百年胰岛素

  ▉ 前言

2021年是胰岛素发现100周年。胰岛素的发现不仅仅扭转了糖尿病患者确诊即死亡的命运，也促进了人类对于蛋白质生物合成、晶体结构、自身免疫疾病和精准医疗等领域的理解。百年以来，共有4枚诺贝尔奖源于胰岛素的研究。今天，通过Carmella Evans-Molina最近发表于Nature Medicine的综述，我们一同回顾胰岛素的百年历程以及未来所面对的挑战。

图一 胰岛素发展的百年历程 ▉ 胰岛素的发现 糖尿病（Mellitus Diabetes）的记载最早出现在公元前1世纪，diabetes在古希腊语中的意思是多尿，后来发现糖尿病病人的尿是甜的，就加以mellitus一词描述这种疾病。20世纪初，科学家已经认识到糖尿病病人的尿糖增高与血糖增高有关，而且这与胰腺有关，理由是狗摘除了胰腺会导致高血糖（图二）。因此，科学家普遍相信胰腺分泌的一种内源物质可以调节血糖，这种还处于猜想阶段的物质被称为insulin（胰岛素）。当时，糖尿病是不治之症，确诊即意味着死亡。所以全世界有诸多课题组致力于证实并纯化出胰岛素，然而令人费解的是胰腺提取物注射回摘除胰腺的狗并没有所期望的降血糖效果。 图二 狗摘除了胰腺会导致高血糖

1921年，加拿大外科医生Banting认为胰腺细胞分泌的胰蛋白酶可能在纯化过程中降解了胰岛素导致提取物失去活性。他提出如果将胰管缝合避免胰蛋白酶污染胰岛细胞，并将分泌胰蛋白酶的细胞破坏，就可能纯化出有活性的胰岛素。Banting获得了多伦多大学Macleod教授的支持，并成功分离出有活性的胰岛素提取物。1922年，纯化的胰岛素注射给了一个14岁的糖尿病患者，最终他活到26岁，而当时糖尿病确诊后病人通常仅能存活几个月[1]。为了满足大量糖尿病患者的需求，美国Eli Lilly公司开发了大规模纯化方法实现了胰岛素的商业化。胰岛素发现两年后，Banting和Macleod就获得了诺贝尔生理学或医学奖（图三）[2]。

 图三 1923年诺贝尔生理或医学奖获得者 ▉ 胰岛素推动了人类对糖尿病的认知 胰岛素发现以前，人们就发现糖尿病病人间存在很大的差异：有些病人很年轻，而且身体瘦弱，即使在低糖饮食下也很难存活；有些病人则是中年以后才确诊为糖尿病，而且通常肥胖，控制好饮食会明显提高生存率。胰岛素的时代到来后，医生发现年轻的糖尿病病人比中年病人一般需要更少的胰岛素剂量就可以达到控制尿糖的效果，因此认为 糖尿病 可以分为 胰岛素敏感型 和 非敏感型 。

上世纪50年代，美国物理学家Yalow开发了放射性免疫分析方法（radioimmunoassay）（图四），该方法非常灵敏，可以检测血液中的抗原。Yalow检测了两类糖尿病病人的血液胰岛素含量，结果发现胰岛素非敏感型病人的血液中含有胰岛素，并不是之前认为的胰岛素缺陷。该工作不仅开发了多肽类激素的检测方法，也直接促进了人类对于两类糖尿病的病理学认识。Yalow也因这一工作获得了1977年诺贝尔生理学或医学奖。 

图四 放射性免疫分析（使用已知量的抗体和放射性标记的抗原（绿色）检测血液样品中的抗原（蓝色），样品中的抗原与标记抗原相互竞争结合抗体，分离抗原-抗体复合物后检测放射性信号可以计算出样品中的抗原含量）

与此同时，科学家逐渐发现胰岛素敏感的糖尿病患者与自身免疫相关。糖尿病病人中经常会出现抗自身蛋白抗体，包括攻击胰岛细胞的抗体，在病人的胰腺中还发现有淋巴细胞浸润。1979年，综合糖尿病病人的胰岛素水平和自身免疫方面的研究，National Diabetes Data Group将糖尿病划分为两类，即I型糖尿病（胰岛素依赖型）和II型糖尿病（胰岛素非依赖型）。过去五十年，糖尿病自发动物疾病模型，以及人群的免疫、代谢和基因表型分析都在持续帮助人类更好地理解糖尿病的发病机制。

目前普遍认为，I型糖尿病是慢性自身免疫疾病，具有遗传倾向的个体遇到刺激因素时会激活针对胰岛的自身免疫反应，导致β细胞损伤和胰岛素缺失。通过人群遗传分析，已鉴定出几十种基因都与糖尿病相关，但仍缺乏能够稳定预测糖尿病发病的生物标记物，复杂的遗传形式、疾病表型和环境因素也为糖尿病的遗传基因鉴定带来了巨大困难。通过分析birth cohorts的自身抗体的建立过程，2015年提出了糖尿病发病的分段模型：第一阶段产生2个以上的自身抗体；第二阶段产生多种自身抗体和血糖失调；第三阶段则是血糖等指标完全超过临床标准，确诊为糖尿病（图五）[4]。由于糖尿病无法从病因角度根本治愈，这种分段模型对疾病的预防和早期干预具有意义。

图五 I型糖尿病发病的3阶段模型

对于II型糖尿病而言，胰岛素敏感程度和β细胞的胰岛素分泌能力对疾病的发生起到至关重要的作用。II型糖尿病确诊10年前病人就可能出现胰岛素敏感度降低，但β细胞会提高胰岛素的表达以控制血糖。但是长期的胰岛素过量表达会加重β细胞的负担，包括氧化应激和内质网压力在内的多种机制会导致β细胞损伤，胰岛素分泌量会逐渐减少，最终血糖失控。  

