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科研 | 西南医科大学：膳食补充剂红景天提取物通过抗感染、调节肠道屏障完整性和重塑肠道微生物群减轻DSS诱导的小鼠结肠炎

2021

08/17

微生态

A-

A+

编译：微科盟花城，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。导读红景天属植物是一种可食用的药用植物，在亚洲和欧洲传统上被用作调节剂、补品、抗抑郁剂和消炎剂。然而，它对结肠炎是否有治疗作用尚不清楚。本研究旨在探

编译：微科盟花城，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

红景天属植物是一种可食用的药用植物，在亚洲和欧洲传统上被用作调节剂、补品、抗抑郁剂和消炎剂。然而，它对结肠炎是否有治疗作用尚不清楚。本研究旨在探讨红景天提取物（RCE）对DSS诱导的结肠炎小鼠的保护作用。RCE能明显减轻小鼠结肠的病理改变，包括相应增加结肠长度、减轻结肠损伤和减少致炎因子。保护作用与阳性对照5-氨基水杨酸相似。RCE通过上调紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达，抑制DSS诱导的肠上皮细胞凋亡，维持肠屏障功能。值得注意的是，RCE通过恢复肠道微生物的丰富度和多样性，减少变形杆菌门和机会致病菌Parasutterella和Staphylococcus的丰度，以及增加Lactobacillus和 Bifidobacterium中有益微生物的丰度，预防肠道菌群失调，与其对结肠炎的保护作用密切相关。同时，用UPLC-HR-MS对RCE进行了化学表征，以解释其物质基础。共鉴定出63个化合物，其中红景天苷含量为1.81%，红景天络塞维含量为0.034%。

论文ID

原名：The dietary supplement Rhodiola crenulata extract alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through anti-inflammation, mediating gut barrier integrity and reshaping the gut microbiome

译名：膳食补充剂红景天提取物通过抗感染、调节肠道屏障完整性和重塑肠道微生物群减轻DSS诱导的小鼠结肠炎

期刊：Food & Function

IF：5.396

发表时间：2021.2.25

通讯作者：王胜鹏&吴旭

通讯作者单位：澳门大学&西南医科大学

实验设计

结果

1 、红景天提取物定性分析

为了保证RCE的质量，提高实验的重现性，对RCE进行了定性分析。基于高分辨率UPLC-MS分析，根据准确的MS和MS/MS数据，并与参考文献或标准品（图1A和表1）进行比较，从RCE中快速鉴定出63种成分，这与以前的报告基本一致。据本文所知，之前的一项研究只鉴定了红景天提取物中的48种成分。这些成分包括黄酮类化合物、苄基和苯酚衍生物、苯丙烷类化合物、无环醇衍生物、有机酸和生物碱。

图 1 RCE 的化学成分分析与鉴定（A）经鉴定成分注释的UPLC-HR-MS中RCE的总离子色谱图（TIC）（B）RCE中的黄酮类化合物（C）RCE鉴定的苄基和苯酚衍生物（D）RCE鉴定的苯丙烷衍生物（E）RCE鉴定的无环醇衍生物、生物碱、有机酸等。

表1 UPLC-HR-MS法鉴定RCE中的化合物

共鉴定出12种黄酮类化合物（图1B），包括化合物14、28、29、31、35、37、38、42、48、51、52和54。化合物14在m/z为163、121和113处显示片段离子，鉴定为草质素，其中化合物28、35、52和54为化合物14的糖基化衍生物。化合物31（[M − H]⁻, C₁₅H₁₃O₆;error, −1.6 ppm），以儿茶素为标准，显示m/z 为245和125的碎片离子。儿茶素类似物包括化合物38（原花青素-2,3-O-没食子酸酯）和化合物42（表儿茶素-3-O-没食子酸酯）。化合物42经标准品进一步确证。化合物38为二聚原花青素，在m/z 441处有一特征性片段，对应表儿茶素-3-O-没食子酸残基。化合物49和51在m/z 285处显示相同的片段，表明其为山奈酚残基。因此，它们分别被鉴定为山莨菪碱 II和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的山奈酚衍生物。化合物37（芦丁； [M − H]⁻ , C₂₇H₂₉O₁₆）与对照品进行了确认。

