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北京市肺炭疽实验室检测技术方案（试行）

一、样本前处理  

（一）对于放在密封塑料管中的拭子样本，加入1mL无菌生理盐水，充分振荡，放置5-10分钟，取浸出液进行检测；

（二）对于痰液，加入等体积痰消化液，混匀后放置5-10分钟，取上清液进行检测；

（三）对于粪便和呕吐物，加入等体积无菌生理盐水，混匀后取上清进行检测；

（四）对于土壤、草料、皮毛等外环境样本，加入适量无菌生理盐水漂洗，取上清液进行检测；培养前在65℃加热25-30分钟杀死杂菌；

二、样本检测方法  

（一）直接镜检

取经过预处理的样本、液体样本（如脑脊液、血液）少量，直接涂片，革兰氏染色后在100倍油镜下观察。发现链状排列的革兰氏染色阳性大杆菌、两端平齐、芽胞位于细胞中间位置时，判断为炭疽芽胞杆菌直接镜检阳性。

（二）抗原胶体金快速检测

取炭疽芽胞杆菌抗原胶体金检测试剂条，在样本孔中加入经过预处理的样本、液体样本（如脑脊液、全血）50 μＬ，质控带显色后1分钟内观察。质控带和样本带同时显色判断为阳性，单一质控带显色为阴性，质控带未显色试验失败，需重复检测。

（三）炭疽芽胞杆菌抗体胶体金快速检测

取炭疽芽胞杆菌抗体胶体金检测试剂条，在样本孔中加入血清样本50 uL，质控带显色后1分钟内观察。质控带和样本带同时显色判断为阳性，单一质控带显色为阴性，质控带未显色试验失败，需重复检测。

（四）PCR检测

1、模板的制备

经过处理的样本、液体样本、培养后的菌落采用商品化试剂盒提取核酸，按照试剂盒说明书进行操作。提取的核酸溶解在TE溶液中。对培养后菌落可用加热法快速提取核酸：挑取1-2个菌落加入EP管中，加入150 μＬ去离子水并混均后100℃处理10 min，12000 rpm离心5分钟，取上清液作为模板。

2、引物、探针序列如下表所示。

待测基因	引物及探针名称	序列 (5’-3’)	探针标记
	pagA-F	GCG ACC GTA CTT GAA TTC GAA	/
pagA	pagA-R	TGC GTC GTT CTT TGA TAT TGG T	/
	pagA-P	TCC TGC AGA TAC ACT CC	FAM
	cap-F	ATG GTA ACC CTT GTC TTT GAA TTG T	/
cap	cap-R	TTG AAT TCC GTG GTA TTG GAG TT	/
	cap-P	TTT GCA ATT AAT CCT GGA ACA A	FAM
	rpoB-F	ACC ACC AAC AGT AGA AAA TGC C	/
rpoB	rpoB-R	GCG ACC TAC ATT TGC TAA ATC A	/
	rpoB-P	AGA GCT TAC TTG  TGT CTC G	FAM

3 、 PCR 反应体系 (25μ L/ 份 )

酶和缓冲液：	10 μL
上游引物（10μM）：	0.4 μL
下游引物（10μM）：	0.4 μL
荧光探针（10μM）：	0.4 μL
模板DNA：	1.0μL
灭菌蒸馏水	7.8μL
反应条件：95℃预变性30  sec；95℃变性5sec、58℃退火延伸 34 sec，45个循环.

4、结果判断：

Ct值在15-40之间且阴性对照成立，判断为PCR反应阳性。pagA基因和cap基因阳性同时可判断为样本中炭疽芽胞杆菌核酸阳性。

（五）分离培养和鉴定

1、样本接种培养

取经过预处理的样本、液体样本少量，在营养琼脂平板和血琼脂平板上划线接种，37℃培养24-48 h。可疑菌落形态为扁平粗糙，灰白色，干燥，边缘不整齐；培养20 h以内的菌落在低倍镜下呈卷发状；血平板上菌落周围不产生溶血环。

2、染色鉴定

取部分可疑菌落涂片，经革兰氏染色，在100倍油镜下发现革兰氏染色阳性大杆菌，两端平齐，长链状排列，原生质相连呈竹节状，具有典型卵圆形芽胞，靠近细胞中央或靠近边缘，细胞不膨胀，判断为炭疽芽胞杆菌。

3、青霉素敏感试验和噬菌体敏感试验

可疑菌落经分离纯化培养（37℃，24h）后，取纯菌均匀涂布于营养琼脂平板上，平板一侧中央无菌操作放一片青霉素药敏纸片（10 U/mL）;另一侧滴加一滴炭疽噬菌体，略倾斜平板使噬菌体流下一段距离。

在37℃下培养24h。观察药敏纸片周围细菌生长情况和噬菌斑形成情况。青霉素药敏纸片周围无生长且形成长泪滴状噬菌斑可判断为炭疽芽胞杆菌阳性。

三、生物安全要求  

从事样本检测的技术人员必须经过生物安全培训和具备相应的实验技能，在检测的过程中样本检测人员必需采取传染病二级防护措施，即佩戴N95医用防护口罩、工作帽、护目镜或面屏、双层医用乳胶手套、医用连体防护服、工作鞋和鞋套。

样本检测应生物安全二级（BSL-2）及以上实验室内进行。样本检测，包括打开样本管及检测操作等须在二级及以上生物安全柜内进行。提取的核酸样本可在生物安全一级（BSL-1）实验室进行扩增检测。大量活菌操作须在生物安全三级（BSL-3）实验室内进行。样本采集过程产生的废弃物须在现场放入黄色垃圾袋中并密封，经121℃高压蒸汽灭菌处理30 min后方可废弃。检测过程产生的废弃物，经121℃高压蒸汽灭菌处理30min方可废弃。

来源：北京疾控