科研 | Cell: 感染训练宿主,提升菌群对病原体的抵抗力

2021
08/09

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微生态
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编译:微科盟Prolemon,编辑:微科盟木木夕、江舜尧。


导读  

宿主微生物群是抵御病原体入侵的强大屏障。抗生素治疗对微生物群的附带损害往往伴随着高度棘手的抗生素耐药病原体的扩张。在全球范围内,耐抗生素病原体每年导致70多万人死亡,预计在未来几十年将继续成为全球死亡的一个主要原因。因此,必须制定维持或改善宿主抗菌素防御的策略。定殖抵抗,即微生物群抵抗病原体定殖的能力,是通过多种宿主直接或间接介导的抑制机制组成。控制定殖抗性的因素以及与这一基本功能相关的多种机制仍有待充分探索。免疫系统在进化上取得成功的一个决定性特征是,它具有对抗病原体的先天和适应性记忆能力,促进宿主对随后的感染作出更快速、更强健的反应。虽然记忆曾经只被归因于适应性免疫系统,但现在人们认识到先天免疫系统也可以通过训练完全成熟并获得增强的免疫功能。此外从婴儿期开始,适应性和先天免疫系统不仅通过感染,还通过许多其他暴露(如饮食和微生物群)来促进成熟。宿主对之前遭遇的记忆是否会反过来塑造微生物群,目前尚不清楚。


 

论文ID


 

名:Infection trains the host formicrobiota-enhanced resistance to pathogens

感染训练宿主,提升菌群对病原体的抵抗力

期刊Cell

IF:41.582

发表时间:2021.01.15

通讯作者:Apollo Stacy,Yasmine Belkaid

通讯作者单位:美国国立卫生研究院


实验设计


图文摘要


结果

 

在本研究中,研究者发现既往的肠道感染增加了微生物群对后续感染的抵抗力,感染可诱导宿主牛磺酸的产生和牛磺酸利用菌群的增殖,肠道微生物群进而将牛磺酸转化为硫化物,抑制病原体的呼吸,隔离硫化物则可以恢复肠道微生物群中的内源性呼吸作用。


