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郑大一附院 | Gut：COVID-19患者口腔和肠道微生物组学及脂质组学的改变

2021-08-15 19:29

COVID-19在全球范围内迅速传播，导致1亿多人感染，200多万人死亡。

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

COVID-19在全球范围内迅速传播，导致1亿多人感染，200多万人死亡。然而，作为诊断COVID-19的黄金标准，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）核酸检测因假阴性率至少为20%而受到质疑。因此，迫切需要寻找一种新的诊断方法。ACE2是SARS-CoV-24的靶点，在肺、肝、肾、脑和小肠上皮中表达。SARS-CoV-2激活肠道ACE2受体，引起炎症、胃肠道症状和微生物群失调。本研究的目的是：描述活性COVID-19患者和康复患者的口腔微生物群、肠道微生物群和血脂谱；评估微生物组作为COVID-19非侵入性生物标志物的潜力；并探讨微生物组与脂质谱之间的相关性。本研究的设计思路是：对我国中部和东部地区392份舌苔标本、172份粪便标本和155份血清标本进行测序。作者对华东地区74例确诊患者（confirmed patients ，CPs）和37例IgG阳性的疑似患者（suspected patients，SPs）进行了微生物组和脂质分子的特征分析，构建了发现队列中的微生物分类器，并验证了它们的诊断潜力。研究结果发现，与健康对照组（HCs）相比，CPs组口腔和粪便微生物多样性显著降低。与HCs相比，口腔CPs中丁酸产生菌减少，脂多糖产生菌增多。基于8种最佳口腔微生物标志物（7种粪便微生物标志物）的分类器在不同人群中取得了良好的诊断效果。重要的是，在跨地区队列中，诊断有效率达到87.24%。同时，成功地将IgG抗体阳性的SPs诊断为CPs，诊断有效率达92.11%（占粪便菌群的98.01%）。与CPs相比，47个脂质分子，包括鞘磷脂（SM）（d40:4）、SM（d38:5）和单甘油酯（33:5），以及122个脂质分子，包括磷脂酰胆碱（36:4p）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16:0p/20:5）和甘油二酯（20:1/18:2），在确诊的患者恢复中富集。总而言之，本研究首次描述了COVID-19患者的口腔微生物群以及康复患者的口腔微生物群和脂质变化，探讨了它们之间的相关性，并报道了COVID-19诊断模型的成功建立和验证。

论文ID

原名： Alterations in the human oral and gut microbiomes and lipidomics in COVID-19

译名：COVID-19患者口腔和肠道微生物组学及脂质组学的改变

期刊：Gut

IF：23.059

发表时间：2021.06.07

通讯作者：任志刚，余祖江，李兰娟

通讯作者单位：中国郑州大学附属第一医院传染病学系；浙江大学医学院附属第一医院传染病诊断与治疗国家重点实验室

实验设计

实验设计总线路图如图1所示。本研究中首先是前瞻性收集了我国中部和东部地区3种类型的957份样品，其中舌苔样品496份，粪便样品226份，血清样品235份。经过严格的收集和排除标准，共选择719份样本进行进一步分析，其中舌苔样本392份（自河南的72 CPs, 37 SPs, 22 CPRs, 37 SPRs和150 HCs ；自杭州的74 CPs），粪便样本172份（自河南的36 CPs, 23 SPs, 18 CPRs, 23 SPRs及 72 HCs），血清样本155份（73 CPs, 30 SPs, 22 CPRs和30 SPRs）。用16S rRNA-MiSeq对口腔和粪便样本进行测序，以表征微生物组并构建诊断模型，用UPLC-MS检测血清样本以表征脂质分子。HCs：健康对照组；CPs：确诊患者；SPs：疑似患者；CPRs：确认后康复的病人；RFC随机森林分类器；SPRs，疑似康复患者；UPLC-MS：超高效液相色谱-质谱法。

