西华大学 | Food Funct.：植物乳杆菌在生物被膜和浮游状态下的代谢特征及其在犬体内的肠道调节和免疫调节研究

2021-08-10 09:32

本研究对L. paraplantarum L-ZS9的生物被膜和浮游细胞进行了比较，发现生物被膜状态比浮游状态表现出更高的密度和更强的抗性。

导读

益生菌的使用最近已成为一个相当有前途的研究领域。最先进的第四代益生菌包括生物膜内的有益细菌。然而，迄今为止，益生菌在生物膜和浮游状态的影响差异还不清楚。本研究确定植物乳杆菌L-ZS9的生物膜模式具有较高的密度和较强的抗性。非靶向代谢组学分析表明，浮游细胞和生物膜细胞之间存在显著差异，在生物膜模式下，氨基酸和碳水化合物代谢都更活跃。体内实验表明，该生物膜菌株具有较好的免疫调节活性，可提高犬肠道菌群中乳酸菌的相对丰度。益生菌处理后，参与碳水化合物代谢的肠道菌群相对丰度较高。通过对L-ZS9产生代谢物、犬肠道菌群多样性与犬血液免疫指标(sIgA或IgG)的相关性分析，揭示了这三种成分之间的相互作用，这解释了生物膜L - ZS9通过产生多种代谢产物调节肠道微生物和宿主免疫活性的机制。本研究的结果将有助于加深对生物膜益生菌有益作用的认识，并为进一步的研究提供参考。

论文ID

原名：Metabolic profiles of Lactobacillus paraplantarum inbiofilm and planktonic states and investigation of its intestinal modulationand immunoregulation in dogs

译名：植物乳杆菌( Lactobacillus paraplantarum )在生物被膜和浮游状态下的代谢特征及其在犬体内的肠道调节和免疫调节研究

期刊：Food & Function

IF：5.396

发表时间：2021.5

通讯作者：饶瑜

通讯作者单位：西华大学食品科学与生物工程学院

实验设计

结果

1. L-ZS9在生物膜和浮游状态下的生长曲线、pH变化和存活率

如图1所示，OD_{600 nm}的生物膜细胞被发现时高于浮游细胞应变增长在固定相(15 h-36 h)然而，生物膜培养基中的pH变化与浮游培养基中的pH变化相同。结果表明，结果表明，生物膜状态下的细胞密度高于浮游生物状态下的细胞密度。。益生菌在胃肠道中的存活对益生菌的功效至关重要如图1B所示，经SGF处理后，生物膜细胞的存活率(9.4±0.6%)显著高于浮游细胞(4.7±0.3%)，说明L-ZS9在生物膜状态下比在浮游状态下具有更强的抗性。

这些结果与以往的研究报告一致，乳酸菌形成的生物膜可以促进其在宿主中生存更长时间。这一优势可能源于生物膜的特性。生物膜是一种生活在胞外多糖(EPS)基质中的有组织的微生物聚集体，占总生物量的90%。EPS对于维持生物膜结构的稳定性至关重要。它们影响细胞的某些生化特性，并改变生物膜的粘附特性。这些EPS介导的变化支持细胞识别，并进一步刺激粘附和聚集。此外， EPS 封装的细胞具有更好的抵御外部环境压力的能力。

图 1 (A) L-ZS9在浮游和生物膜状态下的生长曲线和pH值。(B) L-ZS9在模拟胃肠液处理下浮游和生物膜状态下的存活率。—为生物膜细胞，---为浮游细胞，▲为pH值，■为OD_{600 nm}。