1.经过感染训练的微生物群增强了定殖抗性
为了评估感染对微生物群促进定殖抗性能力的影响,我们首先需要寻找一种模型病原体,其宿主的定殖主要由微生物群决定。因此,我们选择了医院相关病原体肺炎克雷伯菌(Kpn),并且是碳青霉烯耐药的临床分离物衍生物。尽管Kpn肠外感染可能危及生命,但健康的个体肠道微生物群中也可能存在低水平的Kpn,而Kpn定殖的住院患者发生继发系统性感染的风险要大得多。在小鼠中,经高剂量口腔感染后,Kpn可在大肠管腔内短暂检测到,直到感染后2天,在粪便中不再检测到(图1A和1B)。相比之下,口服链霉素(一种广谱抗生素)预处理的小鼠可始终维持着Kpn的高粪便负担(图1B)。这些结果支持了微生物群在控制Kpn定植中起主导作用的观点,使该病原体适合于我们的微生物依赖性定植抗性研究。为了研究既往感染如何影响对Kpn的抗性,我们采用了2个单独的小鼠模型:(1)接受野生小鼠粪菌移植后无菌小鼠的SPF级后代(wildR模型);(2)接受感染了食源性病原体鼠疫减毒株(DyopM)SPF小鼠粪菌移植后的无菌小鼠(post-DyopM模型) (图1 c)。第一个模型特别适合解决我们的问题,因为在野生小鼠的自然环境中,野生小鼠比标准实验室小鼠暴露于更多的感染。然而,我们承认,除了先前的感染之外,许多因素也可能导致野生小鼠的微生物群改变。因此,我们也转向了更明确的post-DyopM模型模型。该模型的一个关键优势是DyopM可局部扩张并诱发肠道炎症,但与野生型假结核病(Yptb)不同,DyopM可在感染后几天内完全清除。因此,该模型允许我们评估短暂感染过程对定殖抗性的影响,而不依赖于病原体的持久性。与对照组SPF小鼠相比,经过口腔感染后,wildR小鼠对Kpn的抵抗力增强(图1D),结果支持了wildR小鼠抵抗力增强主要是由微生物群介导的这一观点。此外,我们还观察到曾感染DyopM的小鼠对Kpn的抵抗增强(图1E)。时间进程显示,在DyopM感染后4周,post-DyopM小鼠Kpn的抵抗增强并可持续到DyopM感染后至少15周(图1E和S1A)。为了区分post-DyopM小鼠Kpn的抵抗增强中微生物群与宿主反应的作用,我们首先考虑了先前的感染可能会加速肠道排出的可能性。然而,DyopM感染后并没有影响肠道转运时间(图S1B)。接下来,我们广泛调查了大肠固有层(图S2A-S2C)的先天性和适应性免疫反应,这是Kpn定植的主要部位(图1A)。我们发现的最显著的免疫改变是,在DyopM感染后4周的小鼠中,CD8+T细胞表现出产生细胞因子干扰素(IFN)-γ的高潜能(图S2C和S2D)。因此,post-DyopM小鼠抵抗性增强可能是由于黏膜免疫反应的改变和/或对微生物群的改变。虽然这两种现象都可以发挥作用,但我们决定将探索重点放在微生物群的改变上。
为此,我们将post-DyopM小鼠或对照组小鼠的粪便微生物群定植于GF小鼠(图1C)。正如之前的报道,我们无法在转移的微生物群中检测到DyopM(图S1C)。使用这种方法,我们发现来自post-DyopM小鼠的微生物群足以增强对Kpn的抗性(图1F)。值得注意的是,在没有增强CD8+T细胞反应的情况下,微生物群导致耐药性发生了转移(图S2E)。这些发现表明,单一的轻度感染足以以一种增强对Kpn的抗性的方式重塑微生物群。接下来,我们分析了post-DyopM小鼠和wildR小鼠菌群的群落组成,目的是鉴定可能增强定殖抗性的普遍富集类群。不同于post-DyopM小鼠菌群(与原始SPF小鼠菌群作为对照),wildR小鼠菌群表现出更高的alpha多样性(与实验室化了的野生小鼠后代,或接受了实验室小鼠微生物群的无菌小鼠进行对照)(图S1D)。另一方面,wildRpost-DyopM微生物群可以根据β多样性分析(图1 g和1 h)区分虽然我们在高丰富的菌门(图S1G和S1H)中没有发现一致的主要变化,但一个通常较小的门Proteobacteria,是唯一在post-DyopMwildR (F2和F10代)中都富集的门。与对照小鼠相比,wildRpost-DyopMProteobacteria感染率从0.01%增加了约100倍(图1I)。在Proteobacteria门下的Gammaproteobacteria是已知的在感染和炎症的背景下会扩张的菌。然而,与对照菌群相比,post-DyopMwildR (F2和F10)中唯一显著增加的Proteobacteria纲是DeltaproteobacteriaBetaproteobacteria(图1J和S1I)。此外,将post-DyopM菌群转移到GF小鼠后,唯一保持富集的proteobacteria物种是deltaproteobacterium(图S1J;表S1)。因此,Deltaproteobacteria的富集与Kpn抗性增强相关,支持了这些细菌可能促进定植抗性的观点。