从RCE中鉴定出苄基和苯酚衍生物（图1C），包括化合物2、7、8、10、11、13、18、19、27、33、43和62。化合物8经鉴定为没食子酸，其特征在于损失44 Da得到m/z 125处的片段。化合物2、33和62均为没食子酸衍生物。化合物7在m/z 125.0244处显示 [M − H]⁻ 离子，分子式为C₆H₅O₃，与邻苯三酚相同。同样，化合物11、18、19和27分别被鉴定为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、酪醇和对羟基苯乙酮，而化合物11和19则被对照品证实。化合物10分别在m/z 161和151处显示出与脱氧葡萄糖和乙酰羟基苯基残基对应的关键片段。经鉴定为胞苷B。化合物43在m/z 137处有一个特征离子，为乙酰基苯酚。化合物13与红景天苷对照品相同。

此外，对8种苯丙烷衍生物（图1D）进行了表征和鉴定，包括化合物22、30、32、34、36、39、40和53。化合物22、30、32、39和40被归类为肉桂醛衍生物，其与母体分子侧链上的烯丙醇基团共用一个苯环。化合物40经鉴定为红景天络塞维，并用对照品进行了确证。化合物22在7.05min时，在m/z 341.0878处显示分子离子[M − H]⁻。其m/z 179处的主要片段表明存在葡萄糖残基，m/z 135处的片段是由于脱氧葡萄糖残基和CO₂的损失所致。因此，它被鉴定为利诺卡菲因。根据MS和MS/MS数据，化合物30、32和39分别被鉴定为蔷薇素、红景天酸和香豆酸。此外，化合物34、36和53被鉴定为木质素衍生物。化合物34在m/z 315、327、345和477处显示关键片段离子。345 Da离子的存在表明葡萄糖残基丢失。m/z 477处的碎片是由CH₃OH的中性损失引起的。因此，它被确定为Clemastanin A。同样地，化合物36和53被鉴定为六氢-6-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-9-甲氧基-3,3-二甲基-萘酚[2,3-e][1,3]二氧西平-8-醇和异阿里辛醇9-氧基吡喃糖苷。

在RCE中还发现了化合物25、41、46、56、63等无环醇衍生物，其结构中至少有一个碳碳双键。化合物3、4、9、12、17和59为有机酸衍生物。化合物47、50、60和61进一步鉴定为生物碱。它们的结构如图1E所示

2、红景天提取物定量分析

作为本论文报道的代表性生物活性成分，采用UHPLC-QqQ-MS法对红景天中红景天苷和红景天络塞维的含量进行了定量分析。结果表明，RCE中红景天苷含量为1.81%，红景天络塞维含量为0.034%（w/w）。

红景天苷和红景天络塞维被认为是红景天属植物的重要生物标志物。在本研究中，在 RCE的水平相对较低，这与以前的报告基本一致。红景天苷和红景天络塞维的定量分析可能有助于区分这两种不同的红景天R. rosea和 R. crenulata。尽管已经证明，在红景天苷、草乙酸、红景天络塞维和熊果苷等研究化学品中，红景天络塞维对肠道辐射损伤的保护作用最强，但最近的一项研究表明，红景天苷可减轻小鼠结肠炎。结合这些发现，本研究中的化学分析可能支持红景天苷是红景天生物活性的主要成分之一。然而，还需要进一步的研究来筛选和评价其他有效组分或组分。

3、RCE对DSS诱导的小鼠结肠炎的保护作用

红景天是亚洲的一种珍贵物种，几千年来一直被用作饮食补充剂，以促进健康和缓解某些炎症疾病。据报道，红景天具有多种生物活性，如改善免疫系统、抗精神病、抗应激、抗疲劳、抗衰老、预防癌症等。在本研究中，探讨了红景天对DSS诱导的小鼠结肠炎的缓解作用。从DSS造模开始，探讨对小鼠进行红景天干预和治疗后的作用。红景天提取物可能对DSS诱导的结肠炎具有预防作用。

