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科研 | Environ. Microbiol.：环境溶解DNA包含了微生物群落结构的重要生物信息

2021

08/12

微生态

A-

A+

胞外DNA（eDNA）由细胞外所有DNA分子组成。微生态系统的这一组成部分可以作为营养和遗传信息的来源。

编译：微科盟道友留步，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

胞外DNA（eDNA）由细胞外所有DNA分子组成。微生态系统的这一组成部分可以作为营养和遗传信息的来源。高盐环境中的eDNA浓度是自然系统中最高的，这一现象可归因于盐的物理化学防腐作用和高病毒丰度。在本文中，我们比较了从太阳能盐场结晶池（CR30）水样中，采用离心和过滤两种方法提取溶解DNA（dDNA，与eDNA不同的是，eDNA还包括游离病毒DNA）的异同。本文首次对结晶dDNA片段进行了表征，并与同一位置的细胞和病毒宏基因组进行了比较。由于细胞裂解，高速离心影响了CR30-dDNA的浓度和组成，表明dDNA提取方案优化应是dDNA研究的第一步。相比之前报道的高盐缺氧沉积物，本研究的结晶dDNA的浓度更低，其混合了病毒和细胞来源，富含古细菌DNA，与同一样本的细胞组合相比，具有独特的分类组成。生信分析表明纳米盐古菌（nanohaloarchaeal）病毒可能是造成这些差异的原因。

论文ID

原名：Environmental dissolved DNA harbours meaningful biological informationon microbial community structure

译名：环境溶解DNA包含了微生物群落结构的重要生物信息

期刊：Environmental Microbiology

IF：5.491

发表时间：2021.4

通讯作者：Fernando Santos

通讯作者单位：阿利坎特大学生理学、遗传学和微生物学系

实验设计

1. 取样地点和样品处理：2019年5月，从位于西班牙阿利坎特圣波拉的CR30结晶器中采集了10升高盐水样。盐度为37%，用手动折射计进行现场测量，采样时的温度和pH值分别为26.5℃和7.11。样品在4℃下储存，直至处理。

2.溶解DNA纯化：用两种不同的方法纯化CR30-eDNA（图1），即离心后过滤（“C”方法，产生CdDNA）或单独过滤（“F”）（FdDNA）。C方案用于去除细胞和获取eDNA。第二个方案仅包括通过2、0.22和0.1μm滤器连续过滤5L高盐水过滤器。最后使用Amicon Ultra 100 kDa装置将CdDNA和FdDNA样品脱盐并浓缩至最终体积为15 ml。使用Qubit2.0荧光计和dsDNA高灵敏度试剂盒对dDNA组分中的核酸浓度进行定量。凝胶电泳测定CdDNA和FdDNA的尺寸范围。

3. 微生物和病毒DNA提取：应用Mutlu et al. (2008)描述的方案进行胞内DNA提取（iDNA），用341F和805R引物对两种iDNA的16S rRNA基因进行了部分扩增, 产物用Qiime分析；使用Santos等人（2010）中描述方案提取病毒DNA（vDNA），通过脉冲场凝胶电泳检查vDNA的大小范围，使用古菌16S rRNA基因引物进行PCR检查，所有提取的DNA用Qubit2.0定量。

4. 变性梯度凝胶电泳（DGGE）:用DGGE分析比较了iDNA、CdDNA和FdDNA中16S rRNA基因的表达谱。所有DNA均用引物对341fGC-907r（细菌）和344fGC-907r（古菌）进行PCR扩增;纯化PCR产物并使用Nano DropND-1000分光光度计进行定量；在60℃、70v的D-编码系统（Bio-Rad）中进行16h的电泳。最后，凝胶用10倍SybrGreen染色15分钟，用milli-Q水（2×15分钟），并在Typhoon 9410图像分析仪中可视化；对CdDNA、FdDNA、iDNA和vDNA样品的总DNA进行测序；获得的宏基因组之间的相似性通过self-BLASTN比较进行估计；读取的GC含量分布是通过定制Linux命令和RNAscan获得的；用BLAST法检测iDNA和FdDNA中的病毒序列，并与vDNA的读长进行比较；为了确定2019年5月采集的CR30样本中估计的病毒活性和丰度是否在结晶器中常见，构建了ORFs开放阅读框。文中所有原始序列数据集已上次NBCI数据库，生物项目登记号为PRJNA713327。