2. PCA和PLS-DA分析生物膜和浮游L-ZS9的代谢谱

为了确定菌株在最终代谢水平上的生物膜和浮游状态的差异，我们使用非靶向代谢组学分析比较了它们的代谢谱。虽然代谢组学的研究仍处于起步阶段，但现在有可能深入了解构成基因表达最终产物的代谢产物。最近，液相色谱 -质谱(LC-MS)已经成为非靶向代谢组学的一个多功能、强大和不可或缺的平台。在本研究中，PCA和PLS-DA均显示出浮游细胞和生物被膜细胞之间的显著差异(图2)，与之前的研究结果一致。Acinetobacter baumannii、Vibrio fischeri、Pseudoalteromonas lipolytica、Staphylococcus aureu和Bifidobacterium bifidum等多种细菌的生物被膜状态和浮游状态均存在明显差异。

图2 (A-B)正离子模式下生物膜和浮游代谢组学数据集的主成分分析(PCA)图(A)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)(B)。(C)负离子模式下生物膜和浮游代谢组学数据集的主成分分析(PCA)图和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。

3. 通过非靶向代谢组学鉴定的生物膜和浮游L-ZS9的代谢谱

为了清楚区分这两组的不同代谢物，选择那些显示明显变化( P < 0.05,VIP > 1)的代谢物，如图3中的热图所示。在正负离子模式下，共鉴定出95和93种重要代谢物。在正离子模式下，79种代谢物在生物膜细胞中的表达显著增加（P<0.05，VIP>1），与浮游细胞相比，其倍数变化（FC）≥1倍。相反，16种代谢产物在浮游细胞中显著上调（P<0.05，VIP>1）。在负离子模式下，70种代谢物（在生物膜细胞（FC≥1）中显著表达（P<0.05，VIP>1），而23种代谢物在浮游模式下显著表达（P<0.05，VIP>1）；代谢物的详细情况见表S1。

在正离子模式下，FC>5的代谢物被确定为acetylcholine、diacetyl、gamma-L-glutamy-L-Lglutamic acid、cyclohexylamine、D-alanyl-D-alanine (D-Ala-DAla)、choline、glycerol-3P、guanosine-5′-diphosphate (GDP)、L-fucose-1P、S-methyl-5′-thioadenosine；FC<0.03的代谢物为N-acetylcadaverine和deoxyadenosine。Glycerol-3P可能通过调节AI-2的产生来避免生物膜的扩散，从而与生物膜的形成呈正相关。另外，D-Ala-D-Ala是D-丙氨酸（D-Ala）代谢途径中的产物之一，与EPS的产生、细菌粘附和生物膜的形成呈正相关。在负离子模式下，FC>5的代谢物为L-rhamnose、16-hydroxypalmiticacid、alpha-D-glucose、D-ribulose-5P、succinate和phosphorylcholine，FC<0.03的代谢物为fructose-1P、thymine和galactinol。其中，L-rhamnose是异源EPS聚合重复单元的重要组成成分之一，说明该菌株在生物膜状态下能够合成更多的EPS。此外，生物膜细胞中参与细菌能量代谢的琥珀酸含量高于浮游细胞，说明生物膜细胞的能量代谢可能更强。

图 3热图显示生物膜和浮游细胞在(A)正离子(B)和负离子模式下的代谢组学轮廓。数据以一式六份的彩色图表示，反映与代谢物变化有关的对数(红色区域表示代谢物丰度增加，蓝色区域表示减少)。对数值以刻度中所示的颜色编码。

4. 代谢途径

通过鉴定出差异显著的代谢物，确定了82条代谢通路的存在。图4显示了两种状态下前20个差异表达的代谢通路。根据确定的代谢物数量，代谢途径、氨基酸生物合成、蛋白质消化吸收、氨基酰基tRNA生物合成等重要途径发生了显著变化。结果表明，在生物膜和浮游状态下，氨基酸和蛋白质的代谢存在显著差异。