图1.实验设计

表1口腔和粪便发现队列参与者的临床特征。

连续变量表示为均值（SD）或中位数（IQR）。分类变量以百分比表示。使用Student’s t检验（正常连续变量）、Wilcoxon秩和检验（非正常连续变量）和χ分类变量的2检验或Fisher精确检验。统计显著性定义为P<0.05（双尾）。共病包括糖尿病、高血压、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、恶性肿瘤和慢性肝病（在线附表S1所示）。

结果

1 研究设计与研究技术路线流程图

筛查排除后，收集719份样本进行进一步分析（图1），其中舌苔样本392份（确诊患者72份、疑似患者37份、恢复患者22份、配对患者37份、河南HCs 150份、杭州HCs 74份）、粪便样本172份（36份、23份、18份），来自河南的23份SPR和72份HCs）和155份血清样本（73份CPs、30份SPs、22份CPR和30份SPR）。

将来自CPs和HCs的舌苔和粪便样本随机分为发现阶段和验证阶段。在发现阶段，我们描述了48个CP和100个HCs中的口腔微生物组（24个CP和48个HCs中的粪便微生物组），确定了关键的口腔或粪便微生物标记，并通过五倍交叉验证随机森林模型构建了COVID-19分类器。在验证阶段，我们根据24个CP和50个HCs的口腔微生物组（12个CP和24个HCs的粪便微生物组）验证了COVID-19分类器的诊断效果。以杭州地区74份舌苔样本为样本，验证COVID-19分类器的跨区域诊断效果。另外，用37份IgG阳性的SPs舌苔样本（23份粪便样本）检测COVID-19分类器能否诊断SPs为COVID-19阳性。最后，我们描述了COVID-19患者和康复患者的口腔和粪便微生物群以及血脂分子。此外，还分析了微生物组与血脂的关系以及微生物组与临床参数的关系。

2 参与者的特征

本研究中，队列中参与者的特征、CPs和HCs的临床特征详情见表1（在线附表S1）。两组的性别和年龄比例相当。与HCs组相比，舌苔组和粪便组白细胞（WBCs）（P<0.01）、淋巴细胞（P<0.0001）和血小板（P<0.0001）有所减少，天冬氨酸转氨酶（P<0.05）升高。入院时最常见的体征或症状是发烧和咳嗽。

3 基于口腔微生物群的COVID-19无创诊断模型

对目标样本的稀疏曲线分析表明，各组OTU丰富度接近饱和（图2A和在线附图S1A）。根据Shannon指数和Simpson指数估计，与HCs相比，CPs的口腔微生物多样性显著降低（均P<0.001）（图2A和在线附图S1B，在线附表S2）。维恩图显示，2407个OTU中有1392个是两组共有的，而685个OTU是CPs独有的（在线附图S1C）。进行主坐标分析（PCoA）以显示样本之间的微生物组分布差异，β多样性结果显示两组之间口腔微生物群落存在显著差异（图2B和在线附图S1D）。

图2.基于口腔微生物组的COVID-19非侵入性诊断模型(A）样本数与OTU数之间的稀疏曲线分析。随着样品数量的增加，在CPs（n=48）和HCs（n=100）中OTU的数量接近饱和。与HCs相比，CPs中OTU的数量减少。根据Shannon指数估计，与HCs相比，CPs的口腔微生物多样性显著降低(B）基于OTU分布的PCoA表明，两组间的口腔分类组成存在显著差异(C）与HCs相比，CPs中有5个属显著富集，5个属显著减少(D）两个类群在属水平上细菌群落的平均组成和相对丰度(E）两组中每个样本的差异OTU相对丰度热图。与HCs相比，CPs的POD值显著升高，在发现队列（F和G）、验证队列（H和I）和独立队列（J和K）中取得了良好的诊断效果。与HCs相比，SPs（L）的POD值显著增加，AUC值为0.9211（M）*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。AUC，曲线下面积；CPs，确诊患者；HCs，健康对照组；操作分类单位；主坐标分析；POD，发病概率；SPs，疑似病人。中线；框限，上下四分位数；圆形或方形符号，平均值；误差线，95%置信区间。

