《科学》颠覆性突破!哈佛大学顶尖华人学者发明细胞照相机!作者就两人!华人顶尖科学家再一次发明颠覆性生物医学技术

2021
08/09

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最新一期的国际著名期刊《科学》杂志发表一篇重磅文章,由著名华人科学家、2017全球十大科技突破入选者、哈佛大学David Liu教授和学生唐微信(音译:Weixin Tang)两个人发表,他们采用CRISPR技术来记录细菌或者细胞对抗生素、营养物质、病毒、光等的信号改变。


第三代基因编辑技术CRISPR-Cas系统到了现在,应用之广泛恐怕早已经超越当初这个领域中许多人的想象了。

这一周在著名期刊《科学》杂志上面的三篇重磅文章可能又把这一领域推向高潮,既包括张锋团队以及杜德拉团队的关于应用CRISPR技术进行超灵敏基因检测的两篇文章;还有一篇就是这里将要介绍的,哈佛大学David Liu教授和博士后Weixin Tang的利用CRISPR技术记录细菌或者细胞对抗生素、营养物质、病毒、光等的信号改变的方法。

David Liu教授和博士后Weixin Tang在著名学术期刊《科学》杂志上面发表的文章

这项被研究者们叫做“CAMERA”的技术可以说是CRISPR领域的又一大重大突破!不但《科学》杂志在最新一期中配发了相关的评论“‘CAMERA’ records cell actionwith new CRISPR tricks”;另一著名学术期刊《Nature》也在第一时间发表了相关报道“CRISPR hack transforms cells into data recorders”。足见科学界对这项创新性生物工程及信息技术的重视程度。


记录细胞的历史

人类有历史,从古至今的迁徙演变;动物也有历史,比如你养的小宠物,从小养到大甚至老去;植物也有历史,比如门前的大树,你小时候见到它恐怕又细又矮。

细胞有没有历史呢?答案是肯定的,因为细胞也有从诞生到衰老死亡的过程

人类记录自己的成长历史,比如一个小孩子从出生到老去,那非常好办,有照相机或者录像机就可以解决问题。

要记录一个细胞的衰老死亡,从表面上看也比较容易,只需要在显微镜下面拍照或者录像就行了。然而,要记录细胞或者细菌在遇到刺激比如营养物质、光、热、抗生素、病毒等等的时候,细菌或细胞究竟发生了什么?激起了哪些信号通路或者分子的变化?等等,这些分子层面的东西,要记录下来那是相当不容易,一方面你用显微镜观察也很难看见,另一方面,细胞经历了这些变化之后,经过一段时间可能又恢复了正常了,因此,你很难判断细胞的历史(Cell' History)中是否经历过上述变化

要记录这些变化,那就要用到下面将要介绍的哈佛大学David Liu教授和博士后Weixin Tang的利用CRISPR技术改造的名叫:CAMERA的技术了。

基因编辑技术大咖David Liu教授,发明了基于CRISPR的单碱基编辑技术,从而把第三代基因编辑技术推向又一高峰(图片来自网络)


CAMERA一代

这项广受关注的技术叫做CAMERA,照相机的意思,是CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus的首字母缩写

再一次说明,David Liu教授深得取名字的精髓,确实,名字取好了便于科学传播。

如何在细胞中记录信号?

研究者们在CAMERA一代(实际上是CAMERA1.1)中,把CRISPR-Cas9基因(spCas9)和表达sgRNA(引导RNA)都同时构建到一个质粒中,而Cas9基因和sgRNA的前面都放入小分子化合物诱导表达的启动子(常用的TetO启动子,需要四环素诱导表达,anhydrotetracycline,aTc;而LacO启动子则需要化合物IPTG的诱导)。

spCas9基因表达的表达受到小分子化合物诱导启动子的控制,比如,需要spCas9蛋白的话,就必须要加入四环素(anhydrotetracycline,aTc)这个化合物,有这个化合物就有spCas9表达,这样一来就能够在特定位置剪切DNA,而要是没有这个化合物spCas9就不表达,这样就不能够在特定位置剪切DNA(图片来自Science)

因此,spCsa9的表达受到四环素aTc的控制,而sgRNA的表达则受到IPTG的控制;换句话说,环境中的四环素这种抗生素就能够刺激spCas9的表达,而环境中的IPTG这种小分子就能够刺激sgRNA的表达。因此,要是环境中既存在四环素,又存在IPTG,那么,就会产生spCas9蛋白和相应的sgRNA

产生spCas9和相应的sgRNA有什么用呢?

众所周知,这两样东西一结合,就会在特定的基因或者DNA序列位置剪切DNA。

然而,直到这里也没有什么新意,这本来就是CRISPR-Cas系统干的事情。

但是,这里不得不注意一点,不知道你有没有注意到,对于细菌而言,通过上面的诱导型操作就将四环素和IPTG这样的化合物转变成了spCas9和sgRNA这样的信号,进一步就变成了切割DNA的工具。

而spCas9和相应的sgRNA结合之后,要切割什么DNA序列呢?