在分类的代谢物中，20种处于正离子模式的物质和12种处于负离子模式的物质被鉴定为氨基酸、多肽或类似物。此外，碳水化合物是第二高的类别，在这两种状态中表现出显著差异。结果表明，氨基酸和碳水化合物的代谢在生物膜模式下比在浮游模式下更活跃。这些发现与最近比较另一种益生菌——Bifidobacterium bifidum在生物膜和浮游状态下代谢组学的研究不一致，这可能是因为该研究使用的是气相色谱-质谱(GC-MS)，而目前的研究使用的是LC-MS。此外，这两种细菌的属间确实存在差异。此外，生物膜细胞暴露于完全不同的微环境中，其浮游类似物在搅拌培养基中培养，在生物膜规模下的代谢活性具有异质性。考虑到有益菌的代谢组学分析仍然有限，需要进一步研究确定是生物膜代谢更活跃还是浮游细胞代谢更活跃。在本研究中，我们将在下一部分分析三条主要的代谢途径，分别是氨基酸代谢途径、碳代谢途径和核苷酸代谢途径。

图 4生物膜细胞与浮游细胞代谢途径的前20位分析基于显著不同的代谢物。生物合成途径从KEGG数据库中修改。每个圆圈的大小和颜色表示路径影响值。

5. 氨基酸代谢途径

在氨基酸代谢途径中，生物膜细胞中arginine、proline、L-valine、L-glutamate、L-histidine、L-aspartate、L-alanine、tryptophan、phenylalanine、L-methionine和S-adenosyl-L-methionine增加，而浮游细胞中只有L-glutamine增加（图5A）。先前的一项研究发现，大肠杆菌生物膜中L-氨基酸的含量比D-氨基酸的含量增加得更快。同样，我们的结果显示生物膜细胞中改变最多的氨基酸是L-氨基酸，而不是D-氨基酸。这可能是因为L-氨基酸对细菌生物膜形成的贡献更大。前期研究发现，该菌株可以通过蛋氨酸代谢途径产生autoinducer 2，作为群体感应的信号分子。结果表明，在生物膜模式下，参与该途径的L-methionine、S-adenosyl-L-methionine、L-aminocyclopropane-Lcarboxylate和S-methyl-5′-thioadenosine均升高。这些结果表明，群体感应水平可能在两种生活方式的菌株不同，可能是由于高密度和复杂的生物膜结构。此外，与我们的数据一致，据报道L-valine在Acinetobacter baumannii的生物膜细胞中积累，研究表明缬氨酸在细菌生物膜中持续分泌。L-ZS9生物膜状态下缬氨酸的积累可能是由于生物膜基质的扩散减少和细胞密度增加所致。

图5 L-ZS9细胞在生物膜和浮游状态下(A)氨基酸、(B)碳水化合物、(C)核苷酸代谢途径的代谢变化与浮游细胞相比，生物膜细胞中代谢产物的增加和减少分别呈现为红色和绿色。

6. 碳代谢途径

碳代谢途径中发生变化的代谢物分为三个部分：糖酵解、戊糖磷酸途径、果糖和甘露糖代谢（图 5B）。与浮游细胞相比，生物膜细胞中上调的碳代谢相关代谢物被鉴定为α-D-glucose-1P、α-D-glucose、D-mannose、D-mannose-1P、D-erythrose-4P、D-ribulose-5P、glyceraldehyde-3P、2-deoxy-Dribose-5P、glycerol-3P 和glyceraldehyde-3P，而下调的代谢产物是 glycerate-3P 和phosphoenolpyruvate。在糖酵解途径中，glycerate-3P是连接糖酵解和脂肪酸代谢的中间物质。在这里，丰富的α-D-Glucose-1P和glyceraldehyde-3P含量增加，而glycerate-3P和phosphoenolpyruvate含量减少。这些结果表明，在生物膜细胞中合成了大量的glyceraldehyde-3P，这与先前的研究一致，即在泌尿致病性大肠杆菌的生物膜形成过程中glyceraldehyde-3P显著上调。研究结果表明，参与果糖和甘露糖代谢的D-mannose、D-mannose-1P、L-fructose-1P和L-rhamnose，以及参与戊糖磷酸途径的2-dehydro-3-deoxy-Dgluconate、D-ribulose-5P、2-deoxy-D-ribose-5P和D-erythrose-4P在生物膜细胞中均增加。此外，甘露糖还可以作为合成EPS的碳源，从而提高细菌的生物膜形成和粘附能力。这些结果表明，EPS前体在生物膜细胞中比在浮游细胞中更丰富，说明生物膜模式比浮游模式更能产生EPS，从而为生物膜细胞提供有益的优势。