在属水平上（图2D），两组中的5种优势细菌Prevotella, Neisseria, Veillonella, Streptococcus和Porphyromonas合计平均占60%（在线附表S3）。口腔微生物群在属和门水平上的平均组成和相对丰度如图2D和在线附图S1F所示。在线附图S1E（在线附表S4）中给出了门级的不同分析。

与HCs相比，包括Porphyromonas和Fusobacterium在内的五个属在CPs中缺失，而包括Leptotrichia和Selenomonas在内的五个属在CPs中增加（均P<0.05）（图2C）（在线附表S4）。其中，Porphyromonas和Fusobacterium属于丁酸盐产生菌族，而Leptotrichia和Selenomonas产生脂多糖。丁酸作为一种SCFA，具有重要的抗炎作用。此外，脂多糖可以激活核因子-κB（NF-κB）途径和类toll受体，促进促炎细胞因子和激活免疫反应。因此，产丁酸细菌的减少和产脂多糖细菌的增加可能参与了COVID-19患者的炎症反应。

热图显示3个OUT在CPs中得到富集，而45个OUT富集于HCs（图2E，在线附表S5）。我们进一步进行了线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析，并根据LDA（在线附图S1G和表S6）选择了与CPs密切相关的最具代表性的属。

为了评估口腔微生物标志物对COVID-19的诊断价值，我们构建了一个介于100个HCs和48个CPs之间的随机森林分类模型。最初，通过随机森林模型中的五倍交叉验证，选择8个能够准确识别两组之间差异的OTU作为最佳标记集（在线附图S1H，I）。然后，我们用8个OTU集（在线附表S7-S10）计算队列的POD指数。CPs的POD指数明显高于HCs（图2F），AUC达到98.06%（95%CI 96.31%至99.82%，P<0.0001）（图2G）。这些数据表明，口腔微生物标志物可以特异性地识别HCs和 COVID-19患者。

同时，在验证队列中使用24个CPs和50个HCs来验证微生物生物标记物对CPs的诊断效果。CPs组的POD指数（图2H）显著高于HCs组，两组之间的AUC值为95.75%（95%CI为90.99%至100%）（P<0.0001）（图2I）。此外，我们进一步收集了74份来自杭州CPs的舌苔样本，作为独立的诊断样本。POD指数（图2J）在74个杭州CPs和HCs中明显较高，两组间AUC值为87.24%（95%CI 80.5%至93.98%）（P<0.0001）（图2K）。这些结果表明，这种基于口腔微生物群的分类方法对COVID-19具有很强的诊断效果。

4 CPs、SPs和HCs的口腔微生物特征

用RT-PCR核算检测被认为是COVID-19检测的黄金标准。然而，由于各种因素引起的高假阴性率，包括低病毒滴度和取样错误，漏掉了许多CPs，从而增加了传播范围。因此，寻找一种新的辅助诊断COVID-19的方法已迫在眉睫。我们收集了79例SPs和与其对应的SPRs样本，排除恢复期IgG抗体阴性的患者后，用37例SPs和与其对应的SPRs样本验证其诊断价值。SPs和HCs的POD指数（图2L）明显高于HCs，SPs和HCs之间的AUC为92.11%（95%CI 86.15%至98.07%）（P<0.0001）（图2M），表明该分类器可作为COVID-19无创诊断的辅助工具。此外，还测量了22个CP、37个SP和6个HCs的血清IgG水平（图3A）。与HCs相比，CPs和SPs中的IgG显著升高（P<0.0001，在线附表S11），并高于正常检测的上限。