这就是CAMERA技术的关键了。

CAMERA技术的原理图(注意R1与R2的三个碱基序列不同)

研究者们将绿色荧光蛋白(EGFP)(发绿色荧光)基因以及仅有三个碱基不一样的突变绿色荧光蛋白(mEGFP)(不能发荧光)基因构建到质粒中,分别称为recorder plasmid1(R1)和recorder plasmid2(R2),作为记录质粒见上图)。

然后把这两种质粒R1和R2按照一定拷贝数量比例(比如R1:R2为58:42)转入细菌(或细胞)中此时,细菌(或细胞)就发强烈的绿色光(由于R1这种表达正常荧光蛋白的质粒多一些);然而,一旦上面所述的spCas9和相应的sgRNA(专门靶向结合正常的未突变的EGFP基因的)结合之后,spCas9-sgRNA复合物就会结合到R1质粒的EGFP序列上,剪断EGFP的序列,结果就使得R1质粒不能够表达绿色荧光蛋白了,这样一来,细菌(或细胞)就会在荧光显微镜下变得看不见(因为细菌中表达正常绿色荧光蛋白EGFP的R1质粒被破坏了)(当然,实际上可能是变得暗淡)。

因此,细菌由强烈的绿色光转变为没有绿色荧光,这就是信息学上面的“逻辑门”(1,0)的概念,有绿色光代表1,无绿色光代表0这就如同电灯泡,电灯泡亮着,就意味着有人还在,可以用1来表示;而一旦关灯,就意味着这个人要休息了,可以用0来表示。

因此,开灯和关灯就是一种信号;类比到这里,绿色荧光到没有荧光就是一种信号

现在来复盘一下:四环素和小分子化合物IPTG共同刺激细菌,就产生了spCas9和针对EGFP的sgRNA,而它们一旦结合,就会剪切发绿色光的R1质粒,进一步造成R1质粒数量变少(甚至没有),从而导致细菌不能发光。这样一来,四环素和IPTG对细菌的刺激就一步步变成了绿色光转变成无光,因此,抗生素等化合物的信号就转变成了光信号。

现在来逆推一下:细菌由发强烈的绿光转变成不发光,意味着什么呢?这就意味着细菌同时感受到了四环素和IPTG这两种化合物的刺激。

因此,我们只需要观察到细菌由绿色变成没有颜色,我们就能够知晓细菌受到了抗生素(四环素)和化合物IPTG的共同刺激(当然,这里必须注意的是,实际上也可以不需要观察荧光,而直接采取测序的方法测定R1和R2质粒的拷贝数比例的变化也能够知晓细菌受到抗生素和IPTG的刺激没有)。


CAMERA二代

实际上,上面的CAMERA一代相当的繁琐,一方面,虽然观察绿色光信号比较容易,但是谁没事在那显微镜下一直观看细菌(或细胞)发光呢?另一方面,虽然也可以通过测定R1质粒和R2质粒的比例来确定细菌受到抗生素和小分子化合物刺激没有,但是这个R1质粒和R2质粒的初始比例却非常难掌握,需要做很多实验来确定这个比例。

简而言之,CAMERA第一代太麻烦了,有没有更简单的方法呢

当然是有的,这就是升级版的CAMERA二代,这其中就需要使用David Liu实验室独家秘籍,一种叫做单碱基编辑(Base Editor)的CRISPR技术了(了解相关内容欢迎查看本公众号原创文章《自然》《Science》黑科技单碱基编辑技术会是下一个生物医学科研和应用金矿吗?

CAMERA2技术的原理图(主要利用了David Liu实验室的独门技术:单碱基编辑技术Base Editor)

这个CAMERA第二代简单说来就是:你外界的物质(比如抗生素)刺激细菌(或细胞)一下,细菌携带的单碱基编辑器(Base Editor)就在特定的基因组中不重要的位点(比如某内含子中)替换一对G-C变成A-T,这样一来,一旦在特定位点通过测序测定到原先的碱基G-C变成了A-T,那么,就可以确定细菌(或细胞)受到了抗生素的刺激了。

因此,外界的抗生素等化学物质就转变成了基因突变信号,你来一个刺激,细菌细胞中的单碱基编辑器Base Editor就给细胞中的基因组打上一个突变(G-C到A-T),因此,我们只需要检测特定位置(比如基因组中某基因第2000个碱基)发生了G-C到A-T突变就可以判断细菌曾经遭受过什么刺激。

这不得不说太方便了,就像到医院去体检,几十个体检项目,检测完一个就盖上一个章,只需要看有没有盖章就能够判断你检测这个项目没有。

(这项工作)is really beautiful stuff”,麻省理工著名华人科学家卢冠达(Timothy Lu)博士在《科学》杂志采访时评价到

这项工作可以说是意义非凡,期待后续进展。



参考资料:

1. Rewritable multi-event analog recording inbacterial and mammalian cells.

2. http://science.sciencemag.org/content/359/6377/728

3.https://www.nature.com/articles/d41586-018-02068-0



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关键词:
颠覆性,四环素,抗生素,化合物,技术,细菌,碱基

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