科研 | Microbiome：农业泥浆病毒组的混合组装揭示了一个多样化和稳定的群落，具有改变兽医病原体代谢和毒力的潜力

2021-08-15 19:28

病毒是地球上最丰富的生物实体，被称为微生物生态系统的重要组成部分。

编译：微科盟咖啡里的茶，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

病毒是地球上最丰富的生物实体，被称为微生物生态系统的重要组成部分。然而，关于农业废弃物中病毒群落的资料很少。英国目前约有270万头奶牛每天生产自己体重的7 - 8 %的粪肥，年产量达2800万吨。为避免污染英国淡水，粪肥必须按照DEFRA制定的指南进行储存和传播。粪肥被用作肥料，广泛地分布在农田，但当前知识对其微生物组成知之甚少。我们用短读和长读测序的方法分析了5个月的农用泥浆病毒体。结果表明混合的测序发现了比单独的长读或短读更高质量的病毒基因组；获得7682个vOTUs，其中174个是完整的病毒基因组。泥浆病毒体多样性较高，以裂解性噬菌体为主，其中大多数表现为新属(~98%)。尽管浆液不断流入和流出，但浆液病毒组的组成和多样性随时间变化非常稳定，在5个月的时间内，所有样品中都检测到55 %的vOTUs。功能注释揭示了群落中存在的多种多样且丰富的辅助代谢基因和新特征，包括农业相关的毒力因子VapE，其广泛分布于不同的噬菌体属中，可感染多种宿主。此外，我们鉴定了大量编码噬菌体产生多样性的逆转录因子，这在以前被认为是裂解病毒基因组上罕见的。此外，我们发现了一组crAssphages，包括以前认为只存在于人类肠道中发现的谱系。牛浆液病毒体是复杂的、多样的，并由新属所主导，其中许多不能单独用长读或短读来重新获得。噬菌体被发现编码一系列不受特定群体或预测宿主限制的AMGs，包括毒力决定因子和假定的ARGs。因此，农业泥浆在土地上的应用可能是环境中细菌毒力和抗菌性的驱动因素。

论文ID

原名：Hybrid assembly of an agricultural slurry virome reveals a diverse and stable community with the potential to alter themetabolism and virulence of veterinary pathogens

译名：农业泥浆病毒组的混合组装揭示了一个多样化和稳定的群落，具有改变兽医病原体代谢和毒力的潜力

期刊：Microbiome

IF：14.650

发表时间：2021.3.20

通讯作者：Michael A. Jones & Andrew D. Millard

通讯作者单位：诺丁汉大学动物医学与科学学院&莱斯特大学遗传与基因组生物学系

实验设计

结果

1 短读和长读组装体的比较

在五个月的时间内 (2017年6月7日至2017年10月10日)从泥浆罐中收集了五个样品，每个样品都制备了Illumina文库。使用viromeQC对五个样品测序数据进行初步分析，发现样品 (PHI75) 具有高水平的细菌污染（补充表1）。样品PHI75被排除在进一步分析之外，其他四个样品中的剩余DNA被汇集，扩增，并通过PromethION进行测序。

仅使用Illumina或PromethION进行组装，结果分别为1844和4954vOTUs≥10 kb。与仅使用Illumina的组装相比，PromethION组装导致中位contig大小从12648增加到14658(图1a)。每kb的预测基因数在PromethION组装中也较高。众所周知，与Illumina测序相比，Nanopore测序的错误率增加会导致截短基因调用。为了缓解这种情况，PromethIONcontigs用Illumina读数进行了修饰，产生了一个混合装配体，导致每kb基因数从2.059( 中位数长度:85aa) 减少到1.706 (中位数长度:103aa，图1b)。

全基因组扩增被用于获得足够的数据用于PromethION测序，所有的多样性统计和相对丰度数据仅由Illumina读数确定。评估了每个不同程序集可以获取的读取的百分比。Promexiom(32.663%) 和hybrid(33.976%) 组装体比Illumina(9.048%) 组装体吸收了更多的读长（9.048%;图2b）。每份样品中观测到vOTUs的中位值数量在PromeXiop(3483) 和hybrid (3532) 组装体中高于Illumina组装体 (2028；图2a)。预测的Shannon和Simpson多样性指数在hybrid中有所增加 (Shannon:6.909；Simpson:0.997)和PromethION 组装体 (Shannon:6.867；Simpson:0.997)与Illumina组装体相比(Shannon:5.557；Simpson:0.972；图2c，d)。