图3.CPs、SPs和HCs的口腔微生物特征。（A）恢复期CPs（n=22）、SPs（n=37）和HCs（n=6）中SARS-CoV-2抗体水平。试剂盒的阳性判断值为10 U/mL（大于10 U/mL为阳性，小于10 U/mL为阴性）。图中抗体水平计算为log2（值）。（B）样本数与OTU数之间的稀疏性分析。随着样品数量的增加，在CPs（n=72）、SPs（37）和HCs（n=150）中OTU的数量接近饱和。与HCs相比，CPs和SPs中OTU的数量减少。根据Shannon指数估计，CPs和SPs的口腔微生物多样性与HCs相似，但显著降低。（C）基于OTU分布的PCoA结果表明，CPs和SPs的口腔微生物群落与HCs相似，但差异显著。（D）三个类群在属水平上细菌群落的平均组成和相对丰度。（E）三组中每个样品差异OTU相对丰度的热图。PCoA结果显示CPs与SPs（F）及CPRs与SPRs（G）的口腔菌群分布无显著性差异。（H）四个类群在属水平上细菌群落的平均组成和相对丰度。CPs，确诊患者；CPRs：确认后康复的病人；HCs，健康对照组；操作分类单位；主坐标分析；SPs，疑似患者；SPRs怀疑病人已经康复。中线、中线；框限或上下线、上下四分位数；圆形或方形符号，平均值；误差线，95%置信区间。

每种疾病都有其独特的口腔微生物特征。我们推测相同的微生物特征可能来自同一疾病，并分析了CP、SPs和HCs之间的口腔微生物特征，以证明从微生物组学角度将IgG阳性的SPs鉴定为CP的可行性。

CPs（n=72）和SPs（n=37）的口腔微生物多样性相似（p>0.05），但与HCs（n=150）相比显著降低（P<0.001）（图3B和在线附图S2A和表S12）。PCoA和热图显示，CPs和SPs中的口腔微生物组相似，但与HCs中的不同（图3C、E和在线附图S2B和表S14）。维恩图显示，2184个OTU中有1280个在CPs和SPs之间共享（在线附图S2C）。微生物属和门的平均组成如图3D和在线附图S2D所示（在线附图表S13）。结果表明，SPs与CPs口腔微生物丰度和组成基本一致，与HCs口腔微生物丰度和组成不同。

PCoA分析结果显示CPs和SPs以及CPR和SPR之间的口腔微生物组分布没有显著差异（图3F，G）。此外，在属水平上（图3H，在线附表S15），CPs和CPR之间的口腔微生物组变化与SPs和SPR之间的变化大致一致。结果表明，IgG阳性的SPs口腔微生物特征与CPs一致，用口腔微生物组学诊断IgG阳性的SPs为COVID-19是可行的。

5 口腔微生物修复与COVID-19患者的康复

CPRs的口腔微生物多样性与CPs相似，但与HCs相比显著降低（P<0.001）（图4A和在线附图S2E和表S16）。PCoA显示CPR中的口腔微生物分布与CPs和HCs中的不同（图4B，在线附图S2F）。维恩图显示，CPR中1012个OTU中有985个与HCs所共有，953个OTU与CPs所共有（在线附图S2G）。

图4.口腔微生物修复与COVID-19患者的康复。（A）样本数与OTU数的稀疏曲线分析。随着样本数量的增加，CPs（n=72）、CPRs（22）和HCs（n=150）的OTU数量接近饱和。与HCs组相比，CPs组和CPRs组OTU数量明显减少。根据Shannon指数估计，CPRs的口腔微生物多样性与CPs相似，但与HCs相比显著降低。（B）基于OTU分布的PCoA结果表明，CPRs与CPs、HCs的口腔微生物群落存在差异。（C）随着COVID-19的恢复，5个属的相对丰度逐渐增加，3个类群间差异显著；5个属的相对丰度逐渐降低，3个类群间差异显著。（D）三组中每个样品差异OTU相对丰度的热图。红色框表示OTU丰度从左到右逐渐增加，绿色框表示OTU丰度从左到右逐渐减少*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。CPs，确诊患者；CPRs：确认后康复的病人；HCs，健康对照组；操作分类单位；主坐标分析。中线、中线；框限，上下四分位数；圆形或方形符号，平均值；误差线，95%置信区间。

