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扬州大学 | Nat. Microbiol.：高脂饮食喂养小鼠肠道菌群的改变与抗生素耐受性相关

2021

08/16

微生态

A-

A+

抗生素耐受性是一种典型的易感微生物在长期暴露于抗生素下生存的能力，在慢性和复发性细菌感染中起着关键作用，并促进抗生素耐药性的演变。

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

抗生素耐受性是一种典型的易感微生物在长期暴露于抗生素下生存的能力，在慢性和复发性细菌感染中起着关键作用，并促进抗生素耐药性的演变。然而，促进抗生素耐受性发展的在体内生理因素，尚不完全清楚。尽管高脂饮食（HFD）与多种人类疾病有关，但HFD与抗生素处理之间的关系仍知之甚少。在本研究中，作者评估了多种临床相关抗生素对感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）或大肠杆菌的HFD喂养小鼠的影响。作者发现，与标准饮食喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠具有更高的细菌量，这些细菌对抗生素处理的敏感性较低，而无菌标准饮食或HFD喂养的小鼠表现出类似的敏感性。HFD喂养小鼠的粪便微生物群移植损害了标准饮食喂养小鼠的抗生素活性，表明HFD喂养小鼠肠道微生物群和相关代谢物的改变可能是抗生素活性降低的原因。粪便样本的16S rRNA测序和代谢组学分析显示HFD喂养小鼠的微生物多样性和差异代谢谱降低。值得注意的是，色氨酸代谢物吲哚-3-乙酸（IAA）在HFD喂养的小鼠中显著降低。进一步的体外研究表明，添加IAA可抑制细菌持久性物质的形成，并通过激活细菌代谢途径促进持久性物质的清除。在体内，IAA和环丙沙星联合使用可提高感染MRSA持久性的HFD小鼠的存活率。总的来说，本研究的数据显示HFD对小鼠模型中的抗生素处理有拮抗作用，这与肠道微生物群和IAA产生的改变有关。在本研究中，作者研究了抗生素对标准饮食和HFD喂养小鼠多种病原体的杀灭作用。有趣的是，发现HFD降低了小鼠感染模型的抗生素处理，这进一步证明与肠道微生物群和相关代谢物组成的变化有关。此外，本研究的数据显示，小鼠HFD影响IAA的生物合成，IAA可能通过激活细菌代谢而抑制和消灭耐受细胞。总之，本研究结果表明，长期HFD通过改变肠道微生物群的组成和多样性而损害抗生素的疗效。

论文ID

原名：Gut microbiome alterations in high-fat-diet-fed mice are associated with antibiotic tolerance

译名：高脂饮食喂养小鼠肠道菌群的改变与抗生素耐受性相关

期刊：Nature Microbiology

IF：17.745

发表时间：2021.5.20

通讯作者：刘源&王志强

通讯作者单位：扬州大学兽医学院

实验设计

结果

1 HFD损害抗生素的疗效

为了探讨HFD与体内抗生素处理的相关性，我们通过长期喂饲高脂饲料建立了肥胖小鼠模型。喂食7周后，喂食HFD的小鼠的平均体重开始显著高于喂食标准饮食的小鼠（图1a）。64天喂养后，采用油红O染色法（Oil Red O staining）测定了体重、脏器病理学特征及血清生化指标。与正常饮食组相比，HFD组小鼠体重显著增加（P <0.0001；图1b）。此外，从喂食HFD的小鼠身上采集的所有器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏，都显示出大量的脂质积聚（图1c和附图1）。同时，HFD喂养的小鼠血清中的甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）水平显著升高（附图2）。这些结果证实，长期HFD可引起小鼠体内脂质积聚和体重增加，这与以往关于HFD对小鼠生理影响的研究是一致的。

