lncRNA Xist 通过调控miR-98-5p/EDEM1介导七氟烷诱导的新生小鼠社交和情感障碍

2021-08-09 16:36 古麻今醉

研究表明大脑发育期间暴露于七氟烷会导致远期的社交能力和情感行为障碍，甚至增加患阿尔茨海默病的风险。

浙江大学医学院附属妇产科医院

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文章导读

研究表明大脑发育期间暴露于七氟烷会导致远期的社交能力和情感行为障碍，甚至增加患阿尔茨海默病的风险。七氟烷引起神经毒性的机制包括神经元调节失调，神经发生和海马及皮质发育障碍，神经元和少突胶质细胞死亡增加，以及神经生长/营养因子表达下降。然而，七氟烷引起神经毒性的具体分子机制仍不清楚。

近日浙江大学医学院附属妇产科医院麻醉科陈新忠教授和徐丽丽教授团队在CELL旗下著名期刊《Molecular Therapy Nucleic Acids》（IF=8.886）上发表了他们的重要研究成果“lncRNA Xist regulates sevoflurane-induced socialand emotional impairment by modulating miR-98-5p/EDEM1 signaling axis inneonatal mice”。首次提出了lncRNA Xist可以通过调控miR-98-5p/ EDEM1轴，抑制神经元凋亡和内质网应激，从而改善七氟烷诱导的社交和情感障碍。

研究内容

（1）七氟烷增加了新生小鼠和HT22海马神经元细胞凋亡和上调lncRNA Xist表达

为验证七氟烷对神经元细胞凋亡的影响，七氟烷暴露后，TUNEL染色结果表明新生小鼠海马内TUNEL阳性神经元的数量增加(图1A,1B)。AnnexinV-FITC/PI染色和流式细胞分析结果显示，七氟烷处理后HT22海马神经元细胞的凋亡率增加，包括早期和晚期凋亡(图1C，1D)。Western blots结果显示，七氟烷暴露后小鼠海马中凋亡标志物cleaved-caspase-3和Bax的水平增加，而Bcl-2的水平下降(图1E)。另外，RT-qPCR检测了lncRNA Xist在七氟烷暴露新生大鼠中的表达水平的变化，发现七氟烷暴露后lncRNA Xist表达显著上调（图1F），可能参与了七氟烷诱导的神经元毒性。

（2）lncRNAXist下调可减少七氟烷诱导的新生小鼠和 HT22神经元细胞的凋亡

为了进一步研究lncRNA Xist在七氟烷诱导的神经元毒性中的作用，作者用siRNA敲减了lncRNA Xist，并通过RT-qPCR (图2A)证实敲减效率。敲减lncRNA Xist后，Annexin V-FITC/PI染色和流式分析结果显示HT22海马神经元细胞的凋亡率显著降低，包括早期和晚期凋亡(图2B，2C)。TUNEL凋亡染色显示新生小鼠海马内TUNEL阳性神经元的数量降低（图2F,2G）。Western blots显示凋亡细胞标志物cleaved-caspase-3和Bax的水平下调，而Bcl-2的水平上调(图2D,2G)。上述数据表明，抑制lncRNA Xist 减轻了七氟烷诱导的新生小鼠和 HT22神经元细胞的凋亡。

（3）lncRNAXist 下调可改善七氟烷诱导的新生小鼠的社交和情感障碍

为进一步评估抑制lncRNA Xist对七氟烷暴露后新生小鼠的社交行为和情感的影响，作者采用了三种行为学实验，即高架十字迷宫，旷场实验，三室社交实验。高架十字迷宫实验表明与未敲减lncRNA Xist七氟烷暴露后新生小鼠组相比，敲减RNA Xist表达的新生小鼠组转移潜伏时间缩短（图 3A，3B)。旷场实验提示敲减RNAXist小鼠组中央区域活动时间较长，5分钟内探索总距离也更长(图3C-3E)。三室社交实验表明，七氟烷暴露后的新生小鼠在社交行为方面存在缺陷。与未敲减小鼠组相比，敲减RNA Xist表达的新生小鼠组与第二只新老鼠互动性强并与它互动的时间增加（图 3I，3J）。以上行为学结果表明抑制lncRNA Xist可以改善七氟烷暴露后新生小鼠的社交和情感障碍。

（4）miR-98-5p 是lncRNAXist下游靶基因

为进一步探究lncRNA Xist的下游靶点，利用Starbase软件对lnc RNA Xist的可能靶基因进行了分析，发现miR-98-5p是HT22神经元细胞中lncRNA Xist的下游靶基因（图4A,4B）。RT-qPCR显示抑制lncRNAXist后miR-98-5p显著上调（图4C）。双荧光素酶报告实验结果显示lncRNA Xist 野生型 (WT) 的荧光素酶活性在 miR-98-5p过表达细胞中显著抑制，而lncRNA Xist 突变型(Mut)荧光素酶活性未有明显变化(图4D)。抗 AGO2 RNA 免疫共沉淀实验 (RIP) 结果提示在 miR-98-5p转染的HT22 细胞中存在lncRNA Xist,miR-98-5p和AGO2复合体。以上数据表明，在HT22神经元细胞中lncRNA Xist靶向miR-98-5p抑制它的翻译。

