编译：微科盟蓝胖儿 ，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
导读
碳水化合物是人类和动物饮食中最重要的能量来源。大量研究表明，膳食碳水化合物（DCHO）与肠道内的细菌群落有关，但它们与肠道真菌组成的关系尚不清楚。本研究报道了在猪模型中结肠真菌群落对不同组成的DCHO的反应。三个因素，直链淀粉与支链淀粉的比例（2:1、1:1和1:2），非淀粉多糖的水平（NSP；1%、2%和3%）和甘露寡糖（MOS；400、800和1200 mg/kg体重），根据L9（34）正交设计，配制九种不同碳水化合物组成的饮食。基于Illumina HiSeq 2500平台针对猪结肠内部转录间隔区1的测序显示，猪结肠中真菌群落对DCHO的响应顺序为MOS、AM/AP和NSP。一些低丰度真菌属的很大一部分与DCHO的组成相关，以酵母属（Saccharomycopsis）、木拉克酵母属（Mrakia）、节菌属（Wallemia）、喇叭菌属（Cantharellus）、曲霉菌属（Eurotium）、Solicoccozyma和青霉菌属（Penicillium）为代表，也与葡萄糖和果糖的浓度以及结肠消化物中β-D-葡萄糖苷酶的活性相关，表明这些真菌在猪结肠中有降解DCHO的作用。本研究为DCHO的组成与猪结肠真菌群落的关系提供了直接证据，这有助于了解猪肠道微生物的功能。
原名：The Nutritional Significance of Intestinal Fungi: Alteration of Dietary Carbohydrate Composition Triggers Colonic Fungal Community Shifts in a Pig Model
译名：肠道真菌的营养意义：膳食碳水化合物组成的改变触发猪模型结肠真菌群落的变化
期刊：Applied and Environmental Microbiology
IF：4.792
发表时间：2021.4
通讯作者：陈代文
通讯作者单位：四川农业大学动物营养研究所
共135只杂交猪（断奶在21天）的初始体重6.71±0.23 kg被选为实验动物，随机分配到9组，每组5只和每组3只，进行正交阵列设计（OAD），使用具有三个因素的OA9（34）矩阵（表8）、AM/AP的比率、NSP水平（菊粉与微晶纤维素的混合物为1:1）和MOS的浓度。在试验开始和结束时，对所有猪进行称重，以计算平均日增重（ADG）值。每天记录每个个体的采食量以计算平均日采食量（ADFI）。实验结束时，从每头猪的中结肠收集约4 g消化物，并立即转移到2 mL升无菌试管中，在-80℃下冷冻，用于进一步分析。对样本进行DNA提取和测序、生物信息学分析和源跟踪分析。并测定了结肠消化样品中糖的浓度和消化酶的活性。
表8 矩阵正交排列设计
方差分析表明，虽然各组仔猪的平均日增重（ADG）和平均日采食量（ADFI）无显著差异（P>0.05；表1），不同DCHO组成的饮食倾向于影响动物的腹泻率（P=0.084；表1）。极差分析（表2和表3）表明DCHO的最佳组成为A1-B3-C3（AM/AP，2:1；NSP，3%；和MOS，1200 mg/kg体重），A2-B3-C3（AM/AP，1:1；NSP，3%；和MOS，1200 mg/kg），A1-B3-C2（AM/AP，2:1；NSP，3%；和MOS，800 mg/kg），分别以ADG、ADFI或仔猪腹泻率为指标。进一步的正交方差分析（表4和表5）表明，AM/AP比值和饲料NSP水平均显著影响仔猪的ADG和腹泻率（P<0.05）。
表4 各因子（DCHO类型）对猪表型影响的正交方差分析结果
2
不同DCHO成分对仔猪结肠消化物中的真菌多样性的影响为了观察DCHO组成的变化是否影响仔猪结肠真菌多样性，采用离子S5 XL平台对ITS进行高通量测序。45个消化样品共得到2116083个序列，平均每个样品得到47024±3834个序列（补充材料中的表S1）。所有的读数被分配到2825个可操作的分类单位（OTUs），隶属于13个真菌门和327个种，其中100个OTUs被所有组仔猪共享（图S1）。除观察物种和Shannon指数外，其余指标在9组间均有显著性差异（
P<0.05
；表S2，图1），来自第3组样本的
α-