图1.HFD降低小鼠模型中抗生素的效力。a、喂食标准饮食或HFD后小鼠体重的动态变化。每组n = 10只独立的动物。b、用标准饮食或HFD喂养64天以后小鼠体重的增加量。每组n = 10只独立的动物。c、油红O染色(×200）的肝脏。比例尺：100 μm。器官中的脂质被染成红色。实验独立重复了三次，其结果一致。d、评估环丙沙星（CIP）对喂食标准饮食或HFD并感染四种细菌的小鼠处理的实验方案。e、HFD对环丙沙星体内对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀灭作用。每组n = 6只独立的动物。CD-1雌性小鼠用标准饮食或HFD喂养64天，用非致死剂量的四种细菌（10⁷个菌落形成单位（cfu）/只小鼠）进行腹腔感染，并用单次灌胃剂量的环丙沙星（1 mg kg⁻¹S. aureus ATCC 29213，0.5 mg kg⁻¹，0.5 mg kg⁻¹ E. coli ATCC 25922, 20 mg kg⁻¹ MRSA T144，100 mg kg⁻¹ E. coli B2）或PBS作为对照组。那么，感染24 h后，处死小鼠，计算环丙沙星处理前后肺c.f.u.的减少。黑色虚线表示c.f.u.没有减少。f、评估四种抗生素对喂食标准饮食或HFD并感染MRSA T144的小鼠的处理的实验方案。g、HFD对不同种类抗生素对MRSA T144在体抗菌活性的影响。n = 每组6只独立的动物。CD-1雌性小鼠用标准饮食或HFD喂养64天用非致死剂量的MRSA T144（每只小鼠10⁷cfu）腹腔感染，并用单次灌胃剂量的4种抗生素（80%）处理 mg kg⁻¹氨苄西林，100 mg kg⁻¹卡那霉素，80 mg kg⁻¹多西环素和5 mg kg⁻¹万古霉素）或PBS作为对照组。感染24 h后，对小鼠实施安乐死，并计算在没有和存在抗生素处理的情况下肺部 cfu 的减少量。黑色虚线表示cfu没有减少。在e和g中，log₁₀转化了cfu在24小时时减少小鼠肺部的细菌量， y轴上显示了在进行和没进行抗生素处理的情况下感染。显示的数据是平均值 ± 标准差.（a和b）或中位数（e和g）。采用Student’s t-tests检验（a和b）或Sidak多重比较检验（e和g）的双向方差分析（ANOVA）确定P值。NS：不显著。

在检测HFD对抗生素处理的影响之前，HFD对两种病原体MRSA T144（革兰氏阳性细菌）和大肠杆菌B2（革兰氏阴性细菌）在感染2或24小时小鼠器官中定植的影响进行了评估。有趣的是，分析显示标准饮食组和HFD喂养组之间MRSA T144的量没有显著变化（附加数据图1a），而HFD稍微增加了E. coli B2感染，特别是在小鼠的脾脏和肺部（附加数据图1b），这结果与先前的研究报道一致，也就是说将小鼠喂食HFD可以促进E. coli肠道定植。接下来，利用这种肥胖小鼠模型，通过测量在存/不存在抗生素处理的情况下器官中细菌量的减少来研究HFD对抗生素的体内处理的潜在影响，这样可以避免细菌定植差异的影响。我们首先在标准饮食和HFD喂养的小鼠中评估了环丙沙星对四种病原体的处理（图1d），包括两种革兰氏阳性细菌（S. aureusATCC 29213和MRSA T144）和两种革兰氏阴性菌（E. coli ATCC 25922和E. coli B2）。如图1e所示，我们发现，单次灌胃环丙沙星处理后，HFD喂养的小鼠肺中四种菌株的细菌减少率显著低于标准饮食喂养的小鼠(使−log₁₀ cfu减少>1），表明在HFD喂养的小鼠感染模型中，环丙沙星的处理降低。