DSS诱导的小鼠急性结肠炎的建立如图2A所示。在结肠炎小鼠（DSS组）中，本文观察到结肠显著缩短（图2B和C）和结肠组织中更严重的组织病理学变化（图2D和E），显示出显著的结肠损伤，包括炎性细胞浸润增加、隐窝改变（变形，萎缩和分支）和粘膜增厚或脱落（图2D）。模型结肠轮廓变化与溃疡性结肠炎的临床表现相似。同时，模型结肠组织的组织病理学改变也与溃疡性结肠炎的显微描述相似。综上所述，证明了该动物模型的可行性。与DSS组相比，低、中或高剂量的RCE治疗以剂量依赖性方式（125、250和500 mg kg⁻¹）导致结肠长度增加，并且显示DSS诱导的结肠损伤减轻，显示组织病理学评分降低，尤其是在RCE-H组（图2B）。值得注意的是，随着剂量（ 125-500 mg kg⁻¹ ）的增加，与DSS组相比，RCE组的组织病理学评分逐渐接近正常组。关于这些组织学观察，中剂量和高剂量RCE的保护效果至少相当于或优于阳性对照5-ASA（100 mg kg⁻¹）（图2D和E）。结果表明，RCE对DSS诱导的结肠炎具有明显的保护作用。小鼠使用的RCE（125-500mg kg⁻¹）剂量是根据人和小鼠的物种差异来选择的，通常符合中国药典（2020版）推荐的成人临床使用量（每天3-9 g）。因此，每天补充RCE可以预防人类结肠炎。

图2 RCE对DSS诱导的结肠炎有保护作用（A）实验程序流程图（B）结肠形态（C）各组结肠长度（D）典型的H&E染色结肠切片（E）组织病理学评分。对照组；DSS，未经药物治疗的结肠炎小鼠；5-ASA治疗的结肠炎小鼠作为阳性对照；RCE，用低剂量RCE（125 mg/kg）治疗的结肠炎小鼠); RCE-M，中剂量RCE（250 mg/kg）治疗的结肠炎小鼠); RCE-H，大剂量RCE（500mg/kg）治疗的结肠炎小鼠)。结果显示为平均值（SD），每组n=10。 ^***p < 0.001,与对照组相比；^#p < 0.05, ^##p< 0.01, ^###p < 0.001，与DSS造模组相比。

4、RCE降低血清炎症因子水平

白细胞介素(IL)-1β是IBD发病机制中的一种重要细胞因子，已被证实在DSS诱导的小鼠结肠炎中靶向IL-6。DSS可诱导IL-1β和IL-6的产生。同时也能提高结肠炎小鼠的 TNF-α 水平。能够抑制这些炎症因子释放的抗炎药可能具有治疗潜力。本文的结果显示，低、中、高剂量的RCE治疗显著降低了DSS诱导的IL-1β（图3A）和IL-6（图3B）的血清水平升高。此外，经RCE治疗后，结肠炎小鼠结肠中TNF-α（图3C）、IL-1β（图3D）和IL-6（图3E）的基因表达显著降低。提示RCE对实验性结肠炎有抗炎作用。

图3 RCE减轻DSS引起的炎症和结肠损伤（A）血清IL-1β水平。（B）血清IL-6水平（C）TNF-α基因表达水平在结肠里（D）在结肠里IL-1β基因表达水平在结肠里（E）结肠IL-6基因表达水平（F）TUNEL染色结肠切片。棕色细胞代表凋亡细胞（红色箭头标记），蓝色细胞代表正常（G）用ImageJ软件计算TUNEL阳性细胞比例。结果显示为平均值（SD），每组n=5。^**p < 0.01，^***p < 0.001,与对照组相比；^#p < 0.05, ^##p< 0.01, ^###p < 0.001，与DSS造模组相比。