为了确定所鉴定的病毒contigs的完整性和质量，使用了CheckV。 hybrid 组装体包含的低质量基因组比例 (65.886%) 低于Illumina组装体(低质量:73.217%；中高质量:4.083%；图1c)，中高质量基因组比例 (15.015%) 高于Illumina组合。相反，Illumina装配比hybrid装配包含更多预测的完整基因组 (Illumina:167；hybrid:40)。这可能是由于对更长读长的PromethION测序的大小选择，这映射在从hybrid组装体获得的完整基因组的更长平均长度上 (图1d)。

为了充分了解泥浆罐中噬菌体的多样性，我们还研究了出现在细菌部分中的前噬菌体元素。总共预测了2892个假定的前噬菌体，其中只有407个可以通过读长图谱在游离噬菌体部分中检测到。我们将预测的407种活跃的前噬菌体与Illumina和hybrid组装体结合在一起。使用cluster_ phages _ genomes . pl去除冗余，得到7682个vOTUs。在建立了尽可能最全面的DNA病毒组后，对数据进行了进一步分析。

图1. 用Illumina读数修饰PromethIONvOTUs的效果概述。a从Illumina、PromethION和Hybrid组装体获得的vOTUs的长度分布。b从Illumina、PromethION和Hybrid组装体获得的预测ORF长度的分布。c通过checkV分析对Illumina、PromethION和Hybrid组装体获得的vOTUs进行质量评估。d通过CheckV对Illumina和Hybrid组装体的基因组完整性进行评估。图a、b和d中的虚线表示中位数值。

图2. 不同装配体中vOTUs的丰度和多样性。a从标准化读长计数获得的每个样本中观察到的vOTUs数。 Hybrid 组装体是Illumina和PromethION读长的组合。前噬菌体是从同一样本的细菌宏基因组中预测的。最终组装是Illumina、hybrid和已鉴定的活性前噬菌体的组合，其处于在95%ANI下重复。b不同组装体随时间推移的读长增长。c 每个采样点来自不同组装体的Shannon指数的⍺-diversity。d 每个采样点来自不同组装体的Simpson指数的⍺-diversity。

2 浆液病毒组的特征

每个样本可获得读长的百分比为36.943%(PHI73;07/06/2017;图2b)至39.996%(PHI76;05/09/2017;图2 b)。在5个月的采样周期内，Shannon指数alpha多样性估计值仅为7.02(PHI77;10/10/2017) 至7.141(PHI73;07/06/2017)，表明病毒体在不同季节是稳定的和多样化的 (图2c, d)。虽然是多样化的，但病毒体在所有采样点都保持稳定，在所有样本中发现了7682个病毒体中的55%(4256)，在每一个单独的取样点只有477个vOTUs(~6%)是唯一的。此外，用DirtyGenes进行测试发现样本的vOTU丰度分布之间没有显著差异 (p = 0.1142，截断值为1%; p = 0.863，临界值为0.5%)。为了确定宏观多样性的稳定性是否反映了微观多样性的变化，我们评估了哪些预测的噬菌体基因处于正选择状态 (pN/pS > 1)。我们的分析显示，在至少一个样本中，1610/210997个基因(0.763%)处于正选择状态（补充表2）。从这些推定的功能可以分配给388个翻译基因。最常见的预测功能与噬菌体尾部和噬菌体结构相关。

为了对样本中存在的病毒类型进行更广泛的概述，pVOGs被用来推断每个vOTU的单元分类。在含有与pVOG数据库匹配的蛋白质的vOTUs中，91%与Caudovirales相关，2.17%与无尾病毒相关，其余未分类。大约有10%(710)的vOTUs被鉴定为温和的，这表明该群落主要由有尾噬菌体目（Caudovirales）的裂解性噬菌体组成。在所有样本中，温和型vOTUs的丰度是恒定的，范围从5.605%(PHI76；05/09/2017)至8.866%(PHI77；10/10/2017)，进一步证明了这个系统跨时间的稳定性。

为了鉴定浆液中存在的噬菌体种类，使用MASH将所有的vOTUs与所有已知的噬菌体进行比较(2020年3月)，平均核苷酸同一性(ANI)大于95%，目前定义为噬菌体种类的临界值。仅检测到分别与L2支原体噬菌体(登录号BL2CG)和链球菌噬菌体Javan630(登录号MK448997)相似的vOTUsctg5042和ctg217。此外，没有哪种噬菌体与之前从该系统中分离出的任何噬菌体相似。因此，绝大多数噬菌体代表了新的噬菌体物种。