为了评估这一现象是否与抗生素给药途径有关，我们还使用单次腹腔注射（i.p.）剂量的环丙沙星来处理MRSA T144引起的感染。有趣的是，观察到了类似的结果。喂食HFD的小鼠对i.p.环丙沙星处理的易感性较低（附加数据图2）。为了进一步确定这种现象是否普遍存在于具有不同作用模式的其他类别的抗生素中，我们应用了四种临床相关抗生素，包括氨苄西林、卡那霉素、多西环素和万古霉素，来处理标准饮食或HFD喂养的小鼠中MRSA-T144诱导的感染（图1f）。与上述结果一致的是，我们观察到了除多西环素外，HFD喂养组对MRSA T144的抗生素处理减弱（图1g）。与其他三种抗生素相比，多西环素是一种抑菌抗生素，它能特异性结合核糖体的30S亚基，从而抑制蛋白质合成。这些数据表明，HFD损害了小鼠腹膜炎模型中抗生素的活性（附图3a）。

2 HFD对小鼠肠道菌群组成的影响

为了研究潜在的作用机制，我们首先假设HFD喂养的小鼠可能有较差的抗生素吸收动力学或抗生素渗透作用。为了验证这一假设，我们在给老鼠单次灌胃环丙沙星（20 mg kg⁻¹）后进行了药代动力学实验。在不同时间点测定血浆和器官（肺、肝和肾）中的药物浓度。然而，在标准饮食和HFD喂养的小鼠中观察到类似的环丙沙星浓度-时间曲线（图2a）。相比之下，喂食HFD的小鼠与喂食标准饮食的小鼠相比，血浆浓度-时间曲线（AUC）下的面积更大（附表3），表明喂食HFD的小鼠中环丙沙星的生物利用度更高。这些数据表明，HFD喂养的小鼠体内抗生素活性的降低与药物的药代动力学无关。

图2.抗生素处理受损与药物药代动力学无关，但与肠道微生物群相关。a、环丙沙星在标准饮食和HFD喂养小鼠体内的药代动力学特征。64天后的CD-1雌性小鼠标准饮食喂养组和HFD组给予单次灌胃剂量环丙沙星（20 mg kg⁻¹），24 h内收集血浆、肺、肝和肾样本（每个时间点有4只或6只生物学上独立的动物）。使用LC–MS/MS分析样品中的环丙沙星含量，并使用曲线下面积与标准品浓度的线性回归建立的标准曲线计算了对应的浓度。数据是平均值 ± 标准差。b，标准饮食和HFD喂养小鼠的微生物群消耗方案；每组 6只独立的动物；ABX：抗生素混合物。c、初始喂养的微生物群减少（i）而不是感染前5d（ii）抵消了标准饮食或HFD对环丙沙星活性的影响。每组n = 6只独立的动物。横条代表中间带。P值采用Sidak多重比较检验的双因素方差分析。d、喂食HFD小鼠粪便微生物移植的实验方案。每组n =12只独立动物。行的长度不反映持续时间。Trans：移植。e、用HFD喂养的小鼠进行微生物移植后，标准饮食喂养的小鼠肺部MRSA T144的细菌减少率较低。CD-1雌性小鼠（每组n =12只独立的动物）用非致死剂量的MRSA T144（每只小鼠10⁷ cfu）感染，并用单次灌胃剂量的环丙沙星（20 mg kg⁻¹）在感染后2 h检测。横条代表中间带。采用非配对双尾Student’s t-test检验计算了P值。f、在感染致死剂量MRSA T144（7.5%）的小鼠腹膜炎模型中，微生物群移植小鼠的存活率较低 × 每只小鼠108立方英尺），然后用单次灌胃剂量的环丙沙星（100 mg kg⁻¹）在感染后2h检测。每组12只独立动物。采用双侧对数秩（Mantel-Cox）检验计算了P值。