多样性最低（P<0.05）（AM/AP，2:1；NSP，3%；和MOS，1200 mg/kg）。基于未加权的UniFrac距离的相似性分析（ANOSIM）表明，9组间真菌群落的
β
-多样性存在差异（R=0.203，P=0.001；图2），并且主坐标分析（PCoA）显示来自组3的样品中的真菌组成独立于其他样品（图S2）。
图1 结肠消化样品中真菌群落的α-多样性。（A）Observed species；（B）ACE；（C）Chao 1；（D）Good’s coverage；（E）Shannon指数
图2 基于未加权的UniFrac距离，使用ANOSIM计算了消化样品中真菌群落的β-多样性。R应该在-1和1之间。R>0表示组间差异显著，R<0表示组内差异大于组间差异基于所有消化物样品中的合格序列，总共注释了13个真菌门，子囊菌门和担子菌门是优势门，占总序列的50%以上（表6）。虽然结肠消化系统中这些多数菌的相对丰度在各组之间没有差异（P>0.05），但三个少数门（<0.5%）：罗兹菌门（P=0.037）、Aphelidiomycota门（P=0.001）和芽枝霉门（P=0.001）的丰度有显著差异。具体而言，第1组样本（AM/AP，2:1；NSP，1%；和MOS，400mg/kg）的罗兹菌门的丰度高于第7组样本（AM/AP，2:1；NSP，1%；和MOS，1200 mg/kg），而第3组样本（AM/AP，2:1；NSP，3%；和MOS，400 mg/kg）的Aphelidiomycota门和芽枝霉门的丰度高于其他样本（
P
<0.05）。表6 结肠消化样品中主要真菌门和属的相对丰度（%）
在较高的分类水平上，所有序列隶属于318个已知的酵母属，以Kazachstania
属
、Scheffersomyces属、Bbifigatus属、念珠菌属（Candida）和酵母菌属（Saccharomycopsis）为优势属（表6，图3）。在第3组（AM/AP，2:1；NSP，3%；和MOS，1200 mg/kg）样品中，哈萨克斯坦属最多（61.94%），但在第1组样品（AM/AP，2:1；NSP，1%；和MOS，400 mg/kg）和第2组样品（AM/AP，2:1；NSP，2%；和MOS，800 mg/kg）的丰度极低（
P
<0.05）。此外，DCHO组成也显著（P<0.05）影响了Bifigatus属、酵母属（Saccharomycopsis）、节菌属（Wallemia）、双足囊菌属（
Dipodascus
）、柯达酵母属（Kodamaea）、Tuber属和链格孢属（Alternaria）的相对丰度。
图3 仔猪结肠消化样品中真菌成分的热图（属级）。只显示前30个属。最高和最低丰度分别以红色和蓝色显示线性判别分析效应大小（LEfSe）算法显示来自不同组的消化样品中的真菌分类群有34个显著差异（LEfSe评分，>4，P<0.05；图S3）。其中，9个类群在第7组样品中富集，包括复膜孢酵母（Saccharomycopsis capsularis）、黄曲霉（Aspergillusflavus）和Wallemia canadensis，7个类群也在第3组样品中富集（AM/AP，2:1；NSP，3%；MOS，1200 mg/kg，即Kazachstania slooffiae）和第5组（AM/AP，1:1；NSP，2%；和MOS，1200 mg/kg，即Kodamaeaanthophila）。4个、2个和3个类群在分别在第1组（AM/AP，2:1；NSP，1%；MOS，400 mg/kg，即Dipodascus geotrichum），第6组（AM/AP，1:1；NSP，3%；和MOS，400 mg/kg）和第9组（AM/AP，1:2；NSP，3%；和MOS，800 mg/kg，即Saccharomycopsis lassenensis）中被发现。第2组（AM/AP，2:1；NSP，2%；和MOS，800 mg/kg）和第4组（AM/AP，1:1；NSP，1%；和MOS，800 mg/kg）只富集一个分类单元，与其他组区别。第3组样品中富集了3个分类群（Kazachstania slooffiae、Pezicula和Mucoraceae）、第5组（Kodamaea anthophila、Bifiguratus和Mucoraceae）和第7组（AM/AP，1:2；NSP，1%和MOS，1200 mg/kg；Saccharomycopsis capsularis，Aspergillus flavus和Wallemia canadensis）。值得注意的是，在第8组的样品中没有发现特别丰富的真菌分类群（AM/AP，1:2；NSP，2%；和MOS，400 mg/kg）。
