微核糖核酸参与疼痛调控的研究进展

【综述】

微核糖核酸（microRNA, miRNA）是一类由20~24个核苷酸构成的短链非编码RNA分子，主要参与基因表达调控，在转录后水平发挥作用。miRNA最初于1993年在秀丽隐杆线虫miRNA‑信使核糖核酸（mRNA）相互作用的研究中发现，随后在哺乳动物miRNA表达研究中发现与组织类型密切相关 。miRNA是进化过程中保持高度保守的小分子单链RNA，主要引起mRNA的降解加速和（或）翻译抑制。miRNA通过约束带有互补位点的目标mRNA 3'非编码区的前体来发挥其监视作用。一个miRNA就可以调控成百上千种mRNA。目前已经在人类基因组中发现了700种不同的miRNA，通过不同的表达方式广泛参与生物体生长、发育、凋亡等生理或病理过程。近年来发现，人体miRNA水平改变与多种疾病（如炎症反应、脓毒症、缺血/再灌注损伤和癌症等）存在确定的联系 。围手术期不同病理生理状态的患者在伤害性因素刺激下，可能会改变机体miRNA水平并与术后不良事件相关。本文将重点阐述miRNA在动物和人体疼痛控制方面的研究进展。

miRNA的合成始于细胞核，miRNA自身成熟受到时间和空间方面的严密调控。miRNA主要作为负调节子参与基因表达的调控。miRNA可与3'非翻译区和5'非翻译区甚至编码区结合，但更倾向于与目标mRNA的3'非翻译区结合，进而对下游编码区域发挥调控作用。因3'非翻译区常不翻译表达蛋白质，故仅影响转录后过程及其基因表达 。miRNA‑mRNA碱基配对可阻止目标mRNA编码合成蛋白质的进行，并且这种调节功能不需要miRNA和目标mRNA之间严格的碱基配对。因此，单个miRNA可以靶向调节许多不同的mRNA引起其功能的变化，而一个目标mRNA也可以被多个不同的miRNAs所抑制 。目前认为miRNA介导的基因沉默在mRNA水平和蛋白合成水平亦参与调控，需要指出的是miRNA‑mRNA相互作用是一个非常复杂的网络，人类约60%以上的基因表达都受到miRNAs的精细调控。

理论上，miRNA可作为一种围手术期非常有价值的生物学标志物，但目前尚无有效测定miRNA的简便易行、快速高效且可靠价廉的方法，加之miRNA家族的高度同源性和在体液中的绝对浓度极低，造成其测定困难。因而，miRNA的临床应用尚处于初步阶段，主要集中于动物实验研究。本文将重点阐述miRNA在切口疼痛、神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）和内脏疼痛的改变和变化趋势对疼痛治疗的价值及miRNA治疗疼痛的潜在前景。

2.1　miRNA与切口疼痛

外科手术疼痛模型和吗啡诱导痛觉过敏与耐受模型研究中均发现神经末梢、背根神经节（dorsal root ganglion， DRG）和脊髓等部位多种miRNA表达发生显著改变。

在切口引起的疼痛中，很多参与炎性反应调节的miRNA均发生了变化。如miRNA‑203在大鼠后爪的切割损伤发生后出现降低，且在术后2 h即发生变化并持续48 h，大鼠足趾内miRNA‑203水平与组织内磷酸二酯酶A2活化蛋白的水平之间呈负相关 。进一步研究发现大鼠足趾内预先注射miRNA‑203可有效逆转磷酸二酯酶A2活化蛋白的高表达。采用骨关节炎外科手术模型，发现脊髓和DRG神经元中miRNA‑146和miRNA‑183水平明显下降。同样，小鼠炎性疼痛模型中也发现miRNA‑16、miRNA‑124‑3和miRNA‑141的表达下调，并伴随IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的mRNA表达上调。鞘内注射miRNA‑16、miRNA‑124‑3和miRNA‑141类似物可以显著缓解弗氏完全佐剂引发的炎性疼痛 ，提示这些miRNA表达下降会促使炎症发生，具有潜在抗炎效应。