以前已有报道，肠道微生物群参与了一系列人类代谢疾病，如肥胖和2型糖尿病。此外，最近的一项研究表明，低纤维饮食加重了微生物群的崩溃，延缓了抗生素处理后的恢复。根据这些例子，我们认为HFD可能改变小鼠的肠道菌群。为了检验肠道微生物群是否在这一过程中起着关键作用，我们尝试从一开始就通过饮用含抗生素混合物的水来消耗两组小鼠的肠道微生物群。同样，在这些无菌小鼠中，HFD也显著提高了小鼠体重和TG、CHOL、HDL和LDL水平，表明微生物群的缺乏对肥胖小鼠模型的构建几乎没有影响（附加数据图3a-c）。有趣的是，我们发现，与野生型小鼠相比，无菌小鼠体重增加更高，标准饮食组和HFD喂养组的平均体重增加分别为11.9%和8.12%（附加数据图3b）。这一发现意味着长期接触抗生素与体重增加之间存在潜在的相关性，这在之前的几项研究中得到了部分证明。同时，我们观察到，在微生物群缺失的小鼠中，MRSA的定植能力略低于野生型小鼠，这可能是由于缺乏来自肠道微生物群的关键营养素所致，值得在今后的研究中进一步研究。然而，在这些无菌小鼠中，标准饮食组和HFD喂养组在24小时内仍然显示出相似的MRSA T144感染（附加数据图3d）。

随后，我们测定了单次灌胃环丙沙星处理后，MRSA T144在无菌小鼠肺中的细菌量减少。有趣的是，我们发现两组小鼠的肺部细菌c.f.u的减少程度相似，表明HFD的作用被完全抵消（图2b和附图3b）。此外，这一发现暗示HFD诱导的小鼠肠道微生物群落的改变可能介导了抗生素处理的丧失。然而，在感染前5 天不能有效逆转这一过程（P = 0.002；图2c和附图3c），表明肠道微生物群的变化不是直接原因。基于这些结果，我们推测HFD喂养后肠道内特定代谢物的积累或缺乏可能是抗生素处理下降的直接原因。

为了验证这一假设，一组小鼠连续给予HFD饮食小鼠的粪便提取物，而另一组小鼠给予蒸馏水作为对照（图2d）。两组小鼠均以标准饮食喂养。与先前的报告一致是，HFD饮食小鼠的微生物群移植导致喂食标准饮食的小鼠体重显著增加，且TG、CHOL、HDL和LDL水平增加（附加数据图4a，b）。此外，在两组小鼠中观察到感染后24小时MRSA T144负荷无明显差异（附加数据图4c）。重要的是，我们发现移植HFD喂养小鼠的肠道微生物群显著影响了抗生素的处理，包括降低了细菌量（P <0.0001），小鼠存活率较低（P = 0.0352），与对照组比较（图2e、f和附图3d）。综上所述，我们得出结论，长期喂食HFD小鼠会导致肠道微生物群的改变，并随后改变某些特定代谢物的水平，因此降低了抗生素对小鼠模型中细菌感染的处理。

为了深入了解HFD降低抗生素活性的潜在机制，我们进行了微生物群分析，以比较标准饮食组和HFD喂养组的肠道微生物群组成。粪便微生物群的16S核糖体RNA（rRNA）基因分析表明，喂食标准饲料的小鼠的细菌组成主要由Bacteroidaceae和阿克曼氏菌科组成，但缺乏鞭毛虫科和鼠杆菌科。相比之下，喂食HFD小鼠的肠道微生物群主要由属于鞭毛虫科和鼠杆菌科的操作分类单位（OTU）控制，而属于Bacteroidaceae和Akkermansiaceae的OTU较少（图3a）。拟杆菌门是一个表型多样的革兰氏阴性和专性厌氧菌群，构成胃肠道正常菌群的主要部分。Akkermansiaceae属于Verrucomicrobia门，只有一个成员称为Akkermansia muciniphila。A. muciniphila能降解粘液蛋白，是人体肠道微生物群中一个丰度高的成员。与我们在HFD喂养的小鼠中发现的Akkermansiaceae丰度下降一致，先前的研究表明，肠道中的A. muciniphila对饮食诱导的肥胖有保护作用。嗜粘液性与促进伤口愈合、诱导抗肿瘤反应和肠道适应性免疫反应有关。接下来，我们用Shannon指数和Chao指数比较了两组之间的肠道微生物多样性。有趣的是，与标准饮食喂养小鼠的肠道微生物多样性相比，HFD喂养小鼠的肠道微生物多样性显著下降（图3b，c）。这些结果表明，长期喂食HFD小鼠确实会降低肠道微生物群的多样性，特别是某些共生细菌：如拟杆菌科和Akkermansiaceae。