图1 用于从CR30结晶器中纯化不同DNA组分的工作流程示意图。CdDNA，用离心法获得的溶解DNA；dDNA，溶解DNA；eDNA，胞外DNA；FdDNA，溶解DNA，采用过滤法获得的溶解DNA；iDNA，细胞内DNA（来自细胞颗粒）；vDNA，病毒DNA。

结果与讨论

1 离心法诱导dDNA研究中出现人为误差

用两种不同的方法去除细胞，得到CR30水样品中的dDNA：高速离心+过滤（“C”方案）或连续过滤步骤（不离心）（“F”方案）（图1）。方案C的dDNA回收量较高（以下简称：CdDNA，19.04 μg l⁻¹）而F方案较低（以下简称：FdDNA，μg l ⁻¹），这一结果表明，高速离心可能会导致偏差（图2A）。这些dDNA值低于先前报道的深层高盐缺氧沉积物（338 ng g⁻¹-343ng g⁻¹），但与海洋环境相似（贫营养海洋为0.03 μg l⁻¹，中等营养的河口为44 μg l⁻¹）和淡水环境也相似（0.5-25.6 μg l⁻¹）。然而，这些小心对待这些公布的数据，因为不同的研究往往采用不同的技术定量DNA，在一些研究中，游离病毒DNA没有从dDNA池中分离出来，因此病毒衣壳内的DNA也被错误地认为是dDNA部分的一部分。

图2 CR30溶解DNA（dDNA）的主要特征。A.CR30-dDNAs的浓度：顺序过滤（F样品）、离心+过滤（C样品）。B.溶解DNA组分的电泳。箭头表示存在高分子量（>20kb）的DNA条带。

通过电泳评估了CR30 CdDNA和FdDNA的片段尺寸，结果表明主要为0.5-1.5kb的核酸。此外，还观察到较大尺寸的dDNA，可能对应于病毒基因组、质粒或染色体片段（图2B）。这些结果与在2016年12月采集的CR30结晶样品分析结果类似（数据未展示）。这些dDNA的尺寸与海水中观察到的更为相似（范围为0.12-35.2kb，小片段占优势），而与淡水区别较大（0.1 to 0.5 Kb）。CdDNA包含的片段比FdDNA片段中的片段稍小，后者显示出更大的DNA量（见图2B中的箭头）。这种差异可能部分是由于离心造成的细胞损伤和随后释放的胞内核酸酶引起的，这些核酸酶可以主动降解溶解的DNA。

为了更深入地探讨不同方法对dDNA回收率的影响，通过16Sr RNA基因DGGE图谱测定CdDNA和FdDNA中DNA的起源，并与CR30细胞组分（以下简称iDNA，来自细胞内DNA）的起源进行比较。古细菌DGGE-iDNA模式与在CdDNA和FdDNA中发现的模式相同（图S1）。然而，细菌引物未能扩增两个dDNA组分中的16Sr RNA基因。这一结果表明，如果存在，来自细菌来源的溶解DNA低于标准PCR的检测限，并且表明细菌细胞比它们的古细菌对应物更耐高速离心诱导的损伤。值得注意的是，通过离心（CiDNA）和过滤（FiDNA）收集的细胞组分的组成几乎相同，正如通过16S代谢物编码估计的结果（图S2）。

为了更好地描述FdDNA和CdDNA，进行宏基因组学研究。为此，对CR30衍生的FdDNA、CdDNA、iDNA和vDNA（来自病毒DNA）部分进行测序（表1）。Nonpareil分析表明，测序深度(表1)高于60%的推荐阈值，可以建立不同数据集之间的比较，并获得有意义的、无偏倚的生物学结论。然后，将CdDNA和FdDNA读长与来自iDNA和vDNA宏基因组的读长进行比较。BLASTN PCA分析表明，iDNA更类似于CdDNA而不是FdDNA（图3A和B）。这种聚类也与不同宏基因组（vDNA除外）的分类学组成具有良好的一致性，无论是考虑到所有的宏基因组读长还是仅考虑16S rRNA基因读长（图4）。事实上，根据16S rRNA基因宏基因组图谱，三个组分中最丰富的属是Haloquadratum，其在CdDNA中的比例（57%）比在FdDNA组分中的比例（42%）更接近iDNA中的比例（63%）（图4A）。此外，最丰富的CR30细菌S. ruber，在iDNA中被检测到（2%），但在CdDNA中（0.6%）显示出较低的丰度，而在FdDNA中则没有。这一结果可以解释上述细菌PCR产物的缺失，也与我们之前的分析结果（数据未展示）一致。基于非16S宏基因组读取的分类图谱也获得了类似的结果（图4B）。