镇痛药物对miRNA的表达也有影响，腹腔内注射加巴喷丁可降低脊髓DRG神经元中miRNA‑15a水平并部分逆转其机械性痛觉过敏 。在炎性疼痛模型中，将miRNA‑124与布洛芬微颗粒混合注射较单独注射布洛芬微颗粒更能降低炎性反应，通过Western blot 分析发现联合使用时动物关节滑液组织中NF‑κB的激活程度降低 。这些研究提示miRNA参与术后疼痛的调控，但作用机制需要进一步明确。外科手术后切口疼痛是多种因素的综合结果，减轻局部组织损伤，降低炎性反应，抑制中枢疼痛敏化是减轻疼痛的重要环节。miRNA参与术后疼痛调节，但miRNA预先或超前用于术后切口疼痛的控制仍需要很长时间。

2.2　miRNA与NP

DRG神经元和三叉神经节神经元是处理NP信息的主要部位，其神经元功能改变参与慢性NP的发生和维持。miRNA可通过炎症、自噬和离子通道改变等环节参与NP形成。此外，不同类型周围神经损伤（包括神经横断、慢性压迫性神经损伤、选择性神经损伤和脊髓神经结扎）发生后，微阵列和全基因测序分析均证实DRG神经元中的miRNA表达水平发生明显变化 。

miRNA在DRG神经元的变化趋势与外周神经损伤的类型明显相关。坐骨神经部分结扎损伤后，miRNA‑1在DRG神经元中的表达下调，而坐骨神经轴索横断损伤则miRNA‑1表达上调 。腓肠神经损伤则出现miRNA‑1在DRG神经元中的表达下调，而胫神经损伤却使miRNA‑1在DRG神经元中的表达上升 。这提示miRNA‑1的表达变化与损伤的部位相关，但具体的机制不十分明确。

miRNA‑21是免疫系统和心血管疾病中发挥生理作用和病理调节功能的重要分子。神经损伤发生后DRG神经元中几乎所有神经元中miRNA‑21表达均持续上调。鞘内给予miRNA‑21抑制剂可以降低晚期癌症NP严重程度 。在DRG神经元中，miRNA‑21参与神经元损伤和NP的细胞反应，体外实验表明miRNA‑21可增强DRG神经元的轴突生长，抑制DRG神经元的凋亡，提示miRNA‑21有助于神经损伤后的功能恢复 。

炎症是引起疼痛的常见致病因素，在外周和中枢水平导致NP发生，并通过一系列miRNA表达进行调节。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）氧化酶4是一种重要的促炎因子，在NP小鼠模型中过度表达后能上调脊髓炎性介质IL‑1β、TNF‑α和环氧合酶‑2水平，而NADPH氧化酶4抑制剂则可以显著降低这些炎性介质的浓度。进一步深入研究发现miRNA‑23b可明显降低NP小鼠NADPH氧化酶4的基因表达，并提高小鼠缩足反射阈值。其机制是miRNA‑23b在脊髓背角部位抑制NADPH氧化酶4的表达，降低炎性介质和活性氧自由基谷胱甘肽过氧化物酶介导的细胞凋亡，从而缓解NP 。在慢性压迫性神经损伤大鼠模型中，miRNA‑155抑制剂可降低大鼠的NP，经过实时定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附实验分析，miRNA‑155降低脊髓IL‑1β、TNF‑α和环氧合酶‑2水平，还发现miRNA‑155直接靶向调节炎症相关的基因SOCS1，且抑制miRNA‑155引起大鼠脊髓小胶质细胞中细胞因子信号抑制因子1的上调，进而抑制NF‑κB和p38丝裂原激活蛋白激酶信号通路 。