图3.微生物多样性和代谢组学分析显示HFD喂养小鼠肠道微生物群和代谢物的改变。a、标准饮食或HFD喂养小鼠粪便样本中OTU的相对丰度。每组3只独立的动物。这些颜色代表微生物群落。b、c、Shannon（b）和Chao多样性（c）标准饮食或HFD喂养小鼠粪便样本的丰度高度指数。每组3只独立的动物。数据是平均值 ± 标准差、采用非配对双尾t检验计算了P值。d、标准饮食（S）或HFD喂养（H）小鼠粪便样本中前30位代谢物的热图分析。每组n = 6只独立的动物。热图中的每一列代表一个样品，每一行代表一种代谢物。颜色表示样品组中代谢物的相对丰度，颜色梯度和值之间的对应关系显示在梯度色块中。左侧显示代谢物聚类树。分支之间的距离显示代谢物表达模式的接近性。右侧显示了预测值（VIP）中代谢物变量的重要性，该值表示代谢物对两组间差异的贡献。默认值设置为不小于1。值越大表示两组之间的代谢物组成差异越大。条带颜色表示两组间代谢物的统计显著性（P值）。P值越小，颜色越深。采用双侧Fisher精确检验和Benjamini-Hochberg修正法计算P值**P <0.01，***P <0.001。IAA被标为红色。e、基于显著改变的代谢物的KEGG途径富集分析。左侧显示每个KEGG路径的名称，右侧显示相应的P值。代谢途径（橙色），生物系统（红色）和药物开发（紫色）被强调。P值采用双侧Fisher精确检验和Benjamini–Hochberg校正进行多次检验。f、人类代谢组数据库具有不同代谢物的化合物分类。饼图中的每种颜色代表不同的人类代谢组数据库分类，其面积代表分类中代谢物的相对比例。这一类中显著改变的代谢物的总数量在括号中显示，相应的比例在括号中显示。

3 肠道微生物群的改变降低了IAA的水平

结果已经表明HFD影响了特定肠道微生物群的丰度，接下来我们试图研究微生物变化引起的细菌衍生代谢物的改变。为此，我们对标准饮食和HFD喂养的小鼠64天后的粪便样本进行了非靶向代谢组学分析（附加数据图5）。代谢组学分析显示，数千种肠道代谢物的含量存在显著差异（附加数据图6a，b）。例如，一系列与胆汁酸有关的化合物，如脱氧胆酸（一种重要的胆汁酸）α-在标准饮食或HFD喂养的小鼠中均检测到脱氢产物（附表4），其在脂质吸收中起着重要的媒介作用。图3d和附表5列出了前30种代谢物，包括17种下调代谢物和13种上调代谢物，并进行了聚类分析。KEGG途径分析表明，这些差异代谢物主要集中在与有机酸相关的代谢，包括胆汁酸生物合成，α-亚麻酸和花生四烯酸代谢，以及色氨酸代谢（图3e）。与此一致，差异代谢物的分类显示52.94%的化合物是脂质和类脂分子，12.16%是有机杂环化合物，12.16%是有机酸及其衍生物（图3f）。因此，我们进一步分析了有机杂环酸与显著不同的水平之间的两组。有趣的是，我们发现喂食HFD的小鼠体内IAA的含量明显低于喂食标准饮食的小鼠。为了描述IAA的动态变化，我们测定了标准饮食或HFD喂养小鼠的粪便中IAA的水平用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析法测定。与代谢组学分析结果一致的是，喂食HFD小鼠的IAA浓度在5天后显著降低（附加数据图7a）。同样，喂食9周后，HFD喂养小鼠的血清和肺组织中的IAA含量也低于标准饮食喂养小鼠（附加数据图7b，c）。据报道，Bacteroides spp.和Clostridium spp.是IAA36的主要产生菌，可通过色氨酸2-单加氧酶和碘乙酰胺水解酶37的作用将色氨酸转化为IAA。因此，IAA含量的降低可能归因于HFD喂养的小鼠体内类杆菌数量的减少。总之，我们得出结论，喂食HFD小鼠可能影响色氨酸代谢并破坏IAA的生物合成（附加数据图7d），因此导致抗生素活性受损。同时，这些发现也暗示，补充IAA可能通过特定的作用方式提高抗生素的活性。

