【衡道丨笔记】「三甲病理现场」课程学习笔记（十）：黑色素瘤BRAF突变机理及BRAF检测

「白求恩·肿瘤病理学社」之「三甲病理现场」，旨在促进国内恶性黑色素瘤病理诊断的规范化、增强相关分子检测意识，提高恶黑精准诊断水平。

全球黑色素瘤发病率情况

•  在许多欧洲国家，恶性黑色素瘤（MM）发病率仍以每年3%-7%的速度增长，在美国，这一数字为2.6%

•  黑色素瘤好发于白种人，白种人主要为皮肤黑色素瘤，皮肤型黑色素BRAF突变率约为50%

中国黑色素瘤发病率情况和临床特征

•  中国黑色素瘤发病率全球11位，但死亡率全球第2

中国黑色素瘤临床特征

•  中国黑色素瘤年增长率为3%-5%，近年来呈快速增长趋势，每年新发病例约2万人

•  中国初诊黑色素瘤患者晚期占比过半，以肢端粘膜型为主

•  中国黑色素瘤患者BRAF突变占25.9%3，西方黑色素BRAF突变率接近50%

黑色素瘤疾病WHO新分类

•  黑色素瘤2018版WHO分类，根据遗传、病因学分为慢性日光损伤型，包括浅表扩散、恶性雀斑、结缔组织黑色素瘤；及非慢性日光损伤型，括Spitz、肢端、粘膜、先天性、蓝痣、葡萄膜型黑色素瘤

黑色素瘤的分子分型

•  黑色素瘤分子分型，以驱动基因来分，主要分为BRAF、NRAS、NF1以及三阴性，主要激活两条信号通路，一条是MAPK、另一条PI3K-mTOR，都起着促进增殖、抑制凋亡作用。

黑色素瘤的分子通路中关键靶点BRAF

•  BRAF基因位于7q34，是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

•  BRAF基因具有3个高度保守区，CR1.CR2.CR3（功能区，激酶结构域）

•  突变形式：点突变（主要）、缺失、扩增、融合

•  是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路的重要转导因子，具有促进增殖作用

BRAF突变为黑色素瘤常见突变

•  多种癌症中可发现BRAF突变

•  黑色素瘤中BRAF V600突变的发生率高，其中V600E (80%) 、V600K (15%)、V600R/M/D/G (5%)

BRAF是黑色素瘤的驱动基因

•  正常黑素细胞进展为黑色素瘤过程中的组织学变化和基因突变：

•  BRAF突变在早期色素痣阶段就可能会存在，并且随着黑色素瘤疾病的发展会始终存在，BRAF突变被认为是黑色素瘤的驱动基因，促进了黑色素瘤的病理发生

黑色素瘤MAPK信号通路

•  MAPK通路(即RAS/RAF/MEK/ERK通路)是一条生长因子信号转导通路

•  BRAF突变导致MAPK信号通路活性增强，细胞周期调控紊乱，细胞生长和迁移失控

•  BRAF抑制剂和MEK抑制剂联合应用，协同抑制MAPK通路，靶向失调的MAPK通路能够抑制肿瘤的生长和增殖，MEK是MAPK下游的重要靶点，BRAFi+MEKi抑制MAPK的上下游通路

黑色素瘤BRAF突变靶向治疗

•  靶向治疗：BRAF联合MEK抑制剂是BRAF V600突变的转移性黑色素瘤首选的治疗方式

•  目前被FDA和NMPA获批的BRAF/MEK双靶抑制剂仅有达拉菲尼+曲美替尼

黑色素瘤BRAF突变患者的预后差于BRAF野生型的患者

•  一项纳入了197例转移性黑色素瘤患者的前瞻性研究中，BRAF突变的患者与BRAF野生型患者相比：与BRAF野生型相比，BRAF突变黑色素瘤患者具有更差的总生存期

•  BRAF突变对从原发肿瘤到远处转移的时间没有影响，但一旦发生转移，其与更差的预后相关 ，这可能由于BRAF突变改变了疾病的遗传进化

•  BRAF突变的IIIC/IV 期黑色素瘤患者通常较年轻，与BRAF野生型IIIC/IV 期患者相比，总生存期更差

一项研究纳入切除型IIB、IIC或III期黑色素瘤患者。其中，BRAF突变阳性患者的5年总生存率（55%）低于BRAF野生型患者（70%）和NRAS突变患者（62%）

中国黑色素瘤患者中BRAF突变患者预后更差

•  BRAF突变患者更容易出现溃疡，临床病理分期偏晚，BRAF突变患者的预后显著差于野生型患者

2020年CSCO恶性黑色素瘤诊疗指南推荐：

•  所有黑色素瘤患者治疗前都应做BRAF在内的基因检测

诊断流程—临床取样

 NCCN黑色素瘤指南建议：

•  出现可疑着色病变时，患者应进行切除性活检，切除活检（椭圆形切口、钻取、或碟形/深刮) ，首选手术边距为1-3mm。

•  在某些解剖区域（如手掌/足底、指/趾、面部、耳朵）或当遇到非常大的病灶时，在病灶临床上最厚或最异常的部分行全层切取活检或钻取活检是可接受的。

•  多点活检（Multiple "scouting" biopsies）可能有助于指导非常大的病变的处理。广泛刮取活检可能是用于原位恶性小痣型黑色素瘤组织学评估的最佳选择。