5、RCE抑制上皮细胞凋亡

虽然大肠上皮细胞凋亡被认为是溃疡性结肠炎的一种非特异性现象，但它参与了上皮防御系统的破坏和粘膜炎症，这一点不容忽视。有报道的动物实验表明，在DSS诱导的小鼠模型中也观察到上皮细胞凋亡。本文的模型与之前报道是一致的。如图3F和G所示，DSS组结肠中凋亡细胞的数量显著高于正常组，然后RCE以剂量依赖性方式显著减少。结果表明，RCE能抑制结肠上皮细胞凋亡，部分说明RCE能对抗肠功能损伤。

6、RCE维持肠道屏障功能，降低肠道通透性

上皮屏障功能受损是IBD病理生理学的共同特征，已成为共识。同时，上皮屏障功能的完整性是维持肠道通透性所必需的。有证据表明，肠道通透性的改变确实发生在溃疡性结肠炎。由ZO-1等支架蛋白和跨膜蛋白（occludin、连接粘附分子和claudins）组成的上皮细胞骨架在维持肠道粘膜屏障功能和调节肠道通透性方面起着重要作用。IHC法检测结肠组织中ZO-1和occludin的表达。如图4A-D所示，DSS诱导结肠切片中ZO-1和occludin的表达显著降低，而RCE处理显著上调DSS诱导的结肠炎小鼠结肠中ZO-1和occludin的表达。

LPS是一种大分子细菌内毒素，可作为肠道通透性的指标。在结肠炎模型中，由于小鼠的肠粘膜被破坏，大分子细菌产物LPS（据说很难进入血液循环）现在可以进入血液，从而导致免疫系统的长期刺激和肠道炎症。DSS治疗后，小鼠血清中的LPS水平显著升高（图4E）。然而，RCE治疗显著降低了DSS升高的小鼠血清LPS水平（图4E）。RCE可逆转DSS引起的ZO-1、occludin和LPS的变化，提示RCE至少可部分修复肠屏障功能。综上所述，RCE对DSS诱导的小鼠结肠炎具有明显的抗炎、抑制上皮细胞凋亡和维持肠道屏障功能的保护作用。

图 4 RCE对结肠炎小鼠肠道屏障功能和通透性的调节作用（A）IHC法检测ZO-1蛋白在结肠中的表达。细胞间棕黄色染色显示ZO-1阳性表达，细胞核呈蓝色（B）用ImageJ计算ZO-1阳性染色面积（C）IHC法检测结肠组织中occludin蛋白的表达。细胞间棕染为闭塞阳性，细胞核呈蓝色（D）用ImageJ计算Occludin阳性染色面积（E）小鼠血清LPS水平。结果显示为平均值（SD），每组n=5。^***p < 0.001, 与对照组相比；^#p < 0.05, ^##p < 0.01, ^###p< 0.001，与DSS造模组相比。

7、RCE缓解DSS引起的肠道失调

肠道微生物群与IBD密切相关。肠道微生物组成的改变已经与IBD有关。失调改变了肠道微生物群的组成及其代谢组。大量研究证明，在IBD患者的肠道内，肠道菌群结构经常发生变化，表现为有益菌明显减少，有害菌明显增多。因此，通过逆转肠道微生物群的结构来治疗结肠炎已成为潜在的辅助治疗方法之一。尽管存在争议，许多研究提出通过直接粪便移植治疗IBD。越来越多的研究调查了某些草药调节肠道菌群结构治疗IBD的疗效。如党参皂甙、含山药多糖和菊粉的复合多糖、松柏素、青黛、猴头菇菌丝体多糖等天然产物，溃结安灌肠剂能明显减轻DSS诱导的小鼠肠道菌群失调，减轻DSS诱导的结肠炎。在本文的微生物组分析中，共有2 032 782个高质量的16s rRNA片段，平均读取计数为52 122（范围38 894至62 955)。获得了10个门和428个OTUs。为了评估各组间微生物多样性的差异，对序列进行比对估计α和β多样性。DSS显著降低了Shannon（图5A）、Ace（图5B）和Chao（图5C）指数，表明细菌多样性和丰富度降低。RCE干预，尤其是高剂量的RCE干预，导致DSS处理小鼠的Shannon、Ace和Chao指数增加（图5A-C），这表明微生物多样性和丰富度恢复。此外，PLS-DA图显示，在前两个组分的基础上，RCE处理组与DSS或正常组分离（图5D）。因此，RCE可能减轻DSS诱导的微生物多样性改变。