在线附图S2H，J（在线附表S17）显示了门和属水平上三组口腔微生物群的平均组成和相对丰度。门和属水平的差异分析如在线附图S2I和图4C所示（在线附表S18）。随着COVID-19的恢复，Porphyromonas, Haemophilush和Family_XIII_incertae_sedis属的丰度持续升高（P<0.001），而Leptotrichia, Megasphaera，Selenomonas属的丰度持续降低（P<0.01）。值得注意的是，随着龋齿的发展，Megasphaera增多。这些相似的结果表明，对这些细菌的干预可能会对患者的预后产生影响。热图还显示，CPR中的口腔微生物群落与CPs和HCs中的不同，CPR中差异OTU的丰度介于CPs和HCs之间（图4D和在线附表S19）。我们进行了LEfSe分析，并在LDA的三个组中选择了最具代表性的属（在线附图S2K和表S20）。这些数据表明口腔微生物组可能参与了COVID-19患者的康复。

肠道微生物组作为COVID-19的非侵入性诊断模型除了口腔微生物组外，肠道微生物组还与病毒性疾病密切相关，如HBV、9 HCV30和HIV。因此，我们对发现队列中的24个CP和48个HCs进行了测序。与HCs相比，CPs中的粪便微生物多样性显著降低（P<0.001，图5A和在线附图S3A、B和表S21）。维恩图显示1704个OTU中有1003个是CPs独有的（在线附图S3C）。PCoA和非计量多维标度（NMDS）显示粪便微生物群落存在明显差异（图5B和在线附图S3D）。

图5.肠道菌群作为COVID-19无创诊断模型的研究。（A）样本数与OTU数的稀疏曲线分析。随着样品数量的增加，在CPs（n=24）和HCs（n=48）中OTU的数量接近饱和。与HCs相比，CPs中OTU的数量减少。根据Shannon指数估计，与HCs相比，CPs的肠道微生物多样性显著降低。（B）基于OTU分布的PCoA分析表明，两组间肠道分类组成存在显著差异。（C）两个类群在属水平上细菌群落的平均组成和相对丰度。（D）与HCs相比，CPs中有5个属显著富集，5个属显著减少。（E）两组中每个样本差异OTU相对丰度的热图。与HCs相比，CPs的POD值显著增加，在发现队列（F和G）、验证队列（H和I）中取得了良好的诊断效果。与HCs相比，SPs（J）的POD值显著增加，AUC值为0.9801（K）。**P<0.01，***P<0.001。AUC，曲线下面积；CPs，确诊患者；HCs，健康对照组；操作分类单位；主坐标分析；POD，发病概率；SPs，疑似病人。中线、中线；框限，上下四分位数；圆形或方形符号，平均值；误差线，95%置信区间。

图5D和在线附图S3F（在线附表S22）显示了两组动物在属和门水平上的粪便微生物组的平均组成和相对丰度。在线附图S3E和图5C（在线附表S23）显示了门和属水平的差异分析。与HCs相比，CPs减少了5属，增加了5属（P<0.05）。热图显示，7个OTU富含CPs，而27个OTU富含HCs（图5E和在线附表S24）。基于LEfSe分析，我们进一步选择了与CPs相关的最具代表性的属（在线附图S3G和表S25）。

为了评估粪便微生物标记物对COVID-19的诊断价值，我们基于7个最佳标记集（在线附图S3H、I和表S26-S28）构建了48个HCs和14个CP之间的随机森林分类模型。然后，我们计算发现和验证队列的POD指数。与HCs相比，CPs的POD指数明显较高（图5F），AUC为99.74%（95%CI为99.16%至100%，P<0.0001）（图5G）。在验证阶段，CPs组（n=12）与HCs组（n=24）的POD指数（图5H）明显较高，AUC为99.31%（95%CI 97.66%至100%，P<0.0001）（图5I）。这些结果显示了该分类器对COVID-19的巨大诊断潜力。