图1.感染训练肠道菌群提高定植抗性
(A) Kpn菌落形成单位(CFU)—感染训练过的微生物群增强了Kpn感染后1天(21-24小时)SPF小鼠肠道及黏膜的定殖抗性 (1个实验有2对笼,n = 10)。(B)对照组(未处理)和链霉素处理小鼠粪便中的Kpn CFU。点显示中值±95%置信区间(1个实验,n = 4-5)。(C)wildRpost-DyopM小鼠示意图。Kpn感染以初染SPF小鼠为对照。(D)对照组和F10野生wildR小鼠在感染Kpn 1天后的粪便中检测KpnCFU(2次合并实验,n = 14,倍减= 14)。用Grubbs的方法识别出一个异常值,并以α = 0.0001进行移除。(E) Kpn CFU, Kpn感染后第1天,在对照组和DyopM感染后第4周(2次实验,n = 10-14,减少倍数= 6)和感染yopM后>第15周(4次实验,n = 19-20,减少倍数= 13)的粪便中进行检测。(F)接受了野生小鼠的无菌小鼠粪便中Kpn CFU,与接受对照或DyopM感染后小鼠的微生物群移植无菌小鼠Kpn感染后1天(2个合并实验,n = 13-15,(G和H)在感染yopM后>第15周(n = 9-10), (G)对照和F2wildR小鼠(n = 11-12)和(H)对照和post-DyopM小鼠(n = 9-10)的16S rRNA数据的未加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)图。百分比代表每个PC所解释的方差。(I) post-Yptb DyopM后(4次实验,n = 18-20,增加了69倍)、post-Yptb WT后(1次实验,n = 3 - 9,增加了11倍)、F2 wildR (3次实验,n = 11 - 12,增加了164倍)和相应的对照小鼠肠道菌群中proteobacteria的相对丰度。(J)与对照组相比,post-Yptb后小鼠(n = 23-27)以及和F2 wildR (n = 11-12)相对于对照小鼠肠道菌群中Proteobacteria类的中值丰度的倍数变化。
 