▉ 推动人类对蛋白质结构性质的认知 胰岛素在蛋白质的结构和性质研究中创造了多个第一，在蛋白质晶体学和蛋白质结构研究中占有重要的历史地位。Hodgkins在1935年首次获得胰岛素晶体的衍射照片，后来成功解析了胰岛素的六聚体晶体结构，获得了1964年诺贝尔化学奖，胰岛素是第一个被解析晶体结构的激素。20世纪50年代，Sanger解析了胰岛素A，B链的氨基酸序列和二硫键位置，于1958年获得诺贝尔化学奖，这是 人类首次测出蛋白质的氨基酸序列。 1965年，Steiner在研究胰岛瘤细胞时发现 胰岛素的前体是单链的胰岛素原 ，分泌过程切去中间的C肽后形成胰岛素（图六），这是对 多肽激素前体的首次研究 。胰岛素的结构解析为胰岛素-胰岛素受体相互作用研究铺平了道路。在胰岛素单基因突变疾病的研究中，人类逐渐认识了 胰岛素的生物合成和分泌途径 [5]，不同功能的胰岛素突变体为胰岛素的关键氨基酸残基提供了重要信息。

 图六 胰岛素的生物合成途

▉ 胰岛素的临床应用 胰岛素发现后迅速用于临床治疗，此后的50年间，胰岛素药物一直来自于动物胰脏的提取。23500多个胰腺仅能纯化出1磅胰岛素，这逐渐难以满足增长的糖尿病病人的需要。尽管动物来源的胰岛素药物能够拯救生命，但也存在胰岛素纯度和引发炎症反应的问题。1978年，Genentech公司利用重组DNA技术生产出了世界首个重组人胰岛素，并实现商业化生产。此后，为了改善胰岛素的药物代谢动力学性质，通过蛋白质工程和制剂的辅料研究等方法，开发出了多种胰岛素产品（图七）。  图七 不同类型胰岛素产品及其药物代谢动力学 天然的胰岛素产品 胰岛素会自组装形成六聚体，需解离为胰岛素单体后才能进入血液循环，从开始注射到血药浓度达到峰值需 60~90分钟 。而健康人在开始进食后 15~30 分钟就可以达到胰岛素峰值。为了实现胰岛素药物的快速吸收， 1996年上市了首支 速效胰岛素 （rapid-acting insulin）Lispro ，通过颠倒 B 链两个位点的赖氨酸和脯氨酸位置， Lispro 可以实现胰岛素单体的快速解离。 超速效胰岛素（ultrarapid-acting insulin）Aspart 在胰岛素突变体 Aspart 基础上添加烟酰胺和精氨酸辅料可以提高胰岛素的稳定性和产生更快的吸收时间。 天然胰岛素在血液中的半衰期只有几分钟，因此需要一天多次注射。2000年上市了第一个仅需每天注射一次的 长效胰岛素Glargine ，用于控制基础血糖。Glargine通过将A29位点突变为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，改变了胰岛素的等电点，使胰岛素在注射部位的中性pH环境下解离变慢。长效胰岛素Detemir和Degludec都是通过在B29位点连接脂肪酸链而与白蛋白结合，获得更长的作用时间。

胰岛素的药物递送设备也获得了长足发展。1985年Novo Nordisk公司上市了世界首支胰岛素注射笔，减少了普通注射器带来的不便。现在的糖尿病患者已经可以通过手机App根据自身血糖值计算出推荐的胰岛素剂量，使用胰岛素注射笔调节剂量注射。吸入式胰岛素给药方式曾经可以实现更快的吸收，但受到昂贵的价格、受限的剂量控制和对肺部的副作用风险等原因而退市。胰岛素泵可以移植到人体，避免频繁注射带来的痛苦，具有很好的应用前景。1983年，MiniMed公司上市了首款商业化胰岛素泵（图八）。目前许多胰岛素泵已经装配了连续血糖监控设备根据血糖值-胰岛素释放的闭环逻辑技术实现胰岛素给药自动化。

图八 胰岛素泵

▉ 糖尿病治疗的未来

2019年一项持续30年的糖尿病预防研究发现，处于第一阶段的糖尿病高风险人群在14天的抗CD31抗体预防措施后，可以将第二阶段糖尿病发病延缓32.5个月。这为糖尿病发病前的早期干预提供了重要信息。未来需要找到更多更准确的早期干预生物标记物，筛选合适的高风险人群和相关免疫抑制药物来减少自身免疫的发生。

对于胰岛素治疗，还有待于开发更多具有不同特点的胰岛素产品，例如更快起效的胰岛素、能够每周只需注射一次的胰岛素、口服胰岛素和血糖响应的胰岛素等。胰岛素递送设备需要有更多的调控功能，例如同时递送多种激素，实现真正的人工胰岛。细胞治疗是很有前景的胰岛素供应方法。尽管通过干细胞诱导分化产生完全替代胰岛细胞的β样细胞还未能实现，但过去20年的干细胞研究已获得了重要突破。同时细胞移植和包埋技术未来也有望实现避免自身免疫的攻击，对糖尿病的治疗具有重要影响（图九）。

图九 糖尿病治疗的未来

参考文献

1. Pioneers of Diabetes: Leonard Thompson, 2019.

2. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1923. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2021.

3. Bioscience Notes. Radioimmunoassay. 2018.

4. Insel, R. A. et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care 38, 1964–1974 (2015).

5. Weiss, M. A. Proinsulin and the Genetics of Diabetes Mellitus. Journal of Biological Chemistry 284, 19159–19163 (2009).