6 不同组的肠道微生物的变化

接下来，我们收集了23个在恢复期IgG阳性的SP和相应SPR的样本并进行了序列测定。与HCs相比，SPs中的POD指数（图5J）显著增加，AUC为98.01%（95%CI 95.11%至100%，P<0.0001，图5K），表明该分类器也可作为无创诊断COVID-19的辅助工具。此外，还检测了18个CP、23个SPs和6个HCs中的血清IgG水平（图6A）。与HCs相比，CPs和SPs在恢复期间的IgG水平显著升高（P<0.0001，在线附表S18）。

图6.CPs、SPs和HCs肠道微生物的变化。（A）恢复期CPs（n=18）、SPs（n=23）和HCs（n=6）抗SARS-CoV-2抗体水平。试剂盒阳性判断值为10 U/mL（大于10 U/mL为阳性，小于10 U/mL为阴性）。图中抗体水平计算为log2（值）。（B）样本数与OTU数之间的稀疏性分析。随着样品数量的增加，在CPs（n=36）、SPs（n=23）和HCs（n=72）中OTU的数量接近饱和。与HCs相比，CPs和SPs中OTU的数量减少。根据Shannon指数估计，CPs和SPs的粪便微生物多样性与HCs相似，但显著降低。（C）基于OTU分布的PCoA结果表明，CPs和SPs的肠道微生物群落与HCs相似，但差异显著。（D）三个类群在属水平上细菌群落的平均组成和相对丰度。（E）三组中每个样品的差异OTU相对丰度热图。PCoA结果显示CPs与SPs（F）及CPRs与SPRs（G）的粪便微生物分布无显著性差异(H）四个类群在属水平上细菌群落的平均组成和相对丰度。HCs，健康对照组；CPs，确诊患者；SPs，疑似患者；操作分类单位；主坐标分析；CPRs：确认后康复的病人；SPRs，疑似康复患者。中线、中线；框限或上下线、上下四分位数；圆形或方形符号，平均值；误差线，95%置信区间。

类似的肠道微生物群特征可能来自同一疾病。因此，我们分析了CPs（n=36）、SPs（n=23）和HCs（n=72）的粪便微生物特征。CPs和SPs中的粪便微生物多样性相似，但与HCs相比显著降低（P<0.001，图6B和在线附图S4A和表S29）。PCoA和NMDS（图6C和在线附图S4B）显示CPs和SPs之间的粪便微生物群相似，但与HCs不同。维恩图显示，1421个OTU中有722个在CP和SP之间共享（在线附图S4C）。粪便微生物组在属和门水平上的平均组成如图6D和在线附图S4D所示（在线附表S30）。热图（图6E，在线附表S31）显示，与HCs相比，18个OTU富集，而30个OTU在CPs和SPs中耗尽。PCoA显示，CPs和SPs之间或CPR和SPR之间的粪便微生物组分布没有显著差异（图6F，G）。此外，在属水平（图6H，在线附表S32），CPs和CPRs之间的粪便微生物变化与SPs和SPRs之间的变化大致一致。这些结果表明，SPs和CPs的粪便微生物特征基本一致。

与CPs（n=36）相比，CPRs（n=18）中的粪便微生物多样性增加（Shannon指数，P<0.05），但与HCs（n=72）相比显著降低（P<0.001）（图7A和在线附图S4E和表S33）。PCoA和NMDS（图7B和在线附图S4F）表明，CPR中的粪便微生物群落与CPs和HCs中的不同。维恩图显示，CPR中816个OTU中有769个与HCs共享，615个与CPs共享（在线附图S4G）。

图7.COVID-19患者肠道微生物的恢复。（A）样本数与OTU数的稀疏性分析。随着样本数量的增加，CPs（n=36）、CPRs（n=18）和HCs（n=72）的OTU数量接近饱和。与HCs组相比，CPs组和CPRs组OTU数量明显减少。根据Shannon指数估计，与CPs相比，CPRs中的粪便微生物多样性增加，但与HCs相比显著减少(B）基于OTU分布的PCoA结果表明，CPs与CPs和HCs的粪便微生物群落结构不同(C）随着COVID-19的恢复，5个属的相对丰度逐渐增加，3个类群间差异显著；5个属的相对丰度逐渐降低，3个类群间差异显著(D）三组中每个样品的差异OTU相对丰度热图。红色框表示OTU丰度从左到右逐渐增加，绿色框表示OTU丰度从左到右逐渐减少*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。HCs，健康对照组；CPs，确诊患者；操作分类单位；主坐标分析；CPRs，确认后康复的病人。中线、中线；框限，上下四分位数；圆形或方形符号，平均值；误差线，95%置信区间。