2.感染训练过的微生物群为富集的牛磺酸利用类群
由于变形菌门(Proteobacteria)在post-DyopMwildR微生物群中的富集,我们推测它们可能具有共同的群落功能。为了探索这种可能性,我们检测了wildR(F2代)和post-DyopM的微生物群的鸟枪宏基因组。相对于其对照宏基因组,post-DyopM宏基因组富集了46种功能,而wildR宏基因组富集了379种功能 (图2A;表S2)。在这些富集的功能中,有18个是共享的(图2B),其中6个可分配到2个代谢途径:硫代谢和甲萘醌生物合成(图2C和2D)。与post-DyopMwildR小鼠中Deltaproteobacteria富集结果一致(图1 j),硫代谢通路的主要来源是Deltaproteobacterium post-DyopM metagenome(蓝色楔形,图2 d)和混合的Deltaproteobacteria wildR metagenome(蓝色楔形,图S3A)。Deltaproteobacteria的一个普遍特征是能够从含硫化合物(如牛磺酸或硫酸盐)的厌氧呼吸中获得能量 (图2E)。具体来说,这些细菌首先通过牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa编码)或硫酸盐腺苷酸转移酶(sat)将牛磺酸或硫酸盐转化为亚硫酸盐。然后,他们通过异化亚硫酸盐还原酶(dsr)使用甲萘醌电子梭提供的电子将亚硫酸盐还原为硫化物(图2E)。为了区分是牛磺酸驱动还是硫酸盐驱动的Deltaproteobacteria,我们评估了在post-DyopMwildR宏基因组中tpa和sat的丰度。tpa在两个宏基因组中都显著升高,但sat仅在wildR宏基因组中略有升高,表明是牛磺酸而不是硫酸盐促进了Deltaproteobacteria的增加(图2C)。
因为宏基因组学只能洞察微生物群的功能潜力,所以为了更直接地确定感染后肠道内牛磺酸是否确实升高。我们使用气相色谱分析了186个确定的代谢物的丰度,共鉴定出13个代谢物在post-DyopM小鼠的盲肠内容物中比对照小鼠更丰富(图2F和S3B;表S3)。这13种代谢物中有5种是黄嘌呤氧化酶的底物、前体或副产品(图S3B中粗体所示代谢物),黄嘌呤氧化酶是一种已知由肠道病原体诱导的宿主抗菌效应物。值得注意的是,在post-DyopM小鼠中,牛磺酸是增加最多的代谢物,这证实了我们基于宏基因组学的预测(图2F和S3B)。在肠道中,牛磺酸的主要来源是胆汁酸。胆汁酸作为宿主清洁剂在肝脏中合成并与牛磺酸结合,储存在胆囊中,然后释放到肠道中以帮助脂肪/油的消化(图2G)。一旦进入肠道,胆汁酸就会被特定的微生物群成员进行化学转化。这些转化包括去解,将牛磺酸从初级(宿主合成)胆汁酸中释放出来,使牛磺酸在整个微生物群中具有生物可利用性,以及去羟基化转化为次级(微生物衍生)胆汁酸 (图2G)。后者的活性由bai操纵子编码,该操纵子中的一个基因(baiE)在post-DyopMwildR宏基因组中共同富集,表明这些小鼠肠道菌群中胆酸介导的活性升高(图2C)。因为胆汁酸是在肝脏中合成的,我们评估了这个器官在感染后的广泛变化。然而,从组织学上看,post-DyopM小鼠并没有出现肝脏损伤的明显迹象(图S3D和S3E)。另一方面,post-DyopM肝脏的全组织RNA测序(RNA-seq)显示了894个基因的差异表达。792个上调的基因在与炎症、细胞因子产生和白细胞活性相关的通路中功能丰富表达(图S3F;表S4)。与此相一致,post-DyopM肝源性γδ、CD4+和CD8+T细胞表现出各种促炎细胞因子的增加(图S3G)。尽管这些细胞因子,特别是白细胞介素-17 (IL-17),与胆酸诱导的炎症相关,但只有3个介导胆酸信号传导/转运的基因(Vdr, Slc10a6, Slco1a1)在post-DyopM肝脏中有差异表达,这表明DyopM诱导的大多数胆汁酸代谢变化可能发生在转录后或肝外。支持这一观点的是,post-DyopM小鼠的胆囊增大(图S3H)和肠道总胆汁酸水平升高(图S3I)。因此,短暂的感染会导致肝脏(负责合成胆汁酸的器官)内的免疫力长期增强,同时也会导致胆囊(负责储存胆汁酸的器官)的改变。有趣的是,wildR小鼠也维持了肠道总胆汁酸水平升高(图S3J),但牛磺酸水平降低,这是微生物群消耗增加的潜在结果(图S3C)。由于胆汁酸具有高度的异质性,我们接下来用液相色谱-质谱分析了23种确定的胆汁酸的丰度。post-DyopM小鼠盲肠中总牛磺酸缀合胆汁酸以及单个初级和次级胆汁酸含量升高(图2H和S3K;表S3)。总的来说,这些结果表明,即使是短暂的感染也可能对宿主胆汁酸代谢产生长期的影响,导致肠道牛磺酸持续增加,从而导致利用牛磺酸的Deltaproteobacteria的增加(图2K)。
为了评估利用牛磺酸的 Deltaproteobacteria是否有助于定殖抗性,我们选择了deltaproteobacteriumBilophila wadsworthia ATCC 49260作为模型。正如对post-DyopMwildR宏基因组预测的一阳(图2C),该菌株在牛磺酸培养条件下增殖良好,而不是硫酸盐(图2I)。为了优先利用wadsworthia来丰富肠道微生物群,我们先用单培养的wadsworthia定植GF小鼠,然后将这些小鼠常规化为复杂的SPF微生物群。这一步骤导致B. wadsworthia增加了近8倍(图S3M;表S1),并足以增强对Kpn的抗性(图2J)。总之,这些结果支持了这样一种观点,即利用牛磺酸的Deltaproteobacteria的增加可以直接促进定殖抗性(图2K)。