4 IAA促进细菌代谢并阻止抗生素耐受

在证明IAA可能在抗生素的杀灭中有一个以前未被重视的作用之后，我们接下来开始阐明其潜在的作用模式。首先，我们用棋盘格法测试了IAA和抗生素之间的药物-药物相互作用。结果表明，对MRSA T144和E. coli B2的作用来说，IAA与氨苄西林的协同作用弱于环丙沙星（附加数据图8），表明IAA与某些特定抗生素产生协同作用。然而，这种特殊的相互作用并不能解释IAA与抗生素在体内广谱的增强作用。结合从标准饮食或HFD喂养的小鼠中分离的细菌在体外MIC分析中显示出相同的抗生素敏感性的结果（附表6），我们假设小鼠中的HFD可能触发抗生素耐受的形成，描述这些表型耐受细菌的一种生物学现象，但没有增加MIC值和遗传变化，如获得抗性基因，而标准饮食喂养的小鼠产生的IAA可以抑制类似的变化。为了验证这一假设，我们评估了IAA对MRSA T144培养16小时后持续存在形成的影响。正如预期的那样，补充IAA显著降低了持久性的百分比（图4a）。此外，我们发现添加IAA可有效地提高环丙沙星的活性，从而以剂量依赖性的方式根除持久性疾病（图4b）。

图4.IAA通过激活细菌代谢潜在地提高抗生素处理。a、MRSAT144持久性菌株的形成的分析（a）和环丙沙星在清除MRSA T144持久性菌株中的活性（b）在IAA浓度从0增加到100 mM的情况下。数值为：平均值 ± 标准差，来自两到三个生物重复。P值采用非参数单因素方差分析进行计算。20天时MRSA T144持续存在的平均百分比如a所示。MRSA T144在MHB和MHB+IAA培养过程中DEGs如a. c–f所示、火山图（c和e）和KEGG路径（d和f）。在c和d中，起始给IAA。在e和f组，在12小时的时间点补充IAA h。通过基因表达水平分析确定DEGs的P值≤0.05和FC值≥2（log₂-transformed FC ≥ 1或log₂-transformed FC≤ −1），并用c和e中的两条垂直黑线和一条水平黑线加以区分。显著上调和下调的基因分别以红色和蓝色显示。转录无明显变化（nosig）的基因以灰色显示。相关路径中的DEG数量显示在d和f中。g、h、细胞内ATP水平（g）和ROS生成（h）在存、不存在IAA（50 mM）的情况下MRSA T144中的变化。在ATP水平分析中，MRSA T144持续细胞与不同浓度的环丙沙星和/或IAA（50 mM）。1 h时间点，收集细菌沉淀物并用溶菌酶溶解，然后制备上清液，用萤火虫荧光素酶测定细胞内ATP水平。单用环丙沙星或联合IAA处理MRSA T144耐药细胞后总ROS的产生（50 使用荧光探针（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），10 µM）。孵育1 h后，立即测定荧光强度，激发波长为488 和525 nm 。数据是平均值 ±标准差、三个生物学重复。P值采用非配对双尾t检验。i、标准饲料喂养小鼠的存活率（每组n = 10只独立的动物）感染致死剂量的MRSA T144持久性悬浮液（每只小鼠1.5 × 10⁹ cfu，并通过单次灌胃剂量的环丙沙星（100 mg kg⁻¹）在2点感染后1h。在7天内监测小鼠存活率。采用双侧对数秩（Mantel-Cox）检验计算了P值。j、HFD喂养小鼠的存活率（每组n = 10只独立的动物）感染致死剂量的MRSA T144持久性悬浮液（每只小鼠1.5 × 10⁹cfu，并通过单次灌胃剂量的单独环丙沙星（100 mg kg⁻¹），IAA（100 mg kg⁻¹）和环丙沙星联合IAA（100 + 100 mg kg⁻¹）在感染后1h 取了2个点。在7 d内监测小鼠存活率。采用双侧对数秩（Mantel-Cox）检验计算了P值。