虽然对单胃动物肠道真菌的研究非常有限，但人们怀疑动物肠道中发现的大多数真菌可能是食源性的。因此，我们使用SourceTracker软件来追踪结肠消化物中获得的真菌序列是否源于饮食。与在结肠消化样品中发现的不同，所有饮食样品中最丰富的真菌属是浪梗霉属（Polythrincium，24.45%）、镰刀菌属（Fusarium，3.22%）、伊萨酵母属（Issatchenkia，2.97%）、曲霉菌属（Aspergillus，2.26%）和腐皮壳属（Diaporthe，1.50%）（图S4），9种饲粮中真菌种群丰度无差异（P>0.05；表S3）。每组消化物样品中的真菌群落与相应的饮食样品完全不同（图4），并且在消化物和饮食样品中鉴定的大多数真菌物种是不重叠的（图4）。
图4 利用SourceTracker分析了不同组仔猪饮食和结肠消化物中真菌群落的对应比较。利用SourceTracker将OTU的属划分为相应的源汇。每个类别中的膳食样本被指定为来源，而消化物样本被用作汇由于SourceTracker分析表明猪结肠中的真菌种群可能不是食源性的，不同组样品中的不同真菌群落可能与DCHO组成有关。进一步的典型对应分析（CCA）表明，消化物样品中的真菌群落与三种DCHO组分（淀粉的AM/AP比，以及NSP和MOS的浓度）密切相关。根据CCA图（图5），前两个判别函数（轴1和轴2）占总变异的85.88%（
CCA
1为56.6%，CCA2为29.28%）。一般来说，在CCA图中，箭头的长度代表了一个因素（即碳水化合物比例组成）在解释微生物区系变化中的相对重要性。因此，在这里消化物样品中3种DCHO与真菌群落的相关性依次为：MOS>AM/AP>NSP。
图5 采用典型对应分析（CCA）计算仔猪结肠消化物样品中DCHO（淀粉、NSP和MOS）与真菌群落的关系。每个符号代表一个组，CCA图中的每个箭头线代表相应的因子（淀粉、NSP或MOS），每个箭头线的长度代表每个因子和真菌群落之间的相关程度。两条箭头线之间的锐角表示两个相应的环境因素之间的正相关性。相反，钝角表示负相关。轴1和轴2占总变异的85.88%，CCA1占56.6%，CCA2占29.28%Spearman相关分析（图6）显示，覆膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、Mrakia属、Wallemia属和Plectosphaerella属的相对丰度与饲料淀粉AM/AP比值呈负相关（P<0.05或P<0.01），毛壳菌属（Chaetomium）和喇叭菌属（Cantharellus）的丰度与饲料NSP浓度呈负相关（P
<
0.05），双足囊菌属（Dipodascus）的丰度与饲料MOS浓度呈负相关（P<0.01）。而曲霉菌属（Eurotium）的丰度与NSP浓度呈正相关（P<0.05），Cornuvesica属、Meyerozyma属、青霉菌属（Penicillium）和伊萨酵母属（Issatchenkia）的丰度与MOS浓度呈正相关（P
<
0.05）。
图6 主要真菌属与DCHO（淀粉、NSP和藓类）相关性的热图。热图是根据Spearman相关分析的结果创建的。正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。颜色的深度代表了相关性的程度。显著相关性用星号表示（*，P<0.05；**，P<0.01）6 不同DCHO组成饲粮对仔猪结肠消化物中糖类浓度及
CAZymes
活性的影响在前肠不能被消化的复杂碳水化合物可以被单胃动物后肠分泌相应CAZymes的微生物用作生长底物。瘤胃和环境中发现的许多真菌具有很强的分解木质纤维素的能力。因此，进一步研究了消化物样品中主要糖类和CAZymes的浓度与真菌种类丰度之间的关系。我们发现（表7）第7组样品中的果糖浓度较（AM/AP，1:2；NSP，1%；和MOS，1200 mg/kg）比第1组（AM/AP，2:1；NSP，1%；和MOS，400 mg/kg）、第8组（AM/AP，1:2；NSP，2%；和MOS，400 mg/kg）和第9组（AM/AP，1:2；NSP，3%；MOS，800 mg/kg）（