7. 核苷酸代谢途径

在核苷酸代谢途径中，变化的代谢产物主要是嘧啶代谢、嘌呤代谢和核黄素代谢。如图5C所示，在生物膜细胞中，上调的代谢产物包括GDP、GMP、AMP、 ADP、FMN、UMP、UDP、尿嘧啶、胞核嘧啶和ADP-核酸糖。生物膜细胞ATP水平无明显变化。结果表明，生物膜细胞的能量消耗比浮游细胞的能量积累更为活跃。据报道，尿嘧啶与铜绿假单胞菌PA14的生物膜形成呈正相关。与此相反，生物膜细胞中FAD、dGTP、甲状腺素、UDP-葡萄糖、二氢尿嘧啶和脱氧腺苷含量降低。其中FAD和UDP-葡萄糖与生物膜的形成有关

8. L-ZS9生物膜和浮游生物膜喂养犬血液中的免疫学和生化指标

与对照组(390.0 ±14.6 ng L^-1)相比，生物膜组(463.4 ±11.2 ng L^-1)仅IgG浓度显著升高(图6A)。浮游生物组sIgA (15.2 ±0.8ng L^-1)与对照组sIgA (15.3± 0.6ng L^-1)无明显差异，而生物膜组sIgA (19.3 ±0.5ng L^-1)显著升高(图6B)。此外，IL-6水平在浮游生物组(575.6 ±13.7 ngL^-1)和对照组(571.8± 23.6 ngL^-1)中没有明显差异，但在生物膜组(525.9 ±11.9 ngL^-1)中确有下降(图6C)。各组TNF-α、T-SOD、MDA含量基本一致(图6D、E、F)。

益生菌可提高血清免疫球蛋白水平，增强免疫系统功能。此外，有研究表明，复合益生菌(乳酸杆菌、酵母、芽孢杆菌)可显著提高血清IgG、IgA，益生菌可通过刺激B细胞产生IgA对肠道屏障产生显著影响。结果表明，生物膜益生菌对IgG和sIgA的促进作用更强。多项研究表明，益生菌可以降低巨噬细胞分泌的促炎细胞因子IL-6的含量。本研究表明，只有生物膜益生菌可以降低IL-6水平。

对生物膜的免疫反应是复杂的。宿主的免疫系统很容易清除浮游病原菌，而病原生物膜通过多种机制阻碍宿主免疫细胞。免疫反应受挫和生物膜过强导致慢性炎症，对宿主组织造成附带损害。相比之下，生物膜益生菌似乎具有压倒性的抗炎作用，因为宿主不会对抗炎细胞因子产生反应，从而减少吞噬性炎症。益生菌生物膜刺激独特的免疫反应，这一点研究人员才刚刚开始了解，这需要大量的额外研究。

图6 (A) IgG， (B) sIgA， (C) IL-6， (D) TNF-α， (E) MDA， (F) T-SOD浓度。

9. 饲喂生物膜或浮游L-ZS9肠道微生物群落的犬粪样微生物多样性分析

图7A和B分别显示了生物膜和浮游L-ZS9喂养犬的粪便样品在门、属水平上的细菌群落。在门水平上，生物膜组中Firmicutes占优势，其相对丰度最高，而Proteobacteria的相对丰度最低。在属水平上，生物膜组乳酸菌的相对丰度显著高于其他组。生物膜组helveticus乳酸菌和动物双歧杆菌的相对丰度显著高于其他组。此外，在进行LEfSe区分不同组中的生物标志物微生物时(图7C)，在生物膜组中，粪便样本中的生物标志物细菌被鉴定为Lactobacillales-Lactobacillaceae-Lactobacillus(目-科-属)和Ruminococcaceae(科)。