自噬是NP的重要调节因素，外周神经损伤后在脊髓水平出现自噬异常，鞘内注射自噬抑制剂氯喹，可减轻机械痛觉过敏 。miRNA‑195能抑制ATGI4基因mRNA的表达，调节自噬介导的神经炎症和NP。而miRNA‑195水平增加会引起小胶质细胞中IL‑1β、TNF‑α和诱导性一氧化氮合酶等神经炎症介质浓度增加，降低机械性痛阈和热缩足潜伏期，增加疼痛的敏感性 。

周围神经病变引起的NP与离子通道的过度表达相关，离子通道过度表达与miRNA簇存在直接联系 。miRNA‑182‑96‑183是一个miRNA簇，包括3个不同的miRNA（miRNA‑182、miRNA‑96、miRNA‑183），在基因位点中相互靠近，被转录成单一的初级转录子，在DRG神经元中呈现高度表达，而脊髓神经结扎后其在DRG神经元中则表现为下调 。外周神经损伤后测定miRNA‑96表达情况，结果发现损伤同侧DRG神经元中miRNA‑96水平降低，而离子通道蛋白Nav1.3水平升高。鞘内注射miRNA‑96可降低慢性压迫性神经损伤诱导的NP症状，这与抑制Nav1.3蛋白及其mRNA表达有关 。同样，鞘内给予编码miR‑183的慢病毒载体可以抑制Nav1.3和脑源性神经生长因子mRNA表达，并减轻NP 。此外，有研究表明miRNA‑7a过表达虽对急性疼痛和慢性炎性疼痛阈值无影响，但能抑制DRG神经元超兴奋性，提高NP晚期的机械性痛阈，减轻热痛觉过敏，主要作用于编码电压门控性钠通道β亚基的mRNA，增加NP后期的电压门控性钠通道β亚基蛋白表达，显著降低机械性痛和热痛觉过敏的发生 。

2.3　miRNA与内脏疼痛

内脏疼痛的显著特点是病因复杂和定位不准确等。机体组织在伤害性损伤刺激的作用下会引起神经递质、离子通道和蛋白表达的变化，造成外周和中枢敏化形成。miRNA可在转录后和翻译水平引起神经递质、离子通道和蛋白质等在外周和中枢部位调节发生异常，最终造成对疼痛信息的处理发生异常和内脏疼痛的高敏感性。目前有很多内脏疼痛的研究集中于miRNA对突触可塑性变化和疼痛信息处理的影响，主要涉及部位包括海马神经元、纹状体背侧神经元和前额皮质神经元等，采用的动物模型有慢性压迫性神经损伤、选择性神经损伤和脊髓神经结扎等。

miRNA在突触水平参与大脑局部蛋白质的生物合成并调控神经元的活性，对内脏疼痛的信息处理发挥十分重要的作用。成熟的单链miRNA通过互补序列结合到目标mRNA的3'非翻译区引起翻译终止或mRNA降解加速是中枢神经系统基因表达的主要调控环节，包括神经发育、分化和突触重塑等。据报道，一些神经递质、离子通道和蛋白质等在外周和中枢部位调节发生异常被认为是引起慢性疼痛的常见原因。脑源性神经生长因子是伤害性感受刺激的重要调节因子。研究表明脑源性神经生长因子能诱导皮质神经元中miRNA‑132表达上调，进而增加树突状细胞在疼痛信号传递通路中的分化和发育，造成疼痛信号传递频率增加 。因此，有理由认为miRNA介导的转录后调控在疼痛信息加工处理过程中发挥作用。