（5）miR-98-5p过表达降低了七氟烷诱导的CHOP 和 Tribbles 相关蛋白3 (Trib3) 内质网应激信号通路介导的细胞凋亡

之前结果表明，七氟烷暴露会下调新生小鼠和 HT22 细胞中的 miR-98-5p水平（图 5A，5B）。为了进一步确定lncRNAXist是否通过靶向miR-98 调节七氟烷暴露后HT22细胞的凋亡，作者通过在HT22细胞中转染miR-98 mimic过表达miR-98。Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞结果表明，在共同暴露七氟烷和过表达miR-98后的回复实验表明，细胞凋亡率显著降低，包括早期和晚期细胞凋亡（图 5D，5E）。先前研究表明七氟烷暴露显著增加caspase-3和Bax的表达水平，下调了Bcl-2的表达水平。在共同暴露七氟烷和过表达miR-98后，这些蛋白质的表达水平与对照组相反（图 5F）。

此外，CHOP-内质网应激（ER）的重要组成部分，通过抑制自噬促进内质网应激诱导细胞凋亡。TRIB3 是各种细胞过程中的关键因子；上调TRIB3激活细胞凋亡，从而促进细胞生长抑制作用。另外为验证七氟烷是否引起内质网应激，Western blots显示七氟烷暴露后小鼠CHOP 和Trib3表达增加（图 5G， 5H）。过表达miR-98减少了七氟烷诱导的HT22细胞凋亡。敲减lncRNA Xist显著降低了ER应激相关蛋白CHOP和Trib3以及细胞凋亡，下调了caspase-3和Bax并显著上调Bcl-2表达。共抑制lncRNAXist 和抑制miR-98 逆转了神经元中这些蛋白质的表达水平（图5I 和 5J）。因此证实lncRNA Xist通过海绵吸附miR-98-5p调节神经元细胞的凋亡，并且lncRNA Xist可能通过调节miR-98在七氟烷诱导的神经毒性中发挥关键作用。

（6）miR-98-5p抑制EDEM在HT22神经元细胞中的翻译

为进一步探究 miR-98-5p 的下游调控机制，采用TargetScan 软件评估了miR-98-5p 的可能靶点，发现EDEM是miR-98-5p的潜在靶点（图6A，6B）。为进一步验证miR-98与EDEM1相互作用，双荧光素酶报告实验提示在miR-98过表达的神经元中，EDEM1野生型的荧光素酶活性被显著抑制，而EDEM1突变型的荧光素酶活性未有明显变化（图 6C）。此外，RT-qPCR发现在HT22 细胞中，过表达miR-98显著抑制EDEM1表达，相反抑制miR-98后EDEM1表达增加（图6D）。此外，western blot结果显示，转染miR-98mimic和NC mimic后，HT22细胞中edem1的蛋白表达变化与RT-qPCR的结果一致(图6E)。以上事实表明，EDEM1是miR-98的潜在靶点，并受miR-98的负调控。

（7）七氟烷增加新生大鼠和 HT22 细胞中EDEM1的表达，miR-98调控HT22细胞中的EDEM1介导细胞凋亡

EDEM1，甘露糖苷酶样蛋白，将错误折叠的糖蛋白从钙连接蛋白/钙网蛋白折叠循环招募到下游的内质网相关降解信号通路。为评估lncRNA Xist、miR-98-5p和 EDEM1之间的交互作用，作者观察到lncRNA Xist的下调显著降低了EDEM1表达，而共同抑制lncRNA Xist和miR-98，反向上调了EDEM1表达水平（图S2）。为验证EDEM1在七氟烷诱导的神经元凋亡的表达，RT-qPCR和Western blot结果表明七氟烷暴露后EDEM1表达显著增加（图 6G-6J）。免疫荧光染色结果还表明七氟烷暴露后EDEM1在神经元中表达增加（图 6K）。以上结果表明在新生小鼠和HT22神经元细胞中七氟烷上调EDEM1表达并诱导了ER。回复实验表明共同过表达EDEM1可以逆转Xist抑制后内质网应激标志物 CHOP 和 Trib3 以及caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平（图6L，6M）。以上数据表明在新生小鼠和HT神经元细胞中七氟烷暴露上调EDEM1表达并诱导内质网应激，可能是七氟烷诱导神经元凋亡机制之一。作者也证实 lncRNA Xist通过调节 EDEM1诱导内质网应激，在七氟烷诱导的神经毒性中起关键作用（图 6N，6O）。

总结：本研究提示lncRNA Xist下调可能通过抑制细胞凋亡和内质网应激，减轻七氟烷诱导的新生小鼠海马神经元的神经毒性以及社交行为和情感缺陷。miR-98-5p/EDEM1轴可能是lncRNA Xist在七氟烷诱导的神经毒性发展过程中作用的下游机制。该研究结果为临床预防或治疗七氟烷诱导的神经毒性提供了新的思路和可能的方法。

翻译：汤莹莹

审校：徐丽丽陈新忠

参考文献

1. Xu L, Xu Q, Dai S, Jiao C, Tang Y, Xie J, Wu H, Chen X.lncRNA Xist regulates sevoflurane-induced social and emotional impairment bymodulating miR-98-5p/EDEM1 signaling axis in neonatal mice. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Apr16;24:939-950.