益生菌可以通过调节肠道微生物群发挥有益作用。本研究发现生物膜组乳酸菌属数量显著增加，说明生物膜L-ZS9的使用可能会增加乳酸菌在胃肠道内的生长或粘附。双歧杆菌，一种被报道具有多种有益特性的益生菌，在目前的研究中，在生物膜组中也显示出明显的增加。相比之下，在其他实验中，大肠杆菌，一种类似于梭状芽胞杆菌的正常肠道微生物，在益生菌摄入组中有所减少。此外，据报道，在使用健康狗或患有胃肠道疾病的狗进行的几项益生菌研究中，肠杆菌科的数量有所减少。与这些研究一致，在L-ZS9给药组中，大肠杆菌(包括大肠杆菌)和肠球菌的相对丰度降低。由此可见，L-ZS9生物膜具有调节肠道菌群的积极作用。

图7 (A)门、(B)属和(C)细菌群落LDA LEfSe水平的粪便样本细菌群落热图。

10. 预测肠道菌群的功能基因

本研究通过PICRUSt预测了细菌基因的功能和代谢的KEGG通路。PICRUSt是一种基于16S rDNA测序数据预测功能基因谱的有效方法。为了确定浮游生物和生物膜组的功能轮廓的差异，Wilcox试验根据KO和COG进行(图8)。最近的一项研究也比较了益生菌处理的狗的肠道微生物群的功能变化但他们的数据与我们的不一致，我们的结果显示，参与碳水化合物代谢的基因相对丰度在生物膜处理组明显高于浮游生物处理组。与此同时，生物膜处理组涉及神经退行性疾病、系统和无机离子转运和代谢的通路的相对丰度明显较低。因此，潜在的分子机制有待进一步研究。

图8 根据（A）KO和（B）COG中的注释，浮游生物和生物膜组之间功能基因谱的差异。P值和FDR<0.05时，两组间物种差异显著。

11. L-ZS9代谢产物、肠道微生物多样性与血液免疫指标的相关性分析

为进一步确定犬血液免疫指标、犬肠道微生物群和L-ZS9代谢物之间的关系，计算了它们的相关系数( cor )，并将其关系可视化如图9所示。此外，详细信息见表S2、S3和S4。相关分析显示这三个变量之间呈三角形关系( P < 0.05 )。这些免疫指标，微生物或产生L-ZS9的代谢产物，以及它们之间的相互关系，进一步讨论如下。

我们的结果显示sIgA与12属7种相关，IgG与2属1种相关。如上所述，L-ZS9生物膜处理组的生物标记菌在这些微生物中被鉴定为乳酸杆菌(Lactobacillus)，其与sIgA正相关(cor = 0.8424, P<0.05)。以往的研究表明，乳酸菌能够促进sIgA的产生，目前的相关分析也证实了这一点。然而，虽然一些研究表明乳酸杆菌可以诱导IgG的产生，但我们的结果表明，粪便样本中的乳酸杆菌与血液样本中的IgG之间没有相关性。在这里，我们确定IgG仅在物种水平上与Bifidobacterium adolescentis正相关，这与先前的研究一致，即Bifidobacteria可以触发一些免疫反应。