表1 本研究分析的宏基因组的一般特征。

图3 本研究中获得的所有宏基因组的基于BLASTN的比较。A.共享序列的主成分分析（对齐覆盖）≥ 70%）。共享读取的百分比用粗体表示，而括号表示共享序列的平均标识。B.亚基因组中相同序列的主成分分析（比对覆盖率100%，同一性100%）。数字表示相同读取的百分比。

图4 在细胞宏基因组中发现的属以及的溶解DNA组分（FdDNA和CdDNA）。A. 基于16S rRNA基因读长；B. 基于读长总数。粉红色，Halobacterota，Halobacterales，Haloferacaceae。红色，Halobacterota， Halobacterales，Halomicrobiaceae。绿色，Nanohaloarchaeota. 1 : Haloquadratum;2: Halonotius，3 : Halorubrum，4 : Haloparvum，5 : Halopiger，6 : Halobellus;7: Uncultured Halo-feracaceae; 8: Halomicrobium，9:Halomicroarcula，10:Salinibacter，11:Candidatus Nanosalina，12:Candidatus Nanosalinarum; 13:NanohaloarchaeonSG9，14:Unclassified Nanohaloarchaeota，15: Others(< 0.5% each)，16:Unclassified，17: Haloferax，18:Haloarcula，19:Unclassified Halobacterales，20: Viruses。

所有这些数据表明，高速离心不仅可能使CR30-dDNA的数量产生偏差，而且也可能使其组分产生偏差，这极有可能是某些古菌盐菌群发生了部分裂解。离心诱导的细胞膜性质的变化，以及随后的细胞活力的变化，以前已经在纯培养中观察到。我们的数据显示，应用30000×g离心去除细胞影响了Haloquadratum CR30群落，其在CdDNA中的丰度比在FdDNA中高15%。这种现象可能是由于特定的细胞壁特性造成的，并与先前的实验观察结果一致，即盐水稀释和随后的渗透冲击导致以Haloquadratum为主的CR30古细菌群落数量急剧减少。

为了验证离心诱导的细胞损伤是否限制在30000×g或是否它与施加的离心力无关，用CR30水样测试不同的离心速度：30000×g、 20000× g、 9000× g和5000×g。按照方案C处理获得的上清液，并与方案F进行比较。测定回收的dDNA的量、上清液中剩余细胞的百分比以及eDNA组分中的病毒浓度。如预期的那样，使用30000×g和20000×g离心力可获得最高的dDNA回收率（图S3A）。使用较低离心速度（9000×g和5000×g）获得的dDNA数量更类似于通过F方案获得的，尽管复制品的变异性更高（图S3A），可能是由于细胞留在其相应的上清液中造成的（图S3B）。此外，离心样品上清液中VLPs的数量高于F方案（图S3C）。因此，离心力≥ 20 000×g造成细胞损伤，导致增加dDNA量增加，而≤ 9000× g产生了高细胞和病毒浓度的上清液，其对方案下游步骤的影响无法预见。因此，正如近期Linney等人（2021年）建议的那样，我们建议顺序过滤法是研究CR30 dDNA的最合适方法。然而，由于我们的结果仅用CR30结晶器中的水样进行了测试，因此无法评估不同环境样品中含有不同微生物组合的离心效果是否相同。因此，基于我们的观察，我们推荐一个特别的优化方案来研究环境溶解DNA。

2 CR30溶解DNA（FdDNA）的表征

如前所述，CR30结晶中溶解DNA的浓度约为10.3%μg l，并显示出低分子量。CR30结晶的iDNA典型双峰曲线显示出50%左右的主要GC色谱峰，与Hal- oquadratum有关，而较低的高GC峰与S. ruber和一些盐古菌如Halonotius或Haloruum相关。然而，宏基因组FdDNA读长的GC含量分布介于这条典型双峰曲线和vDNA曲线之间，呈现相反的趋势(图5A)。这一现象表明，FdDNA应该包含来自细胞和病毒来源的DNA片段，这一点被FdDNA宏基因组序列的分类鉴定所证实(图4B)。