为了在更高的分类水平上理解其组成，运行了vConTACT2。只有217个(2.825%)vOTUs与一个参考基因组聚类在一起，表明它们在属水平上是相关的(图3a)。值得注意的是，18个vOTUs与ΦCrAss001(登录号MH675552)和噬菌体IAS(登录号KJ003983)形成一个簇，ctg20似乎是一个接近完整的噬菌体基因组(~99kb；图4b)。其他7465个vOTUs只与其他vOTUs(3369；43.856%)或是单例(4096；53.319%)，表明有5242个推定新属。这些新属占所有样本中噬菌体的98.037%，表明该系统由新型病毒主导(图3b)。假设如果一个病毒群(viralcluster，VC)中的一个vOTU被确定为温和的，群体中所有其他vOTUs都是温和的，那么温和噬菌体的相对丰度是可以预测的。从13.09%(PHI76；05/09/2017)至16.249%(PHI77；10/10/2017)的范围变化进一步证明了裂解病毒的优势和系统随时间的稳定性(图3c)。

预计宿主为3189个vOTUs，发现该系统主要由噬菌体组成，预计它们会感染属于厚壁菌（Firmicutes）和拟杆菌（Bacteroidetes）的细菌，这些细菌是牛肠道中占主要地位的。宿主特异性丰度的比例在所有时间点上都表现稳定（补充图2）。

图3. vOTUs的分类分析。a来自本研究的 vOTUs 的vConTACT2网络分析和从基因库提取的噬菌体基因组数据库。病毒簇(VCs)中所选病毒辅助代谢基因的存在由不同的颜色标记。b含有≥1个已知病毒基因组(已知)或未知病毒基因组(新)的病毒簇丰度。包含≥1vOTU的病毒簇的丰度，预测为温和型(温和型)或非温和型(溶解型)。

3 在浆液病毒组中鉴定类CrAss噬菌体

鉴于在人类肠道病毒体中发现了大量存在 crAssphage ，18个与crAssphage相似的vOTUs簇的出现令人惊讶。为了进一步研究这一点，我们基于Guerin等人系统发育法，使用含有特异性标记基因的15个vOTUs。所有的vOTUs形成了先前提出的属VI的一部分，包括接近完整的噬菌体 (ctg20；图4a；补充图3)。此外，从浆液中鉴定出的crAssphage不形成单一的单元进化枝。相反，它们与人类crAssphage穿插在一起，一些浆液crAssphage比其他浆液crAssphage更接近人类crAssphage(图4a；补充图3)。ctg20和VI属噬菌体IAS的基因组比较发现噬菌体之间在基因组结构上有协同性，但有几个明显的分歧领域(图4b)。ctg20的预测宿主为梭状芽胞杆菌(Clostridium)，这与已经证实或预测的其他crAssphages分别感染拟杆菌(Bacteroides)和拟杆菌(Bacteroidetes)形成了鲜明对比。

图4. 浆液crAssphages的系统发育和基因组分析。a 编码引物酶、终止酶、门户蛋白和主要衣壳蛋白的四个基因的系统发育。分析采用与Guerin等人相同的方法，将之前定义的10个主要演化分支进行标记。b用tBLASTx算法和0.001E值和长度过滤器30构建EasyFig，对噬菌体ctg20和IAS病毒的全基因组进行比较。具有预期功能的基因产物是有色的。括号中显示了预测的或已知的宿主。

4 辅助代谢基因的丰度和多样性

为了理解噬菌体对宿主代谢功能的作用，使用 eggNOG将功能分配给蛋白质。在210997个预测的蛋白质中，只有48819个 (23.137%) 可以被赋予假定的功能。最丰富的直系同源基因簇(COG)分类是那些与病毒生活方式相关的；特别是复制、重组和修复、细胞壁/膜/包膜生物发生、转录和核苷酸转运和代谢(补充图4)。除此之外，还鉴定了一些推测的AMGs，包括推测的ARGs、CAZYmes、同化硫酸盐还原酶(ASR)基因、MazG、VapE和Zot (补充表3)。发现这些AMGs是丰富的，并且不受它们感染的特定噬菌体或宿主的限制 (图3a；补充表4)。例如，在77个假定的病毒属中的91个vOTUs上鉴定了碳水化合物活性酶，其中41个vOTUs预计会感染21个科的细菌 (补充表4)，在138个假定的噬菌体属中的148个vOTUs上鉴定了参与硫循环的基因，其中42个vOTUs预计会感染19个科的细菌(补充表4)。