P
<
0.01）高。同时，与第1组和第9组相比，第7组的消化物样品中淀粉酶的活性也增加了（P<0.01）。第3、5（AM/AP，1:1；NSP，2%；和MOS，1200 mg/kg）和7组样品中
β-D-
葡萄糖苷酶的活性显著高于其他组（P<0.05）。相关性分析（图7）显示，曲霉菌属（Eurotium）、微囊菌属（Microascus）、青霉菌属（Penicillium）、Xerochryum属和喇叭菌属（Cantharellus）这5个真菌属的丰度与消化物样品中葡萄糖浓度呈正相关（P<0.01或0.05）。此外，覆膜孢酵母属（Saccharomycopsis）和Wallemia的丰度与β-D-葡萄糖苷酶活性呈负相关（P<0.05），而Solicoccozyma属的丰度与果糖浓度和淀粉酶活性均呈负相关（P<0.01）。表7 不同DCHO组分对仔猪结肠消化物中糖浓度和消化酶活性的影响
图7 仔猪结肠主要真菌属与糖类及糖类活性酶浓度的相关性。正相关用红色表示，负相关用蓝色表示。颜色的深度代表了相关性的程度。相关性以星号表示（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001）
DCHO不仅为动物提供热量，还影响哺乳动物肠道内的微生物群落和代谢。在过去十年，很多人研究了碳水化合物，如膳食纤维、低聚糖和淀粉对单胃动物肠道中细菌的影响。例如，曾报道与饲喂高AM/AP饲粮的生长猪相比，饲喂低AM/AP饲粮的生长猪髂骨中拟杆菌门（Bacteroidetes）和普氏菌属（Prevotella）的丰度更高。NSP还能调节猪的肠道菌群。菊粉等可溶性膳食纤维可提高双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，而IDF可以促进梭菌和真杆菌等纤维素降解菌的增殖。一些功能性寡糖如MOS也与肠道微生物群相互作用，特别是在增加盲肠中丁酸盐的浓度和拟杆菌门的丰度方面，然而DCHO和肠道真菌之间的相互作用尚不清楚。对反刍动物的许多研究表明，胃肠道中的厌氧真菌具有很强的利用复杂碳水化合物的能力。我们还报道了仔猪和成年猪后肠中不同的真菌群落，表明真菌属和细菌代谢产物、SCFAs之间可能存在密切的关系，这表明真菌可能与猪后肠中碳水化合物的发酵相互作用。值得注意的是，动物饲料中的碳水化合物是多源的，而不是单源的。因此，本研究考虑混合DCHO，尽可能模拟DCHO的自然组成。据我们所知，这是第一份关于DCHO组成和猪后肠真菌群落之间关系的报告。一般采用正交设计来筛选符合一定目标的最优组合。这里确定ADG的最佳DCHO组成为第3组（AM/AP，2:1；NSP，3%；MOS为1200 mg/kg），且该组猪的腹泻率在9组中最低。巧合的是，这些猪结肠中真菌群落的α-多样性明显低于其他猪，具有完全不同的真菌组成，由一些优势属（即Scheffersomyces和Kazachstania）和多个稀有属（即Alternaria、Tuber和Mrakia）组成。因为Q20值（读取质量的量度，表示在100个碱基中不超过一个错误的概率）处于合理的范围内（表S1），这些分析和推测是可信的。因此，这些发现可以作为DCHO组成影响仔猪结肠真菌群落的证据。如果我们将这种影响细分到每个DCHO中，MOS对结肠真菌群落的影响大于AM/AP，其次是NSP。与此相一致的是，与MOS和AM/AP相关的真菌属丰度高于与NSP相关的真菌属。有趣的是，这些属均不占优势，这表明在仔猪结肠中，这些数量较少的真菌可能对DCHO组成的变化有更大的响应。值得一提的是，根据我们的SourceTracker分析，在这些仔猪结肠中发现的真菌物种不是食源性的，这进一步证实了本研究中鉴定的真菌种类是胃肠道内的固有真菌。这为DCHO成分对结肠真菌群落的影响提供了更有力的证据。虽然饮食AM/AP和/或NSP水平对仔猪日增重和腹泻率有显著影响，宿主表型与真菌多样性及种类之间无直接相关性（数据未显示），表明DCHO组成的改变可能直接导致表型和结肠真菌群落的改变，但是真菌种群和宿主表型的相互作用需要进一步讨论。