为了从机制上理解IAA如何影响耐药细胞的形成，我们对IAA（100 mM）处理后的MRSA T144在16 h培养过程中的12 个时间点进行了转录组分析。结果，我们发现初始的IAA补充导致269个上调的（DEG）和268个下调的DEG差异表达基因（图4c）。磷酸特异性转运（Pst）系统相关基因pstA（log₂[fold change (FC)] = 3.76）和pstC（log₂[FC] = 4.84），表明IAA诱导磷酸转运增加。值得注意的是，lukH（log₂[FC] = −3.33）和RS01795（log₂[FC] = −3.52）基因，编码两个重要的毒力因子，金黄色葡萄球菌的杀白细胞素和溶细胞素分别显著下调。这一结果表明，补充IAA也可能抑制S. aureus毒素的产生。此外，12天时补充IAA h导致162个上调DEGs和164个下调DEGs（图4e）。重要的是，多个ATP依赖蛋白编码基因的表达显著上调，如：vraD vraE（log₂[FC] = 3.63和3.18）；而硝酸还原酶基因（qoxB 和qoxD, log₂[FC] = −1.04 和 −1.08）和DNA修复蛋白基因（recN, log₂[FC] = −1.15）的表达水平显著下调。KEGG富集分析表明，两种IAA处理的DEG参与一些共同的途径，包括：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、ABC转运蛋白、双组分系统和生物素代谢（图4d，f）。这些结果表明，IAA可能影响细菌代谢，特别是氨基酸和能量代谢（附加数据图9）。

早期的研究报道，细菌代谢的减少与抗生素耐受性的形成有关。因此，我们推断IAA可能促进细菌代谢和能量补充。为了验证这一假设，我们评估了MRSA T144患者在增加IAA、环丙沙星单独或两者联合处理后的细胞内ATP和活性氧（ROS）水平。值得注意的是，我们发现在环丙沙星存/不存在的情况下，补充IAA显著促进ATP（图4g和附加数据图10a）和ROS（图4h和附加数据图10b）的产生，且这个过程呈剂量依赖性。这些结果表明IAA可以通过触发ATP的产生，将耐受细胞转化为代谢活性细胞。此外，IAA的加入诱导ROS的过度生成，而这已被证明对抗生素的活性至关重要。相反，抑菌抗生素的活性与细菌的代谢状态和ROS的产生无关，这解释了IAA与多西环素联合使用缺乏增强作用。

为了进一步验证IAA对体内抗生素活性的增强作用，我们构建了小鼠腹膜炎保护模型，用MRSA T144持续感染，然后在感染后2 h用环丙沙星处理。如图4i所示，我们发现单次给药环丙沙星（100 mg kg⁻¹）在7周内显著提高了标准饮食喂养小鼠的存活率（P = 0.0014)。然而，相同剂量的环丙沙星单独使用并不能显著提高HFD喂养小鼠的存活率（P = 0.058；图4j）。有趣的是，环丙沙星和IAA的共同处理（100 + 100 mg kg⁻¹）获得了更好的处理效果，HFD喂养的小鼠存活率为75%。相比之下，单独使用IAA（100 mg kg⁻¹）没有任何处理潜力（图4j）。综上所述，这些结果突出表明，标准饮食喂养的小鼠体内产生的IAA在体内协助抑制和根除抗生素耐受性细菌方面具有潜在的作用。