除与上述微生物相关外，sIgA还分别与111种和31种不同类型的L-ZS9产生代谢产物呈正相关和负相关。与L-asparagine,L-glutamate, Ile-Asp, L-citrulline, N-acetyl-L-histine和cytosine 呈极显著正相关（cor>0.8），与L-glutamine呈极显著负相关（cor<0.8）。sIgA还与许多其他L-氨基酸（如L-proline、L-argine、L-phenylalanine、N6-acetyl-L-lysine、N6-methyl-L-lysine、N6,N6,N6-trimethyl-L-lysine 等）呈正相关（0.6<cor<0.8）。sIgA与大多数L-氨基酸之间的正相关可能是由于L-氨基酸可以帮助宿主发挥抗炎活性。此外，sIgA与L-rhamnose（cor=0.8424）呈强正相关，后者在生物膜细胞中显著上调（FC=57.8）。尽管很少有研究证明rhamnose能诱导sIgA的产生，但它能增强其他免疫刺激因子（IFNγ、TNF-α、IL-6 和IL-12）或免疫调节（IL-10）反应。同时， rhamnose 作为胞外多糖的前体参与了生物膜的形成。sIgA和L-rhamnose之间的直接关系需要进一步研究。

作为生物膜处理组的生物标志物属，乳酸杆菌与102种L-ZS9产生的代谢物呈正相关，与32种代谢物呈负相关，其中氨基酸是重要的，因为它们在生物膜L-ZS9及其浮游生物等效物之间存在显著差异。结果表明，乳酸菌与11种氨基酸呈正相关，与L-tyrosine、L-phenylalanine、L-glutamate、L-histidine, L-proline, L-citrulline、L-arginine、L-alanine、L-threonine和L-valine呈正相关，与D-proline呈负相关。氨基酸的吸收和转运与肠道微生物的代谢密切相关。因此，可以推测生物膜L-ZS9中氨基酸的改变可能会调节狗的肠道微生物群，影响包括原始居民在内的乳酸菌的丰度和补充益生菌。此外，乳酸杆菌也与某些EPS前体，包括α-D-glucose-1P、α-Dglucose、L-rhamnose、D-mannose-1P、UDP-N-acetylglucosamine、和succinate。鉴于EPS在调节微生物多样性方面起着关键作用，基于生物膜L-ZS9中显著增加的物质，这些EPS前体也可能参与生物膜细胞处理狗的肠道微生物调节。

我们的研究结果表明，生物膜L-ZS9通过多种机制表现出更好的免疫调节作用。代谢物、细菌组成和免疫因子之间的关系只是数学上的预测，还需要进一步的实验验证。

图9 在（A）正离子和（B）负离子模式下，L-ZS9产生代谢产物、狗肠道菌群多样性与狗血液免疫指标的相关网络。连接圆圈的红线表示正相关，而绿色表示负相关。紫色菱形表示产生L-ZS9的代谢物，绿色菱形表示狗肠道菌群在物种水平上的多样性，红色菱形表示狗肠道菌群在属水平上的多样性，蓝色表示狗血液免疫指标。M代表代谢物，G代表属，S代表种。每个数字代表一种代谢物或属或种，其详细信息列于表S2。

结论

本研究对L. paraplantarum L-ZS9的生物被膜和浮游细胞进行了比较，发现生物被膜状态比浮游状态表现出更高的密度和更强的抗性。这两种状态明显不同，非靶向代谢组学的结果表明，氨基酸和碳水化合物的代谢在生物膜模式下比在浮游模式下更活跃。此外，在生物膜状态下，饲喂植物乳酸杆菌L-ZS9犬的血液中sIgA和IgG显著升高，而浮游饲组与对照组的sIgA和IgG无明显差异。结果进一步表明，L-ZS9生物膜具有较好的免疫调节活性。此外，对犬粪便样品的微生物群多样性分析显示，生物膜组乳酸杆菌的相对丰度显著高于其他组。参与碳水化合物代谢的基因相对丰度在生物膜益生菌处理的犬中也较高。相关分析表明，肠道菌群中许多代谢物、若干属与sIgA或IgG之间存在相互作用。这可能解释了生物膜L-ZS9通过各种代谢物的产生调节肠道微生物群和宿主免疫活性的机制。

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生物膜,代谢,研究,细胞,浮游

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