CSCO恶性黑色素瘤诊疗指南（2020版）建议2：

•  对于临床初步判断无远处转移的黑色素瘤患者，活检一般建议完整切除，不建议穿刺活检或局部切除。如病灶面积过大或已有远处转移需要确诊的，可行局部切除活检。

•  前哨淋巴结活检是病理分期评估区域淋巴结是否转移的手段。肿瘤厚度>1mm推荐行前哨淋巴结活检。病灶厚度为0.8-1.0mm的可结合临床考虑行前哨淋巴结活检。

•  送检标本处理：标本需完整送检，手术外科医生做好标记切缘，10%中性缓冲福尔马林液固定达6-48小时。

诊断流程—样本处理（样本固定）

•  原发灶和多个转移灶（优先）尽量取足够的组织

•  及时固定：离体30分钟内固定（手术室完成）

•  固定液：10%中性缓冲福尔马林液

•  充分固定：完全浸没，固定液的量为组织的10倍

•  固定时间：活检标本6-12h，手术标本12-48h

•  分子检测优先选用石蜡样本

•  外院标本≤5年尝试检测，2年内保存条件好的蜡块的更佳

•  如果外院蜡块不符合要求，建议医生在本院重新取病灶检测

诊断流程—组织病理诊断

• 病理科处理组织：小标本24小时内、大标本48小时内

•  一般2-3天完成病理诊断（确诊是否为恶性黑色素瘤）

诊断流程—肿瘤异质性

同一患者原发性与配对转移性病灶之间分子遗传学改变有一定差异

•  不同类型转移性病灶之间与原发灶的突变符合率也有区别：淋巴结与内脏转移灶与原发灶 的一致性显著高于脑、皮肤转移灶

原发灶与转移灶不一致的原因

•  肿瘤进展中的异质性

•  样本选择异质性的存在

•  原发灶与转移灶存在BRAF突变不一致，应当1个原发灶+多个转移灶同时进行BRAF的分子检测

诊断流程—BRAF检测（病理学评估与DNA提取）

•  蜡块切片：组织切片厚度4-5um，大标本6张左右，活检穿刺标本10-15张

•  取一张常规HE染色染观察形态，画出肿瘤细胞（≥10%）聚集的区域

•  对应HE片将白片上的肿瘤组织刮入裂解液

•  按DNA提取的SOP提取肿瘤组织DNA

•  病理学评估是保证提取组织DNA质量的关键性步骤 

影响DNA质量的因素

•  FFPE组织蜡块质量：充分固定组织

•  组织固定方式、时间：活检标本：6-12小时，手术标本：12-48小时

•  蜡块保存时间：≤5年可尝试检测，2年内的标本结果更有保证

•  样本固定液浓度：10%中性缓冲福尔马林液

BRAF V600常用检测方法

Amplification Refractory Mutation System (ARMS, 扩增阻滞突变系统)

— 设计扩增引物的同时，加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团

特点：

•  ARMS 是最常用的方法

•  对已知突变（点突变、短的插入和缺失）进行检测

•  检测灵敏度较高，能够达到1%左右的最低检出率

•  操作一般比较简单，报告周期短（2-3天）

•  收费较低

BRAF V600常用检测方法

一代测序（Sanger测序法）

•  用不同的荧光素标记四种碱基，采用双脱氧末端终止测序法，通过采集 荧光信号来检测DNA序列，进而对DNA的点突变、插入、缺失进行检测

特点：

•  可以检测V600突变以及部分罕见突变2

•  检测灵敏度较低

•  标本中肿瘤组织含量要求相对较高（＞ 20%），检测时间较长

•  手工操作，检测时间长，报告周期1周以上

•  通量低，一次只能检测少数几个基因

二代测序技术（NGS）

•  能同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现大规模、高通量测序的目标

特点：

•  敏感性和特异性较高1

•  实现多种基因同时检测 

•  可广泛检测多种突变

•  需要生物信息学分析

•  报告时间一般10-14天

免疫组化（VE1抗体）

•  BRAF VE1抗体是目前国内唯一有注册证的用于BRAF V600蛋白检测抗体

•  NCCN指南推荐：IHC（VE1）阳性结果足以指导有症状或快速进展的患者使用靶向治疗。同时也鼓励使用分子检测方法进行二次确认；IHC（VE1）也可用于肿瘤细胞少而无法进行基因水平检测的病例

•  既往多项研究结果显示在恶性黑色素瘤中 BRAF 免疫组化法相较于多种分子检测方法均具有良好的敏感性（86%-100%）及特异性（94%-100%）

BRAF突变病理检测流程

•  BRAF阳性率结果会受各个环节影响，从临床取样开始到样本保持运输，到病理科样本处理，其中诸多环节，故应加强临床病理的沟通

总结

•  BRAF突变是黑色素瘤患者的常见驱动突变，中国人群突变率约25%，BRAF突变患者预后不佳

•  CSCO指南推荐所有确诊的黑色素瘤在治疗前都应进行BRAF突变检测，同时靶向治疗为BRAF突变患者提供巨大临床获益，建议所有恶黑患者确诊时即开展BRAF突变检测

•  检测全流程的规范化至关重要，选择有资质的实验室进行检测，同时应加强多科室间的合作，提高BRAF检测准确率，让更多患者获益