由于可能的分子构型和结构数量众多，碳水化合物是自然界中发现的最异质、最多样化的一组相关分子，这与它们在动物肠道中的利用效率密切相关。一个众所周知的例子是，高支链淀粉而非直链淀粉很容易在前肠消化。过量的直链淀粉进入后肠，成为微生物的底物。单胃哺乳动物对膳食纤维和低聚糖的利用很大程度上取决于它们的肠道微生物产生的CAZymes。瘤胃和环境中的多种真菌可分泌多种高活性CAZymes。例如，糖苷水解酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块已经从103种代表真菌的预测蛋白质组中系统地鉴定出来，这些真菌属于子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门。因此，我们检测了仔猪结肠消化物中涉及淀粉、多糖降解的酶的活性和碳水化合物的降解产物的浓度。我们发现，仔猪结肠中果糖浓度、淀粉酶和
β-D-
葡萄糖苷酶活性明显改变。一些低丰度属如Eurotium、Microascus、Penicillium、Xerochryum和Cantharellus与仔猪结肠消化物中葡萄糖浓度相关，而其他属如Saccharomycopsis、Wallemia和Solicoccozyma与β-D-葡萄糖苷酶活性相关。有趣的是，其中一些真菌和那些与碳水化合物组成有关的真菌重叠，包括Saccharomycopsis、Wallemia、Cantharellus、Eurotium和Penicillium。这些结果表明，这些低丰度真菌，而不是那些占优势的真菌，可能对猪后肠碳水化合物的利用很重要。在本研究中，子囊菌门和担子菌门被鉴定为两个优势门，占所有测序序列的40%以上，这与前人的研究一致。子囊菌门是真菌界中最大的门，由于来自不同分离株的多种高活性CAZymes在营养物质循环中起着重要作用。属于担子菌门的真菌不仅产生独特的中小分子代谢物，如苯肼、挥发性风味、偶氮颜料、抗生素和葡聚糖，而且还分泌一组特定的木质素修饰酶，使它们能够在木质纤维素上茁壮成长。这两种真菌门在仔猪结肠中的优势表明它们在猪后肠多糖的发酵和利用方面具有潜力。值得注意的是，第3组（AM/AP，2:1；NSP，3%；MOS为1200 mg/kg）仔猪结肠中的Kazachstania相对丰度较高。K.slooffiae被认为是猪胃肠道中的一种天然宿主，据报道，断奶仔猪饲粮中添加活性K. slooffiae细胞（口服，每天1次，连续3天）显著影响肠道菌群组成，从而影响宿主体内碳水化合物的代谢。综上所述，饲粮中大量的直链淀粉、NSP和甘露寡糖可能有助于增加结肠中K. slooffiae。综上所述（图8），我们的研究表明DCHO成分的改变可能触发猪结肠真菌的应答。以ADG为参考，AM/AP为2:1，NSP为3%，MOS为1200 mg/kg，可能是结肠真菌多样性最低、组成独特的仔猪的最佳碳水化合物组成，以K. slooffiae为代表。在三种碳水化合物因素中，MOS水平对结肠真菌群落的影响最大，其次是AM/AP和NSP。由此可见，真菌属与饲料中MOS水平的相关性最大。与碳水化合物组成相关的大部分低丰度真菌与结肠消化物中单糖和β-D-葡萄糖苷酶的浓度相关的真菌重叠，表明这些真菌属在后肠复杂碳水化合物的降解中可能起重要作用。以上结果提示，猪结肠内真菌对DCHO的消化利用具有不可替代的意义。由于DCHO组成的改变，真菌群落的变化可能（间接）与宿主的表型有关，这为通过塑造肠道微生物群来改变生长表型提供了一种新的思路。
图8 显示仔猪结肠真菌群落对不同DCHO组成的反应的示意图。实心箭头表示两端之间存在相关性。与DCHO、单糖或糖苷水解酶相关的真菌属以黄色突出显示真菌是单胃动物肠道中的一大类微生物，与细菌、古细菌共存，但真菌的营养意义长期以来被忽视。之前的研究发现放牧藏猪肠道中存在一个独特的真菌群落并研究了真菌种类与猪后肠碳水化合物主要微生物代谢产物短链脂肪酸之间的相关性。这些突破性的发现表明了肠道真菌和DCHO利用之间的潜在关系。然而，没有直接证据证明肠道真菌对DCHO变化的反应。本研究表明了由不同浓度的淀粉、非淀粉多糖（NSP）和寡糖模拟的不同组成的DCHO引发的猪结肠真菌群落的明显变化。本研究的结果强调了肠道真菌在单胃动物营养利用中的潜在作用。
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