Nature：四川大学苏昭铭等首次揭示全长四膜虫核酶3.1Å电镜结构

2021-08-13 16:08

RNA 具有重要的生物学功能，很多非编码 RNA 可以折叠成复杂的三维结构以行使或参与重要的生命过程，如催化、转录和翻译调控等。

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

RNA 具有重要的生物学功能，很多非编码 RNA 可以折叠成复杂的三维结构以行使或参与重要的生命过程，如催化、转录和翻译调控等。但由于 RNA 三维结构信息的匮乏，导致目前对 RNA 三维结构与功能间关系的认知仍相对有限。冷冻电镜现已成为生物大分子结构解析不可或缺的技术，然而由于 RNA 结构本身较强的不均一性，因此纯 RNA 冷冻电镜高分辨结构的获得依然是很大的挑战。此前，冷冻电镜数据库中仅有不到 10 个分辨率优于 5Å 的纯 RNA 结构，最高分辨率是 3.7 Å。

四膜虫 I 类自剪接内含子（Tetrahymena group I self-splicing intron）是由美国科学家 Tom Cech 发现的首个在没有蛋白参与情况下具备酶催化活性的 RNA，随后被命名为核酶（ribozyme），Tom Cech 也因为这个发现获得了 1989 年的诺贝尔化学奖。四膜虫核酶的核心区域 P3-P9 具有非常紧凑的三维结构来形成酶催化位点，它也成为了研究 RNA 三维结构与催化功能关系的重要模型。

2021年8月11日，四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室苏昭铭团队，中国科学技术大学张凯铭团队，以及美国斯坦福大学 Wah Chiu 和 Rhiju Das 团队，共同在Nature 期刊在线发表了题为：Cryo-EM Structures of Full-Length Tetrahymena Ribozyme at 3.1 Å Resolution 的研究论文。

该研究采用单颗粒冷冻电镜技术首次解析了全长四膜虫核酶在无底物结合状态（apo）和底物结合状态（holo）的高分辨结构（图1）。

图1. 四膜虫核酶holo状态结合底物后进行催化反应。5'外显子（黄色）和3'外显子（橙色）在核酶的作用下连接形成完整外显子并最终离开四膜虫核酶。

本研究通过解析四膜虫核酶的高分辨冷冻电镜结构，对不同结构域间的互作关系进行了深度解析，具体发现如下：

1、首先揭示了 apo 状态下 L-21 ScaI 核酶的 3.1 Å 全长冷冻电镜结构，这也是目前分辨率最高的纯 RNA 冷冻电镜结构。该结构首次解析了外围区域结构并揭示了其与核心区域 P3-P9 间几个重要的长程相互作用。外围区域 P2、P2.1、P9.1、P9.2 通过形成两个假结结构（Pseudoknot） P13 和 P14，以及 P14 中的 U43-A171-A172 和 P2-P2.1 连接处的 A31-U56-A95 两个碱基三链体（Base triple），将 P3-P9 包围起来。

2、发现了两种“始料未及”的长程相互作用。第一，P4 螺旋中的核苷酸 A210 与 P2 中的 A46 之间形成氢键，并与 P14 中的 G169 形成一个碱基堆叠（stacking），这样的互作方式使三者之间形成一个“P2-P4-P14桥”的结构。之前的研究发现A210会降低四膜虫核酶的结构稳定性，但对全长核酶的活性却至关重要，这一长程相互作用为该结果做出了合理的解释。第二，P9.1 中富含嘌呤的内环（bulge） G358、A359、G360 可以与催化核心 P7 间形成“P7多嘌呤长程相互作用” （P7 purine-rich interaction）以稳定酶活位点的结构。以上两种结构发现展示了全新的外围区域与核心区域间互作的方式，说明了外围区域如何对酶活位点造成影响。

3、通过比较核酶结合 5' 和 3' 外显子底物的 holo 状态与 apo 状态的结构，揭示了通过互补配对结合底物的内部引导序列（Interna guide sequence，IGS）的构象重排，以及酶活位点的构象变化。与底物结合后，IGS 区向催化核心的方向发生了约 60° 的构象旋转，同时酶活位点中的碱基和金属离子也发生了一定程度的位移，虽然活性位点的大致结构在 apo 状态下就已基本形成。

4、在 holo 状态的核酶中共鉴定出 31 个金属离子（M1~M31）。有些金属离子直接调控核酶的催化活性，其中包括先前通过生化功能实验鉴定出直接参与酶活反应的 MA （M26）和 MC （M27）、远程调控酶活的 ME （M28）以及新发现的稳定酶活位点的 M2。由于金属离子，尤其是镁离子，对 RNA 的正确折叠以及功能活性都起到了至关重要的作用，所以该研究也揭示了运用冷冻电镜研究 RNA 结构和功能的优势。

综上所述，该研究利用单颗粒冷冻电镜技术揭示了四膜虫核酶的全长高分辨三维结构，阐明了在底物结合和催化过程中 IGS、金属离子、磷酸基团与碱基的构象变化，为长达 40 年来对四膜虫核酶剪接反应的研究提供了结构和机制上的支持，同时也为后续进行高分辨 RNA 冷冻电镜结构的研究提供了范式。

该研究第一作者和共同通讯作者苏昭铭研究员表示， Tom Cech 之前解析了 P3-P9 区域 3.8 Å 的晶体结构，但包含周边区域的完整全长结构仍旧未知，这极大限制了人们了解四膜虫核酶周边区域如何远程调控核酶活性的结构机制。此外，3.8 Å 的分辨率也不足以鉴别出很多参与催化反应的关键金属离子。因此，解析四膜虫核酶的完整结构对于研究其结构功能关系尤为重要，同时对运用冷冻电镜研究其他RNA的结构与功能都具有重要参考意义。

本研究共同第一作者张凯铭研究员表示，早在上世纪90年代，Tom Cech 课题组就通过 Crosslinking 实验证实了内部引导序列（Interna guide sequence，IGS）在结合底物后会发生很大的构象变化，整体会有大概 37 Å 的位移。然而近30年过去了，四膜虫核酶结合底物的三维结构一直是个谜团。而这项工作解析了 Apo 和 Holo 两种不同构象的三维结构，揭示了IGS发生的构象变化，填补了这部分结构信息的空白。

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室、华西医院老年科与国家老年疾病临床医学研究中心为本研究的第一完成单位和通讯单位。苏昭铭研究员为本研究第一和共同通讯作者，中国科学技术大学张凯铭研究员和斯坦福大学 Kalli Kappel 博士为共同一作。四川大学华西生物国重室冷冻电镜中心工程师罗炳男参与了数据处理分析工作。同时，本研究得到了魏于全院士的大力支持。本研究由四川大学海外引进人才启动经费和国家自然科学基金等项目资助完成。

四川大学华西生物国重室冷冻电镜中心拥有300和200千伏前沿冷冻电镜各一台，同时配备了光电联用（CLEM）系统，可以进行高分辨单颗粒重构、断层成像（Cryo-ET）、微晶衍射（MicroED）等数据收集，现长期招聘具有一定电镜操作经验的工作人员；苏昭铭课题组的研究兴趣是运用冷冻电镜揭示病原RNA和RNA蛋白复合物的结构和功能，并基于RNA结构设计和筛选RNA靶向小分子化合物，作为潜在的分子探针和候选药物。