图5 FdDNA的特性。A.CR30细胞宏基因组（iDNA）、宏病毒组（vDNA）和溶解DNA组分（FdDNA）的GC含量分布。B.过多FdDNA ORFs的分类学从属关系。C.与iDNA相比，FdDNA中orf的丰度过高。

尽管大多数FdDNA读长被分配到Haloquadratum，大部分读长 (20.4% 16 s rRN基因读长和总读长的2.5% (表S1和S2)隶属于Nanohaloarchaeota—具有小基因组的未培养小微生物门与低至中等GC值，其在FdDNA中的比例高于iDNA的比例(分别为2.8%和0.7%；表S1及S2)。为了排除纳米盐古菌细胞的可能性（由于其估计的小尺寸，可能已经通过了用于去除细胞的过滤器），通过TEM发现，用于提取FdDNA的CR30过滤浓缩液中并不存在纳米盐古菌细胞。由于没有观察到细胞，与细胞宏基因组相比，FdDNA中纳米盐古菌序列的较高比例被证实是自然的，而不是人工的。

迄今为止，dDNA在水生环境中的主要功能是作为N和P的来源，以及作为水平基因转移(HGT)的载体。Chimileski等人在2014年测试了浓度为50-250 mg l⁻¹dDNA在Hfx. volcanii中的营养作用，这一浓度比CR30结晶中估计的浓度(10.3 μg l⁻¹)高3-4个数量级，与深层高盐缺氧沉积物的估计浓度相近(338 ng g⁻¹ ~ 343 μg g⁻¹)。在HGT的情况下，短DNA片段能够转化非盐性细菌Acinetobacter baylyi，即使浓度低至10 ng l⁻¹。大多数CR30溶解DNA来源于古菌这一事实意味着细菌dDNA可能不太适合转化，即使细菌到古菌HGT事件在自然界中明显发生，如先前文献所述。我们的观察结果与Fuchsman及其同事所描述的观点一致，他们指出，在极端系统中，从古菌到细菌的水平基因转移比细菌到古菌HGT事件更为主导。我们的分析也与先前的研究一致，这些研究表明，在盐古菌的进化过程中，古菌到古菌HGT是经常发生的。另一方面，在太阳能盐场中，微生物群落暴露在高水平的紫外线辐射下，dDNA也可以作为吸收这种有害光的紫外线保护剂，正如我们通过使用在CR30结晶中估计的dDNA浓度范围内的dDNA进行实验测试（图S4）。然而，其他不同于溶解DNA的分子（即溶解色素）也有助于将紫外线照射的影响降至最低。

为了确定溶解的DNA是否富含编码特定功能的基因，与iDNA相比，对所有超过50个氨基酸的FdDNA开放阅读框（ORF）进行了搜索。它们在FdDNA、iDNA和vDNA宏基因组中被量化，如果它们的丰度是iDNA的五倍，并且在vDNA库中不存在，则被认为在FdDNA中的比例过高。根据这些标准，发现10467个FdDNA ORFs（0.4%）过度表达，并进行了进一步分析。在分类学上，主要与Candidatus Nanosalina有关（17%；Narasingara等人，2012），未培养的古菌J07HB67（16%；Podell等人，2013年），Halorubrum（10%）和Haloquadratum（7%）（图5B）。在功能上，34.2%为假设蛋白，26.5%为保守假设蛋白，29.8%为低丰度功能蛋白（<0.2%）。其余的功能性ORFs参与DNA代谢（3.8%）、细胞表面蛋白（2.9%）和质粒（2.2%）（图5C）。为了探索这些与质粒相关ORFs的起源，针对所有iDNA和FdDNA宏基因组读长，从已测序的盐原核生物中拾取了96个质粒。只有Hqr. walsbyi DSM 16790的PL47质粒（从CR30池中分离的菌株），完全被宏基因组学读长覆盖（图S5）。然后，为了确定FdDNA中的质粒/染色体比率是否高于iDNA中的质粒/染色体比率，计算了整个Hqr. walsbyi DSM 16790及其五个管家基因的丰度，并将其与来自PL47质粒的那些进行比较（图S5）。计算的Hqr。在溶解的DNA池中，Hqr. walsbyi质粒/染色体的比率大约是细胞宏基因组中的两倍。我们可以假设，胞外环境中质粒的丰富性可能是由于质粒对核酸外切酶的固有抗性或作为自由分子的活性释放或通过囊泡引起的。虽然未获得宏基因组组装质粒（MAPs）（很可能是由于其遗传微多样性和可塑性），但电泳dDNA揭示了低迁移率DNA条带的存在，这些条带可能对应于这些分子。

