IF 10.588=细菌完成图+转录组+代谢组+实验验证

细菌基因组denovo测序相关的多组学联合分析再添高分文章啦！派森诺生物与东北农业大学资源与环境学院李春艳老师携手，再次在微生物基因组领域的《Journal of Hazardous Materials》（IF=10.588）发表研究成果！文章通过细菌完成图+转录组+代谢组+实验验证，报道了莫氏芽孢杆菌XH1分泌的一种新的生物破乳草酸脱羧酶（OxdC），为OxdC作为一种新的遗传资源在生物破乳中的应用提供了新的视角。

 研究背景

生物破乳具有低毒、可生物降解性、环境友好型和天然产物的特殊性质等优点，其在石化、食品、医药等领域具有着广泛的应用。目前常用的生物破乳剂主要是细胞壁或疏水表面的小分子，这些小分析生物破乳剂通常对W/O（油包水）乳状液有良好的破乳效果，但对O/W(水包油)乳状液的破乳效果不好。此外，细胞壁上的生物破乳剂还收到细胞生长和代谢的影响，一旦细胞死亡，这些分析就会失去破乳能力。一般老说，生物大分子破乳剂比小分子生物破乳剂表现出更好的增稠性、稳定性和絮凝性。分子生物破乳剂的粘度越高，其吸附性能越好，油水界面上的吸附可以促进破乳。本研究的莫氏芽孢杆菌XH1能够分泌一种大分子生物破乳剂，但到目前为止，大分子生物破乳剂的研究还很少。

研究材料和方法

1.实验设计

2.实验材料：油田土壤中筛选得到的具有较高破乳效率的莫氏芽孢杆菌XH1一株

3.测序平台：Illumina Miseq+Pacbio

4.分析内容：细菌完成图测序、转录组测序、代谢组测序、基因敲除与互补实验、基因表达与蛋白质纯化实验、酶活实验等。

研究结果

为研究菌株XH1的生长和破乳效果，分别以葡萄糖和液体石蜡为唯一碳源，结果发现以葡萄糖为唯一碳源时，菌株生长良好，但是发酵液几乎没有破乳能力；以液体石蜡为唯一碳源时，破乳率达94%，说明碳源的不同会影响菌株XH1生物破乳剂的合成，遂对该菌株的生物破乳剂合成过程中的差异进行了研究。

对菌株XH1进行基因组测序得到一条 4,203,618 bp的染色体，GC含量43.65%，基因预测总共得到4503个基因，在COG、GO、KEGG和Swissport数据库中分别注释到3060, 2617, 2306和3996个基因。注释结果发现：基因组中有和烃类降解相关的基因，另外因为该菌株长期存在与烃类环境中，其降解烃类化合物的能力被驯化，这一研究表明细菌降解烃类化合物除了和基因有关，还可驯化有关；除蛋白质生物破乳剂外，还发现了脂肽辅助的破乳剂成分。对已知的具有破乳活性的菌株做比对发现，不同菌株产生的生物破乳剂的活性和种类均不尽相同，并且发现了对生物破乳剂的产生器决定性作用的---疏水烷烃的存在。

对菌株XH1进行转录组测序发现，OxdC基因表达差异最明显，最有可能是生物破乳相关的蛋白质，其他几种蛋白质也参与了这个过程，如孢子相关蛋白和细胞内蛋白。据报道，OxdC可以在没有信号肽的情况下分泌到细胞外，并与烷烃代谢密切相关。为了进一步验证此结果，用硫酸铵对菌株XH1分泌的胞外蛋白进行了纯化，结果发现随着硫酸铵的浓度增加胞外蛋白的破乳率也随之增加，在盐浓度为75%的时候获得目的蛋白，代谢组研究结构初步预测现有的蛋白OxdC是活性破乳蛋白之一。该蛋白由376AA组成，42,653bp，等电位点为5.16。结合转录组分析，进一步证实OxdC为破乳靶蛋白。转化实验和OxdC的敲除与互补实验，则进一步表明了OxdC参与了菌株XH1的烷烃代谢，OxdC是一种具有新功能的破乳蛋白。

为了进一步研究OxdC的结构和功能，做了如下研究：使用热重分析（TGA）评估该蛋白具有良好的热稳定性；ProtScale分析蛋白的亲水性和疏水性发现OxdC的表明疏水性相对较强；使用PyMOL对OxdC的三级结构进行预测，发现Mn2+不仅通过与邻近氨基酸的相互作用而稳定，而且通过与两个水分子形成氢键而保持稳定，这可能届时了OxdC具有破乳功能的原因。

因为菌株XH1在不同碳源下的破乳剂产生情况不一致，故分别对以葡萄糖和液体石蜡为唯一碳源时的代谢途径进行了比较。当以液体石蜡为唯一碳源时，烷烃通过氧化转化为醇、醛和酸，氧化脂肪酸进入脂肪酸循环，经β氧化生成乙酰辅酶A；乙酰辅酶A进入三氯乙酸循环，生成草酰乙酸酯；草酰乙酸酯经过乙醛酸和二元酸代谢，生成乙醛酸。草酰乙酸还可以通过乙醛酸氧化酶的活性直接水解生成OA，在酸性条件下生成OA脱羧酶(OxdC)，将OA降解为水和CO2。菌株XH1以葡萄糖为底物时pH相对稳定，不产生OA或诱导OxdC产生，在这种情况下没有破乳，而当使用液体石蜡作为底物时，可以观察到有效的破乳。

研究结论

本研究报道了莫氏芽孢杆菌XH1分泌的一种新的生物破乳草酸脱羧酶(OxdC)，全基因组比较表明，具有较高破乳效率的菌株均具有烷烃降解基因。对不同底物诱导的差异表达基因和蛋白的分析表明，XH1分泌的OxdC是一种有效的破乳剂。并通过原核基因表达、基因敲除和互补分析验证了其破乳能力。XH1的OxdC具有较强的破乳能力，其破乳能力明显优于模式蛋白枯草芽孢杆菌168OxdC(Yvrk)。通过对其结构特征的比较，确定OxdC表面的疏水氨基酸是XH1良好破乳活性的关键因素。XH1的代谢途径以液体石蜡和葡萄糖为底物，说明碳氢化合物是生物破乳剂分泌所必需的。这一研究结果为XH1资源的开发利用提供了重要参考，不仅对石油污染治理有一定的参考价值，而且对食品、医药等行业也有一定的参考价值。因此，具有广泛的生态、社会效益和经济效益和应用前景。

本研究的细菌完成图测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。

文章索引：Hou, Ning & Wang, Qiaoruo & Sun, Yang & Li, Xianyue & Song, Qiuying & Jiang, Xinxin & Li, Baoxin & Zhao, Xinyue & Zang, Hailian & Li, Dapeng & Li, Chunyan. (2021). A novel biodemulsifier of Bacillus mojavensis XH1–Oxalate decarboxylase with the potential for demulsification of oilfield emulsion. Journal of Hazardous Materials. 407. 124737. 10.1016/j.jhazmat.2020.124737.

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