门水平上微生物群落的变化如图5E所示。Proteobacteria细菌的丰度由0.05提高到0.05± 0.07%（控制）至0.39± 0.18%（DSS），RCE处理进一步降低至0.25%± 0.2%（RCE-L），0.29± 0.17%（RCE-M）和0.11± 0.04%（RCE-H）（图5F）。此外，DSS处理的小鼠表现出类杆菌/厚壁菌（B/F）比率下降的趋势，而高剂量RCE提高了结肠炎小鼠的B/F比率，但无统计学差异（图5G）。Proteobacteria细菌的增加被认为是IBD失调和风险的诊断标志。下调的B/F比值被认为是包括IBD在内的多种病理状况的一个指标。因此，这里的结果表明，RCE可以减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的肠道失调。

图5 RCE对结肠炎小鼠肠道微生物多样性和结构的调节作用（A）Shannon指数（B）Ace图（C）Chao指数（D）PLS-DA图（E）门水平上群落丰度的百分比（F）丰富的变形杆菌（G）类杆菌/厚壁菌（B/F）比率。结果显示为平均值（SD），每组n=7-8。^*p < 0.05，^***p < 0.001,与对照组相比；^#p < 0.05, ^##p< 0.01, ^###p < 0.001，与DSS造模组相比。

在属水平上，本文观察到微生物属的显著变化（图6A）。特别是9个属的相对丰度，包括Bacteroides (图6B)，Turicibacter (图6C)，Staphylococcus (图6D)，Prevotellaceae_UCG-001 (图6E)，Dubosiella (图6F)，Parasutterella (图6G)，Lactobacillus (图6H)，norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014 (图6I)和 Bifidobacterium (图6J)都在各组间有差异显著。DSS诱导的显著增加Bacteroides, Turicibacter,Staphylococcus, Prevotellaceae_UCG-001, Dubosiella, and Parasutterella, 减少了Lactobacillus andnorank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014 (图6B–I)。值得注意的是，在DSS诱导的结肠炎小鼠中，RCE治疗（RCE-L、RCE-M或RCE-H组）逆转了DSS介导的一些微生物变化，包括Staphylococcus,Prevotellaceae_UCG-001, Dubosiella, Parasutterella, Lactobacillus andnorank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014 (图6D–I)。DSS对双歧杆菌没有影响，但是在RCE-H组中观察到双歧杆菌显著升高（图6J）。

图6 属水平上的微生物变化。（A）属水平上群落丰度的条形图。相对丰度Bacteroides (B), Turicibacter(C), Staphylococcus (D), Prevotellaceae_UCG-001 (E), Dubosiella(F), Parasutterella (G), Lactobacillus (H), Clostridia_UCG-014(I)和 Bifidobacterium (J)。结果显示为平均值（SD），每组n=7-8。^*p < 0.05，^**p < 0.01，^***p < 0.001,与对照组相比；^#p < 0.05, ^##p< 0.01, ^###p < 0.001，与DSS造模组相比。

然后进行LEfSe以鉴定与RCE处理相关的特定微生物（图7）。Staphylococcus菌属的条件致病菌，如Staphylococcus_xylosus在DSS组中的比例较高，而一些潜在的有益微生物如Lactobacillus, Lactobacillus_murinus,Bacteroides_acidifaciens和Bacteroides_thetaiotaomicron在RCE-M和RCE-H组中的比例较高。