最后，FdDNA中病毒读长的分类学联系（占总FdDNA读段的27%，表S3）表明一组磷化物衍生的卤代病毒基因组（与Hqr. walsbyi有关）是已经描述的卤代病毒中最丰富的，其次是其他“环境卤代噬菌体”（eHPs）和纳米盐古菌病毒1（NHV-1），通过结合单细胞基因组学和微阵列（Mart）在CR30结晶器中发现。为了检索有关病毒衣壳稳定性的信息，获得了每个已发表的卤代病毒基因组的vDNA/FdDNA标准化比率（表2）。所有的EHqrV-1和ePH在病毒组分中比溶解的DNA池中更为丰富（2倍以上），这表明它们的衣壳在自然条件下非常稳定，或者从感染细胞中产生的衣壳超过了它们的衰变。相反，具有较低vDNA/FdDNA比率的纳米盐古细菌NHV-1可能具有较不稳定的衣壳（表2）。然而，必须强调的是，其他因素可以解释vDNA/FdDNA比率的差异，如病毒感染率或病毒DNA的降解。

表2 两个CR30样本中不同宏基因组中最丰富描述的盐病毒的定量（展示了2014年11月的转录组数据。丰度用粗体表示，由宏基因组和参考基因组大小标准化的招募核苷酸。括号中提供了每个招募基因组的百分比（覆盖率））

3 病毒对溶解DNA池的影响

与iDNA相比，FdDNA中纳米盐古菌序列的比例更高，这可能是由于DNA主动释放到细胞外培养基、细胞裂解率高（由病毒或抗菌化合物（如卤素）诱导），或两者兼而有之。为了确定纳米盐古病毒是否能够塑造溶解的DNA池，我们通过从CR30元基因组(iDNA)中检索它们的相关读长来估计CR30样本中NHV-1病毒的活性。这些序列代表在宿主内活跃复制的NHV-1病毒，占iDNA读数的0.042%（表S4）。当该值与相应的基因组大小进行标准化时，在所有先前描述的盐病毒中，NHV-1是iDNA中最丰富的病毒群（表2）。其他丰富的病毒包括eHP-6、eHP-12、eHP-16和eHP-36。

NHV-1病毒不仅在iDNA样本中大量存在，而且在同一池塘的另一个宏基因组中也大量存在（2014年11月获得；Ramos Barbero等人）及其相应的转录组中，其分析表明NHV-1病毒的活性表达比例高于任何其他已报道的盐病毒（表2）。事实上，在发现Nanohaloarchaeota之前，几年前从CR30结晶获得的病毒转录组表明，与NHV-1密切相关的病毒是结晶微生物群落中最活跃的病毒之一。出乎意料的是，以纳米盐古菌病毒NHV-1为代表的群体比与Hqr.walsbyi相关的病毒更活跃，考虑到纳米盐古菌的丰度与“方形”古菌相比较低。如果我们考虑一些Nanohaloarchaeota对宿主的依赖性，这一事实就更有趣了，因为如果游离的纳米盐古菌不能自己分裂，病毒复制也可能受到影响。

总之，所有这些数据都支持了纳米盐古细菌病毒的活性可能有助于形成CR30溶解DNA的分类组成的假设，并强调了dDNA作为一种强有力的分析工具的研究，以更好地理解环境中发生的生物过程。

结论

细胞内DNA和病毒DNA是微生物分子生态学家最为关注的问题。然而，对溶解DNA组分的研究有助于阐明生态系统的动态和演化，在生态学研究中应被视为相关的。然而，分离溶解的DNA必须尽可能小心，从优化每种样品的方案开始。对于高盐水样，过滤是去除细胞的最合适策略，可避免细胞损伤和不可恢复的输出。在这里，对高盐环境（Santa Pola salterns的CR30结晶池）中的dDNA的研究表明，它由细胞和病毒DNA组成，其比例与在细胞内或病毒DNA池中发现的比例不同，并为纳米盐古菌病毒的活性提供了线索。此外，实验证据支持dDNA能够作为紫外线保护剂的新功能。