5 毒力相关蛋白的丰度

在33个假定属的36个vOTUs上鉴定了编码Zot的基因，预计会感染5个不同的细菌科(补充表4)。还检测了在农业致病菌链球菌（ Streptococcus ）和双歧杆菌（Dichelobacter）中广泛存在的细菌毒力因子VapE。最近有研究表明，与野生型菌株相比，Streptococcus中编码vapE的噬菌体缺失会降低在浆液中的生长速率。在65个集群的82个vOTUs(约1%)上发现了VapE同源基因，包括10个高质量基因组 (图3a)。细菌宿主可预测17个vOTUs，分布于10个细菌科 (补充表4)。其中一个vOTU (ctg217)与噬菌体Javan630 (登录号 MK448997) 共享~ 95% ANI。ctg217和Javan630之间的基因组比较显示出高度保守的基因组，ctg217中插入一个编码假定的甲基转移酶的基因是最大的单一差异(图5)。

图5. 链球菌噬菌体Javan630和ctg217的基因组比对是使用采用tBLASTx算法，0.001E值和长度过滤器30的EasyFig进行比较。已知的毒力因子vapE基因用红色标记。这两个基因组的ANI超过基因组的95%。在ctg217基因组中插入一个编码甲基转移酶的基因用黄色标记

6 推测抗菌素耐药性基因的检测

假定的金属- β -内酰胺酶 (metallo-beta-lactamases，MBLs) 在116个假定属的146个vOTUs上被鉴定，其中60个vOTUs预计可以感染跨越23个科的细菌宿主(补充表4)。使用Phyre2进行结构建模，发现其中许多序列具有与新型bla_PNGM-1 β酰胺酶相同的预测结构 (100%置信超过99%覆盖率)。此外，这些序列包含B3亚类MBLs特有的保守锌结合基序。对假定的噬菌体MBLs、代表性细菌MBLs和已知噬菌体编码的bla_PNGM-1进行系统发育分析，结果显示一些MBLs与先前的特征细菌MBLs聚集在一起，另一些与特征噬菌体bla_HRVM-1聚集在一起(补充图5)。除了MBLs，在两个预计会感染两种不同细菌属的vOTUs上还发现了两个假定的多重耐药外排泵(补充表4)。

7 鉴别产生多样性的逆转录因子

除了AMGs，我们还发现了202个携带逆转录酶基因的vOTUs。虽然已知dsDNA噬菌体具有编码逆转录酶的基因，作为产生多样性的逆转录因子(diversity-generating retroelement，DGR)的一部分，并了解其机制，但鲜有报道。为了确定所鉴定的编码逆转录酶的基因是否属于DGR的一部分，我们使用MetaCCST来明确这些原理。202个携带逆转录酶基因的vOTUs中，82个属于DGR基因，占病毒组vOTUs的1%左右。相比之下，我们计算出在公开可用的噬菌体基因组(12354个独特基因组- 2020年3月)中可识别的DGRs数量为0.178% (22个基因组)。

对于能够识别出完整DGR系统(模板重复、可变重复、逆转录酶和靶基因)的vOTUS，最常见的预测靶基因功能是尾部纤维。DGRs在74个病毒簇和15个预计宿主细菌家族中的分布(补充表4)表明，这不是噬菌体或其感染宿主的特定VC所特有的特征(图3a)。

预计DGRs出现在被认为是高质量完整基因组的四种噬菌体上(图6)。这些噬菌体基因组的大小从40.3到52.07 kb不等，其中两个基因组包含假定的整合酶(k149_ 1459596和k149_1764855)，表明它们是温和的，另外两个可能是裂解性噬菌体(ctg154和k149_1404499)。有趣的是，噬菌体k149_1459596在07/06/2017至05/09/2017之间无法检测到，但在10/10/2017时是最丰富的vOTU，占当时病毒群体的3%以上。由于vConTACT2分析无法对噬菌体进行分类，采用编码TerL的基因进行系统发育分析，寻找已知的最近的亲缘关系(补充图6)。噬菌体k149_1459596最近的亲缘关系为弧菌噬菌体罗斯托夫7（Vibrio phage Rostov 7） (登录号 MK575466)，属于肌病毒科（Myoviridae）成员，另外三个噬菌体中已知的最接近的成员都是虹吸管病毒科（Siphoviridae）的成员。

