些基因在人原代肝细胞中上调。然而，铁和棕榈共同处理下调了这些基因的表达，这与发现队列中观察到的结果一致。我们推测，这种下调可能是由激作用引起的，即稳态初始中断后的适应性代偿过程，以补偿单纯由棕榈酸或铁引起的基因表达初始中断。

我们的结果，基于对铁代谢和NAFLD涉及的几种细菌种类和宏基因组功能的鉴定，表明微生物组对铁代谢有直接影响。因此，我们通过小鼠FMT实验进一步探讨肠道微生物对铁代谢和肝脏事实积累的潜在诱因作用。从“高铁蛋白供体”到受体小鼠的粪便微生物组移植增加了几种参与铁代谢的基因以及促进脂肪酸积累的基因（如fabp4）的表达，这与用铁处理人类原代肝细胞后观察到的结果一致。相反，来自“低铁蛋白供体”的微生物群增加了铁相关的Tfrc的表达。这与我们在人类实验中的发现一致，我们发现放线菌科、Acidaminococcacea和Enterobacteriaceae家族(两者在低血清铁蛋白水平的实验对象的微生物群中均增加)和宿主肝脏TFRC表达之间有很强的正相关。这些结果也与脂肪酸生物合成相关的宏基因组功能(fabM和fabA)与宿主血清铁蛋白浓度之间的负相关一致。这可能反映了微生物群可能利用宿主的脂肪酸，避免了从头合成的过程。因此，我们证明了微生物群本身可以在受体小鼠中再现来自人类供体的铁代谢的显著特征，从而长期影响肝脏脂肪的积累。

目前的研究存在一些局限性，少数细菌种群可能在NAFLD的发展中起作用，但宏基因组学仍未检测到。另一方面，FMT实验也有其局限性，一些严格的厌氧菌可能在NAFLD的形成中发挥作用，但在样品采集、存储和操作过程中丢失。我们发现了铁相关基因表达的变化，但这些变化对小鼠铁水平的影响尚未评估。因此，微生物组作为铁储备调节器的因果作用需要通过这些小鼠循环铁制造者的测量来进一步证实。最后,我们显示补铁对细菌的微生物组成和生物多样性的影响和观察到的物种发生了翻天覆地的变化根据脂肪和含铁量的饮食(图4 e-g)。它需要进一步调查是否补铁对小鼠的脂肪沉积在肝脏的影响在不同饲养制度。

结论

总之，将综合系统医学方法与独立队列验证和临床前模型因果关系评估相结合，我们的研究结果显示肠道微生物群、铁储备和肝脏脂肪积累之间存在显著的相互影响。特别是，我们发现了涉及糖异生代谢物、酮体和细胞运输失衡的微生物组学和铁相关代谢组学和转录组学特征，这些特征共同调节肝脏脂肪积累。这项工作强调了微量营养素之间相互作用的关键重要性，微生物组和总宿主稳态，特别是微生物组-铁-肝脂肪轴，从而揭示潜在的治疗靶点。