肠易激综合征常引起不同程度的疼痛，结肠组织和血液微泡中miRNA‑29a水平增加可提高此类患者肠道黏膜的通透性。其机制是miRNA‑29a与谷氨酸氨连接酶基因3'非翻译区互补位点结合，引起谷氨酸合成酶表达下降，导致肠道通透性增加，形成慢性内脏疼痛。在膀胱疼痛综合征患者，膀胱组织活检中发现miRNA‑328、miRNA‑320、miRNA‑449b和miRNA‑500等表达的增加与神经激肽‑1受体下调直接相关 。随后细胞模型研究发现，神经激肽‑1受体长期暴露在P物质环境中会导致神经激肽‑1受体mRNA表达下降，同时miRNA‑449b和miRNA‑500水平增加。这些miRNA分子对神经激肽‑1受体的调节可能是膀胱疼痛综合征患者尿路上皮通透性增加和膀胱疼痛的潜在分子机制。Zhou等 进一步证实miRNA‑199a‑5p与膀胱疼痛综合征尿路上皮渗透性之间确定的联系，即高度表达miRNA‑199a可破坏尿路上皮细胞紧密连接的形成，引起上皮细胞通透性增加。

miRNA介导的转录后调节还参与大鼠膀胱炎后脊髓γ‑氨基丁酸能系统（γ‑gamma‑aminobutyric acid, γ‑GABA）功能的变化 。大鼠出生14~16 d后膀胱内注射酵母聚糖诱导新生大鼠膀胱炎，发现L6−S1脊髓背角中miRNA‑181a表达明显上调，目的基因分析发现miRNA‑181a位于GABA受体亚单位GABAAα‑1基因的多个互补结合位点。新生大鼠发生膀胱炎后成后miRNA‑181a增加会引起大鼠成年后脊髓背角部位GABA Aα‑1亚单位基因和蛋白表达的长期下调。这些研究表明miRNA介导的脊髓部位基因转录调控可能是导致慢性膀胱炎患者内脏疼痛敏化的主要原因。生物信息学技术分析提示miRNA‑181a携带GABA受体亚单位基GABA Aα‑1的3'非翻译区多个互补结合位点 ，并且荧光素标记实验进一步证实miRNA‑181、miRNA‑216和miRNA‑203是GABA基因的目标miRNA。新生大鼠出生后7~14 d，食管经受酸性物质刺激后，miRNA参与大脑皮质突触可塑性变化，以缓解酸性物质损伤引起的疼痛，但具体机制不明确。大鼠生长60 d后，应用二代测序和实时定量PCR测定显示脑皮质突触神经体中miRNA表达，在食管进行酸处理后，脑皮质突触神经体中miRNA‑29b、miRNA‑34a和miRNA‑30a表达显著上调。这表明miRNA参与早期食管酸性物质损伤暴露后的大脑皮质可塑性变化。此外，miRNA的单个核苷酸多态性还参与内脏疼痛的认知和情绪变化。外显子包装miRNA可穿过血脑屏障是一种治疗内脏疼痛中枢敏化很有前景的手段 。

2.4　miRNA与阿片药物耐受

阿片类药物的显著特点是镇痛作用明显但个体差异性大，长期使用后会引起药物耐受和痛觉过敏的发生。miRNA水平变化与吗啡耐受和痛觉过敏存在直接联系，啮齿类动物发生吗啡耐受后脊髓和DRG神经元中miRNA‑93‑5p和miRNA‑223‑3p表达增加，而miRNA‑365、miRNA‑219‑5p和miRNA‑338水平降低 ，这表明miRNA变化在吗啡耐受的形成中发挥部分作用或吗啡耐受通过潜在机制引起miRNA改变。

将10 μg吗啡或等量生理盐水对大鼠连续7 d进行鞘内注射，与生理盐水组比较，吗啡耐受组miRNA‑365表达显著下调。非常有趣的是，利用慢病毒载体将miRNA‑365注入鞘内却可部分逆转吗啡耐受 。同样，脊髓过表达miRNA‑219‑5p可通过降低钙调素激酶Ⅱ蛋白和NMDA受体亚单位1的表达逆转吗啡耐受。也有研究证实，小鼠单次皮下注射100 mg吗啡可引起DRG神经元中miRNA‑375负向调节；鞘内给予miRNA‑375模拟激动剂可完全逆转吗啡耐受，与抑制蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3信号通路有关 。