在线附图S4H，J（在线附表S34）显示了门和属水平上三组粪便微生物群的平均组成和丰度。门和属水平的差异分析如在线附图S4I和图7C（在线附表S35）所示。随着COVID-19的恢复，有5属持续增加（P<0.05），5属持续减少（P<0.01）。其中Lachnospira可通过发酵纤维产生SCFAs，粪便杆菌具有抑制NF的抗炎作用-κ因此，这些细菌可能通过减少炎性细胞因子风暴和促进免疫系统改善来促进患者康复。

热图显示，CPRs中的粪便微生物群落与CPs和HCs中的不同，CPR中差异OTU的丰度介于CPs和HCs之间（图7D，在线附表S36）。我们进行了LEfSe分析，并在LDA上选择了三个类群中最具代表性的属（在线附图S4K和表S37）。

7 微生物组和脂质组之间的联系有助于CPs的恢复

代谢物在COVID-19进展中起重要作用。然而，COVID-19和康复患者的脂质组学特征尚未报道，也没有在康复过程中发挥作用。因此，我们使用UPLC-MS非靶向脂质组学方法检测了155个样本，包括73个CP、30个SP、22个CPR和30个SPR样本。我们获得了高质量的数据（在线附图S5A-D）。共鉴定和量化了808个脂质分子（在线附表S38）。在亚类水平上，四组的磷脂酰胆碱（PC）、甘油三酯（TG）和鞘磷脂（SM）平均占80%（图8A、在线附图S5E和表S39）。

图8.微生物组和脂质组之间的联系有助于CPs的恢复。（A）在亚类水平上，CPs（n=73）和CPR（n=22）中脂质的平均组成和相对丰度。（B）PCA显示CPs（n=22）和CPs（n=73）的脂质分布不同。（C）基于KEGG，确定了CPs（n=73）和CPRs（n=22）之间差异最大的20条富集途径。点的大小代表代谢物的数量。（D）热图显示了CPs（n=11）和HCs（n=18）之间28个不同的口腔OTU和28个不同的肠道OTU之间的部分Spearman相关系数。红色代表正相关，绿色代表负相关。（E）研究了CPs（n=36）和CPRs（n=18）中22个鉴别性口腔微生物OTU、4个鉴别性粪便微生物OTU和10个鉴别性脂质分子之间的关系。点的颜色显示了属的不同门。每个属点的大小表示平均相对丰度。圆形点代表粪便微生物组，正方形点代表脂质分子，菱形点代表舌苔微生物组。线条的透明度表示相关P值（Spearman's）的负对数（以10为底），红线表示负相关，蓝线表示正相关，线条的宽度表示相关的大小（Spearman's）。HCs，健康对照组；CPs，确诊患者；操作分类单位；CPRs：确认后康复的病人。

PCA和热图（图8B和在线附图S6A和表S40）显示CPs和CPR之间存在明显差异，其中47个脂质分子，包括SM（d40:4）、SM（d38:4）和单甘油酯（33:5），以及122个脂质分子，包括PC（36:4p）、PE（16:0p/20:5）和甘油二酯（20:1/18:2），丰富了心肺复苏术。此外，在CPs和CPR之间确定了20条差异最显著的富集途径（图8C），包括产热和坏死下垂。SPs和SPR的结果如在线附图S5F–G和S6B所示。

我们分析了28个口腔和28个粪便中不同微生物OTUs在CPs和HCs之间的相关性。其中，OTU2284（Porphyromonas）、OTU1642（Haemophilus）和OTU1868（Prevotella）等11种口腔微生物群与富含HC的OTU1153（Roseburia）呈正相关，但与富含CP的OTU1741（Halomonas）呈负相关（P<0.05）（图8D，在线附表S41）。