我们假设DGRs的广泛分布可能反映了这些噬菌体普遍的趋性转换，并且可以检测到高变的DGR靶基因。为了研究这一点，我们检查了每个基因的变异，并计算哪些基因处于正向选择。69个DGR中含有一个靶基因的vOTUs，其中22个DGR靶基因中SNP位点的比例高于该特定vOTU上非DGR靶基因SNP位点的平均比例。其中，预测噬菌体尾部蛋白(ctg187_00023)为正选择。因此，在一个特定的vOTU上，DGR的许多靶基因比其他基因更容易变异(图6)。

图6. 含有DGRs的完整基因组的基因组图谱。四个噬菌体ctg154、k149_1459596、k149_1764855和k149_1404499都包含由虚线框突出显示的DGR。包含与共识基因组对应的SNPs读长百分比的绘制如图所示。

讨论

1 组装比较

对基于短读和长读测序方法的组装进行比较，发现病毒contigs和平均基因长度的分布有显著差异。正如之前发现的，单独使用长读会由于更高的错误率而导致基因调用问题。因此，我们使用短读来优化长读组装，并缓解了这些问题。与之前使用LASLs结合ONTMinION测序的方法不同，我们使用全基因组扩增，随后按大小进行选择的方法进行PromethION测序。

在使用MDA产生PromethION文库时，由于使用这种方法对ssDNA的偏好已得到证实，所以在扩增ssDNA噬菌体时很可能出现偏差。在promethION测序之前进行了片段的大小选择，这可能会去除一些较小的ssDNA基因组。然而，在PromethION装配体中有一个4-5kb长度的contigs峰值，表明是ssDNA基因组。考虑到已知的MDA偏差，我们仅利用Illumina文库(没有MDA扩增)来确定contigs的丰度和多样性的估计。通过比较Illumina、PromethION和hybrid装配体的多样性统计数据表明，仅Illumina装配体可能会低估样本内的多样性，而未经修正的PromethION装配体的多样性估计更接近于hybrid装配体。我们还观察到一些较小的基因组，它们仅从Illumina组装体中获得的，在PromethION中不存在。这很可能是为了排除一些小噬菌体基因组而进行的高分子量DNA(high molecular weight DNA，HMW)测序选择过程的一部分。因此，虽然长读改进了组装统计，但如果包括大小选择(正如我们所做的那样)，单独使用长读可能会导致排除较小的噬菌体基因组，并可能引入增加ssDNA基因组的偏差。

为了提供最全面的病毒contigs，我们包括了230个来自细菌宏基因组的预测前噬菌体，这些前噬菌体可以在游离病毒部分检测到，但不是从病毒体读长中组装的，从而提供了一个更全面的病毒contigs。

2 病毒组成分

五个月期间的多样性比较揭示了一个高度多样和稳定的病毒组。最初，对于这可能有些令人感到惊讶，考虑到泥浆池的动态变化，泥浆池不断有恒定的动物粪便、农场污水和雨水流入，每隔6周排空一次使其仅剩下大约10%的池容量。我们推断泥浆池中的大多数病毒将来自牛粪便，因为这是池中最主要的输入。宿主预测表明，病毒组主要是被预测会感染属于厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌的病毒，厚壁菌门和拟杆菌门是牛瘤胃和肠道中最丰富的两个细菌门。迄今为止，对奶牛肠道病毒及其随时间变化的动态研究有限。然而，有一种与人类肠道病毒相似的病毒，尽管不断流入和流出，但已知它是暂时稳定的，其组成受包括饮食在内的环境因素的影响。假设泥浆池中的大多数病毒来自牛的粪便，在控制环境和奶牛饲食的情况下会产生暂时稳定的病毒组。

我们的正选择分析发现，在正选择下最常见的基因是与细菌附着和吸附相关的基因。我们推断这些发现，在结合宏观多样性的极端稳定性，符合噬菌体宿主动力学的王室模型。这个模型表明，优势噬菌体被优化到其特定的生态位，当细菌对感染产生抗性时，一个高度相似的噬菌体将填补该生态位。因此，群落组成随时间的变化会反映在细尺度多样性变化上，而宏观多样性则相对不变。噬菌体可以通过对参与附着和吸附的基因的正向选择来克服细菌的耐药性，而不是使其种群崩溃，并且有可能加速这些基因与DGRs的变异。