讨论

人们越来越认识到，抗生素耐受性在细菌感染的高负担和许多临床抗生素处理失败中起着至关重要的作用。例如，不生长或生长缓慢的细菌抗生素处理后得以存活。一些细菌的生理反应也表明，赋予抗生素耐受性的细菌。例如，通过减少促氧化代谢物的产生和提高抗氧化防御能力，主动饥饿信号严格反应导致生物膜和营养有限细菌的抗生素耐受。此外，硫化氢（H₂S）减轻了抗生素引起的氧化应激，从而提供了对抗抗生素杀死细菌的普遍防御。尽管如此，哺乳动物的社会行为如高脂肪饮食生活方式与抗生素耐受性的形成之间的关系仍然是未知的。

这项研究的结果表明，HFD通过改变肠道微生物群的组成，包括减少的Bacteroidaceae和Akkermansiaceae的丰度，并进一步降低肠道中IAA的水平，从而促进抗生素耐受性的形成。Bacteroidaceae是一种重要的共生菌，其数量的减少可能是IAA水平降低的原因。然而，Akkermansiaceae的丰度与IAA含量之间的相关性仍然不清楚。此外，Akkermansiaceae在肠道免疫反应中的有益作用也可能在对抗感染方面提供辅助作用。此外，HFD喂养的小鼠体内IAA的减少可能还归因于某些肠道微生物群的增加，如Lachnospiraceae和Muribaculaceae，加速了吲哚或其衍生物的代谢。因此，需要进行更多的研究来解释IAA水平变化背后的具体机制。

最重要的是，我们发现通过改变HFD喂养小鼠的肠道微生物群而引起的IAA减少是导致细菌对抗生素杀灭敏感性降低的重要原因之一。IAA是一种天然存在的植物激素，因其在植物生长发育中的作用而闻名。它通常在动物粪便中检测到，并由人类共生细菌（如类杆菌）和人类病原体（如艰难梭菌、鼠伤寒沙门氏菌和结核分枝杆菌）产生。此外，IAA也是一种调节光反应的植物激素。由于这一特点，它最近被作为光动力疗法痤疮光敏剂，具有减少皮脂，抗炎和抗菌作用。此外， IAA通过AHR依赖的途径减弱了小鼠细胞的促炎细胞因子反应。关于IAA的安全性，一些研究已经调查了其在小鼠和大鼠体内的致畸潜力；然而，他们发现IAA在这两个物种中都不会引起胎儿的再吸收，并且在低于500 mg kg⁻¹的剂量水平下也不会致畸。这些发现表明，补充IAA是逆转HFD引起的小鼠抗生素耐受性的安全方案。另一种减轻HFD引起的抗生素耐受性的预防策略是对抗HFD对肠道微生物群的影响。例如，研究表明，同时给予褪黑素可减轻脂质积聚，并逆转HFD19诱导的肠道菌群失调。研究褪黑素在逆转HFD介导的抗生素耐受中的潜在生物学功能是很有意义的。

总之，我们的研究：表明长期喂食HFD小鼠可降低细菌对抗生素的敏感性。HFD对小鼠抗生素耐受性的影响与肠道微生物群的改变和微生物群衍生代谢物IAA水平的降低有关。IAA可激活细菌代谢，使耐受性病原体对抗生素杀灭再敏感。我们的研究结果不仅揭示了HFD在处理细菌感染中的潜在危害和风险，而且提示细菌代谢调节因子可以作为潜在的抗生素佐剂来处理由耐受性病原体引起的顽固性感染。