人体微生物群通过向血液中分泌代谢物参与疾病的发生和发展。因此，在CPs和CPR中分析了口腔和粪便微生物群与脂质组学之间的相关性。Spearman的相关分析显示，4个粪便微生物OTU、22个口腔微生物OTU和10个脂质分子之间存在相关性（图8E）。CPR富集的TGs（26:0/18:1/18:2）与4个CP富集的粪便OTU呈负相关，包括OTU953（Streptococcus）、OTU920（Rothia）和OTU624（Halomonas）（P<0.05），与CPR富集的口腔OTU1801（Fusobacterium）呈正相关（P<0.05）。有趣的是，富含CPR的OTU1801（梭杆菌）与10种富含CPR的脂质分子呈正相关，与富含CPs粪便样本的OTU624（卤单胞菌）、OTU920（Rothia）和OTU953（Streptococcus）呈负相关。

此外，我们对7项临床指标与68项OTU进行了Spearman相关分析（在线附图S5H），发现白细胞与25项OTU呈正相关，包括OTU2628（Porphyromonas）和OTU247（Neisseria）（P<0.05），与5项OTU呈负相关，包括OTU1135（Veillonella）和OTU186（Leptotrichia）（P<0.05）。淋巴细胞与37个OTU呈正相关（P<0.05），包括OTU1891（Neisseria）和OTU2628（Porphyromonas）；与4个OTU呈负相关（P<0.05），包括OTU1135（Veillonella）和OTU390（Megasphaera）。粪便微生物组与临床指标之间的相关性如在线附图S5I所示。总之，这些结果表明，独特的脂质分子与口腔和肠道微生物组的变化密切相关，而独特的脂质和微生物组与COVID-19的恢复密切相关。

讨论

我们的研究首次发现COVID-19相关口腔微生物组的组成和功能改变，鉴定了特异性微生物标志物并构建了诊断模型，在中国两个不同地区的三个队列中取得了良好的诊断效果。令人信服的研究结果表明，口腔微生物组与病毒性疾病密切相关，可以作为一种非侵入性的诊断工具，诊断特定疾病或病毒性疾病。Zhang等科学家提出了一种口腔微生物诊断模型，并验证了其对类风湿关节炎（RA）的诊断效果。Flemer等人研究了结直肠癌患者口腔微生物组的改变，建立了基于16种口腔微生物标志物的诊断模型，取得了良好的诊断效果。因此，我们首次提出口腔微生物标志物可能是COVID-19的一种潜在的无创性诊断工具。同时，我们首次用我们的诊断模型成功地诊断出IgG阳性的SPs患者为COVID-19患者。

每种疾病都有其独特的口腔和肠道微生物改变。类风湿性关节炎患者的口腔微生物群失调表现为Lactobacillussalivarius增多和Haemophilus spp.的减少。Porphyromonas, Tannerella和Fusobacterium在牙周炎中富集。在我们的研究中，我们发现IgG阳性的SPs中的微生物改变与CPs一致，这支持了我们从微生物组学角度用微生物模型诊断SPs为CPs的观点。微生物标志物结合RT-PCR可进一步提高人群中潜在COVID-19患者的检测效率，减少感染源和传播范围。

微生物组与疾病的恢复密切相关。类风湿关节炎和牙周炎的口腔微生物群失调在治疗后部分恢复正常，表明微生物群在康复中起着重要作用。我们首先报道了恢复期COVID-19患者口腔微生物群和脂质组学的特征，发现了可能参与COVID-19发生和预后的关键细菌和脂质分子。这些微生物群可能通过向血液中分泌脂质分子影响COVID-19的进展。我们的研究中报道了微生物组与脂质的相关性。口腔和肠道微生物群分别与白细胞和淋巴细胞等临床指标相关。随着微生物组学对疾病影响机制的进一步研究，利用微生物辅助诊断、治疗和预后对COVID-19有着广阔的应用前景。

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