3 产生多样性的逆转录因子

在噬菌体BPP-1(登录号AY029185)中首次发现了DGRs，其中逆转录酶与末端重复结合，产生易于出错的cDNA，然后稳定地合并入尾纤维。这个高变区介导BPP-1在不同博德特氏菌（Bordetella）种间的宿主转换。此后，在培养的噬菌体分离株中发现的DGRs非常少，在两种温和的弧菌噬菌体中仅发现了两种DGRs。我们通过搜索可公开获得的噬菌体基因组，将其扩展至22个噬菌体(0.178%)。虽然在噬菌体基因组中并不常见，但在细菌基因组中已经鉴定出了DGRs，与噬菌体相关的基因通常位于DGRs旁边。最近对约32000个前噬菌体的分析进一步确认了来自不同细菌门的活性前噬菌体中的74个DGRs。在这项研究中，我们能够预测噬菌体基因组上另外的82个DGRs，其中4个被认为是完整的。其中两个完整的噬菌体基因组被认为是裂解性的。事实上，在这项研究中，大多数含有DGRs的contigs被认为是裂解性的，从而证明噬菌体上的DGRs比以前发现的更普遍，并且在裂解性噬菌体上也广泛观察到，这是以前没有观察到的。

鉴于DGRs的流行，我们希望像其他人一样所做的那样，通过在DGR靶基因中出现SNPs来发现广泛的噬菌体趋性转换的证据。虽然可以在DGR靶基因中鉴定出SNPs来支持这一观点，但同一噬菌体基因组中的许多其他区域也含有类似水平的变异。这可能是施加在噬菌体基因组上的多种进化压力和机制的结果，而DGRs只是一种产生变异的机制。

4 类CrAss噬菌体

目前，类crAss噬菌体被分为4个亚科和10个属，存在于多种环境中，包括人类排泄物，灵长类动物粪便，狗粪便和白蚁肠道。在这里，我们进一步鉴定了18个类crAss的噬菌体，包括一个属于拟属VI的接近完整的基因组。VI属是甜菜夜蛾病毒（Betacrassvirinae）亚科的一部分，目前仅包括人类肠道内出现的其他类crAss噬菌体，包括在HIV-1感染个体中高度丰富的IAS病毒。因此，我们扩展了发现类VI属类crAss噬菌体的环境，包括非人类宿主。由于浆液池可能输入的数量导致这些噬菌体的确切来源是未知的。然而，最可能的来源是奶牛，因为这是最丰富的输入。不同于人类的对应物IAS病毒，IAS病毒可占人类粪便中病毒DNA的90%，泥浆池中的类crAss噬菌体仅在低水平(~0.065%)下发现。

系统发育分析表明，人类和泥浆池类crAss噬菌体具有共同的祖先，它们之间有遗传交换。这个交换的方向和路线尚不清楚。这可能与在耕地上使用泥浆生产人类消费产品的现代做法有关。或者它通过使用从人类粪便中提取的生物固体可以从人类转移到奶牛，这些生物固体物被应用到作为动物饲料的作物上。

5 辅助代谢基因

我们在奶牛场泥浆中发现了大量多样且丰富的AMGs，包括推定的ARGs、CAZYmes、ASR基因、MazG、VapE和Zot。虽然这些都已经在来自不同环境的病毒组中得到鉴定，但这是它们首次在泥浆中得到鉴定。不同AMGs的存在可能反映了泥浆的独特组成，具有非常高的水含量与有机质结合。检测到的CAZYmes以前在红树林土壤和牛瘤胃的病毒组中被发现过，认为它们在噬菌体感染期间参与有机碳的分解并促进宿主能量的产生。鉴于浆液中高纤维素和半纤维素含量，它们可能以类似的方式在浆液中起作用，以增加噬菌体复制的能量。除了参与碳的循环，噬菌体衍生基因也参与了泥浆中的硫循环。硫酸盐还原菌(Sulfate-reducingbacteria，SRB)在动物粪便中很活跃，因此硫酸盐可能会限制在池内。ASR途径使硫可用于掺入新合成的分子，如L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸，因此裂解性和温和性噬菌体上噬菌体编码的ASR基因的存在可以克服氨基酸合成中的代谢瓶颈。或者新合成的ASR途径产物可以通过TCA循环降解成为能量。