人工合成外源性miRNA模拟生理性miRNA的作用，通过调节相关miRNA的表达或抑制参与疼痛发生、发展的信号分子，从而发挥治疗作用是miRNA 作为治疗疼痛的理论基础。目前，已有多家商业公司在不同的疾病种类开发基于miRNA的治疗技术，涉及的疾病类型包括肿瘤、心血管疾病、炎症性和感染性病变及先天性疾病等 。很多研究集中评价miRNA人体应用的有效性和生物学毒性，缺少关于miRNA用于外科手术后疼痛处理的安全性和有效性研究 。

采用镇痛相关miRNA（Analgesic‑miRNA）或miRNA类似物（Analog‑miRNA）进行镇痛治疗或预防性疼痛处理需要解决以下三方面关键问题：

① 选择哪种miRNA作为靶标进行人体导入。根据外科术后某些miRNA变化规律与特征，使用模拟miRNA下调或拮抗其过度表达，从而恢复某些特定miRNA的生理水平进而发挥一定的治疗作用。啮齿类动物中的研究发现miR‑203、miR‑146和miR183在手术后明显下降，若在人体也有类似变化则可以通过输注Analog‑miRNA恢复其损伤部位或中枢水平达到控制术后疼痛的目的。临床上，乳腺切除和开胸手术后NP发生率高，动物模型研究表明miRNA对此类疼痛有显著缓解作用，人体是否具有同样效果需要进一步研究明确。

② Analog‑miRNA导入人体的部位和时机。Analog‑ miRNA半衰期短且易被核酶降解，这显然会影响其发挥作用。而脑脊液中核酶浓度显著低于血液中的水平，这似乎提示经鞘内给予Analog‑miRNA是一个较合理的选择。此外，采用抗核酶降解的输注系统会进一步延长Analog‑miRNA作用时间 。每天进行人体鞘内输注不符合临床实际，因此局部或外周给药必然是一个合适的选择。此外，Analog‑miRNA拮抗剂或miRNA模拟物与局部麻醉药同时注射可能也是一种十分有效的途径。

③ Analog‑miRNA安全、高效导入的载体系统。这种载体系统要确保导入miRNA时能到达特异的靶细胞并在局部能够产生足够的浓度以诱导靶细胞产生理想的效应。病毒和非病毒载体是荷载miRNA的两种主要载体，采用非病毒载体时需要考虑生物相容性、生物降解、毒性和免疫特性等因素。因无机非病毒载体在体液中稳定性高和低细胞毒性，聚乙烯亚胺、树枝状大分子和聚乳酸共聚体等已经广泛用于导入miRNA。鞘内注射时载体的种类十分重要，其浓度、比重和酸碱度会决定其在鞘内的扩散并最终影响镇痛效果 。另外，RNA沉默具有可剪接并与

miRNA密切结合的能力，可能是一种高效的控制疼痛的手段。

目前，基于miRNA的临床治疗技术尚处于起始阶段（表1），仍面临很多需要解决的实际问题。其中研发能够确保细胞特异性重吸收且无毒副作用的导入系统和尽量减少脱靶效应是最大的挑战 。

miRNA广泛参与生物体的生长、发育和凋亡等生理或病理过程，具有一定的组织特异性、疾病相关性和相对的稳定性。miRNA在疼痛领域具有十分广泛的应用前景，对疼痛的病因、发生、发展和转归以及疼痛的治疗等具有潜在的价值。深入研究疼痛与miRNA之间的关系，不仅对疼痛管理有重要帮助，而且对疼痛的预防和治疗相关的脏器损伤与功能不全，减少外科术后不良事件的发生有重要意义。今后，miRNA和miRNA模拟制剂能否成为研究疼痛领域的新热门，能否成为治疗疼痛的新途径，主要取决于探寻高效特异的miRNA导入载体，以及最大程度地降低脱靶效应。