为了鉴定与RCE治疗结肠炎小鼠相关的特定微生物，进行了Spearman相关分析和db-RDA分析。斯皮尔曼相关热图（图7C）显示，较长的结肠与unclassified_f_Lachnospiraceae,Lactobacillus和norank_Muribaculaceae呈正相关，与Parasutterella和Staphylococcus呈负相关。较高的组织学评分和 TNF-α 、IL-6和IL-1β水平与Parasutterella, Bacteroides和Staphylococcus呈正相关，与unclassified_f_Lachnospiraceae,Lactobacillus, norank_Muribaculaceae或 Bifidobacterium呈负相关。

此外，db-RDA（图7D）结果表明，正常组小鼠与结肠长度增加呈正相关，而DSS诱导的结肠炎小鼠与炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和组织学评分增加以及Staphylococcus富集呈正相关。RCE治疗后的结肠炎小鼠的微生物组学向正常组小鼠的恢复，正常组小鼠富含Lactobacillus和Romboutsia。

图7 线性判别分析（LDA）结合效应大小（LEfSe）（A）各组间丰度差异（LDA评分>4）（B）分支图表明微生物群的系统发育分布与不同的类群相关。微生物与肠道形态或功能变化的综合相关网络分析（C）斯皮尔曼相关热图（D）基于距离的冗余分析（db-RDA）。结果显示为平均值（SD），每组n=7-8。 ^*p < 0.05，^***p < 0.01，^***p < 0.001,与对照组相比。

结论

综上所述，RCE对结肠炎小鼠肠道菌群的调节作用表现为：（1）恢复了细菌的丰富度和多样性（2）一些有益微生物的增加；部分机会致病菌减少。特别是在结肠炎小鼠中，蛋白质细菌门的丰度显著降低。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，RCE治疗逆转了DSS介导的一些微生物变化，包括Staphylococcus, Prevotellaceae_UCG-001, Dubosiella,Parasutterella, Lactobacillus和norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014。此外，DSS对Bifidobacterium没有抑制作用，RCE-H组Bifidobacterium明显升高。以前，Proteobacteria的增加被认为是IBD失调和风险的诊断标志。据报道，Lactobacillus和Bifidobacterium中的细菌一般被认为对肠炎和各种肠道疾病有益，广泛应用于肠道疾病的辅助治疗。Lactobacillus能减轻组织氧化损伤和肠道炎症损伤。相比之下，Staphylococcus被认为是有害的，它与多种感染性疾病有关，可以引起肠道疾病。Parasutterella是一种容易引起肠炎和败血症的细菌，也不利于肠道健康。本文还进行了LEfSe以鉴定参与RCE治疗的关键特异性微生物。一些潜在的有益微生物，如Lactobacillus, Lactobacillus_murinus, Bacteroides_acidifaciens和Bacteroides_thetaiotaomicron在RCE组富集。相关分析表明，RCE干预的肠道菌群结构的改变与其对DSS诱导的结肠炎的缓解作用密切相关。因此，RCE可以预防DSS诱导的小鼠失调。

IBD的发病机制尚不完全清楚。然而，饮食诱导的肠道微生物群的改变起着重要的作用。微生物组通过与宿主细胞沟通，防止病理性细菌粘附在肠壁上，产生营养物质或有益的代谢物，促进肠道健康。肠道微生物群的失调导致微生物多样性的丧失和有益细菌和有害细菌间平衡的破坏，从而导致肠道完整性的改变、细菌移位和促进炎症的代谢物（如LPS）的吸收。在目前的研究中，通过RCE缓解失调可能有助于减少炎症和维持肠道完整性，从而诱导对结肠炎的保护作用。

综上所述，本文证明RCE可能通过抗炎、维持肠道屏障功能、抑制细胞凋亡和调节肠道微生物群来减轻小鼠结肠炎。