广泛存在于海洋噬菌体的AMGmazG，尤其是在噬藻体中，被发现是丰富的。噬藻体MazG蛋白最初被假设为通过改变细胞内 (p) ppGpp水平来调节宿主的严格响应。然而，最近的研究发现事实并非如此。在泥浆池中的鉴定表明，这种基因并不局限于海洋环境，而是广泛存在于不同类型的噬菌体中，尽管其确切作用仍有待阐明。

6 抗生素抗性基因

关于噬菌体在ARGs转移中的重要性一直存在争议。我们在约2%的vOTUs上发现了ARGs;占病毒组装contigs预测噬菌体基因总数的0.082%。预测的ARGs主要由假定的MBLs组成，这些MBLs包含核心基序和结构相似性，分别与已知的细菌和噬菌体MBLsbla_PNGM-1和bla_HRVM-1相似。因此，它们可能在功能上是活跃的，尽管这还有待证实。我们对浆液中ARGs丰度的估计低于早期其他环境的报告，这些报告预测病毒组中约0.45%的基因是ARGs。然而，其中一些研究使用未组装的读长来估计丰度，而我们只计算了通过严格过滤的contigs上的ARGs。我们对大约0.082%的预测类似于最近对来自六种不同环境的病毒体的0.001%至0.1%的估计，这些环境也使用了组装的病毒体，这表明噬菌体可能是浆液中ARGs的重要储存库。

7 毒力相关蛋白

发现毒力基因zot和vapE很丰富，并由几个预计会感染一系列细菌宿主的vOTUs携带。zot在霍乱弧菌（Vibriocholerae）中的作用已经得到了很好的研究，以前在一系列弧菌（Vibrio）和弯曲杆菌（Campylobacter）前噬菌体中也有过报道。在此处，我们在噬菌体中发现了除Vibrio和Campylobacter之外的其他预测宿主的zot同源物，进一步扩大了携带这些基因的噬菌体的多样性。

在毒力因子vapE上也发现了类似的观测结果，以前在包括链球菌（ Streptococcus ）和双歧杆菌（Dichelobacter）在内的几种农业病原体中也发现了这种现象。已知编码在前噬菌体元件上的VapE可增强Streptococcus的毒力，并且在前噬菌体上广泛存在。虽然vapE在毒力中的作用已经确定，但之前的工作没有证明这些类原噬菌体元件的移动性。在这里，我们鉴定了一个高质量的接近完整的噬菌体基因组(ctg217)，它与编码前噬菌体Javan630的vapE非常相似。噬菌体Javan630最初被鉴定为引起乳腺炎的结核链球菌（Streptococcusuberis）菌株中的前噬菌体，该菌株是大约15年前在大约100英里外的奶牛场从奶牛中分离出来的。在游离病毒部分中鉴定ctg217表明噬菌体Javan630的近亲是活性前噬菌体。与游离病毒体中发现的许多编码vapE的其他噬菌体一样，这表明噬菌体在介导vapE的转移中是活跃的。在导致乳腺炎的病原体Strep.uberis, Strep. agalactiae 和 Strep. dysgalactiaea的乳品环境中，vapE的水平转移尤其令人担忧。这些病原体毒性的些许增加都对乳制品行业有害，因为它会影响动物福利和经济可行性。Streptococcus感染导致乳汁不能出售，通常会被丢弃在浆液池中。鉴于池子的定期排空，连续检测到浆液中含有vapE的噬菌体表明可能是连续的输入。含有vapE的噬菌体的确切来源无法确定，但可能是牛粪便或乳汁。使用泥浆作为有机肥料是否有助于噬菌体编码的毒力因子和毒素的传播仍有待确定。然而，它们的丰富存在表明它值得进一步研究。

结论

我们已经证明，使用混合方法比单独使用短读或长读产生更完整的病毒体组装。虽然短读可能会低估给定环境下的病毒多样性，但仅从长读的估计数比短读的估计数更接近混合值。低输入扩增基因组DNA的使用允许该技术应用于先前测序的宏基因组，而不需要进一步的DNA提取。我们提供了对浆液病毒组的综合分析，证明病毒组包含一个由新属裂解病毒主导的多样而稳定的病毒群落。功能注释显示了多种多样的AMGs，包括毒力因子、毒素和抗生素抗性基因，表明噬菌体可能在介导这些基因的转移和增强宿主的毒力和抗生素抗性方面起着重要作用。