图2 感染训练富集了牛磺酸利用微生物群
(A) 大于15周post-DyopM感染小鼠(将未感染的SPF小鼠作为对照)与F2 wildR小鼠(将F2 labR老鼠作为对照)的宏基因组功能比较。(B) post-DyopM和F2 wildR小鼠宏基因组中共富集的功能数量。(C) post-DyopM小鼠相对于未感染的SPF小鼠(n = 11)和F2 wildR小鼠相对于F2 labR小鼠(n = 10)的宏基因组中富集的功能中位数丰度的倍数变化。(D) post-DyopM小鼠宏基因组中富集的通路。饼图表示类群的相对贡献。(E) delta - proteobacteria能量生成模型。MQ,氧化甲基萘醌类;MQH2,减少甲基萘醌类。(F) DyopM感染后15周,对照组和post-DyopM小鼠盲肠内容物中牛磺酸的丰度(3个合并实验,n = 13-14,倍数增加= 4.7)。(G)微生物群将一级胆汁酸转化为牛磺酸和二级胆汁酸。(H) Dyopm感染>后15周,对照组和post-DyopM小鼠盲肠内容物中总牛磺酸偶联胆汁酸的丰富度(3个联合实验,n = 12-14,翻倍增加= 1.6)。(I) wadsworthia在培养基+载体、牛磺酸或硫酸盐中的生长产量(以600 nm处的吸光度测量)。(J)移植了野生小鼠粪菌的无菌小鼠的粪便中Kpn CFU,在Kpn感染后1天,常规的SPF菌群±预先植入wadsworthia (Bw)(2个合并实验,n = 10, fold decrease = 5.3)。(K)模型:感染后,利用牛磺酸的肠道类群的牛磺酸含量升高。
 
3.牛磺酸训练的菌群可以增强定植抗性
迄今为止,我们的研究结果支持了这样一种观点,即牛磺酸的升高本身可能会促进细菌的定植抗性。为了验证这一点,我们在感染Kpn之前,将小鼠置于含有牛磺酸的饮用水中2-3周(图3A)。粪便测量结果显示,该方法能够在不改变总胆汁酸的情况下,略微增加结肠远端可用牛磺酸(图3B)。值得注意的是,即使结肠牛磺酸水平轻微增加也足以增加对Kpn的耐药性(图3C)。牛磺酸除了作为微生物营养素,还被证明可以刺激宿主的抗菌防御。为了区分是微生物群还是宿主主要介导了牛磺酸增强的抗性,我们首先分别通过流式细胞术和RNA-seq检测了大肠固有层和上皮的免疫细胞组成。这些方法表明,单是牛磺酸既不能引起固有层的先天免疫反应,也不能引起适应性免疫反应,只能轻微地改变纯化上皮细胞的基因表达(所有的log2倍变化<0.5,图S4D-S4F;表S4)。有趣的是,近一半(10/21)的上调基因编码核糖体蛋白,这表明牛磺酸主要刺激上皮细胞的生长和翻译,而不是抗菌防御。接下来,我们评估了牛磺酸是否能增强缺乏微生物区系的小鼠对Kpn的耐药性(图S4G)。然而,牛磺酸对GF小鼠的保护作用并没有改变(图S4H)。虽然不如我们的SPF实验(图3C)强大,但我们的GF实验表明,在某些设置下,可能需要微生物群来增强牛磺酸的抗性。为了证实这一点,我们将牛磺酸或载体处理小鼠的粪便微生物转移到GF小鼠中。进一步支持微生物群的作用,牛磺酸培养的微生物群促进了对Kpn更大的抗性(图3D)。为了确定牛磺酸是否能增强对其他病原体的耐药性,我们使用了小鼠致病性大肠杆菌Citrobacter rodentiumC. rodentium主要在结肠定植,其毒性主要是诱导结肠隐窝增生。由于上皮结肠细胞是结肠腔内氧气的主要来源,隐窝增生可以促进C. rodentium有氧呼吸和腔内增殖。从感染后第3天开始,牛磺酸诱导C. rodentium粪便负担降低1至3 log水平(图3E和S4J),并能够减轻隐窝增生(图S4K和S4L)。因此,这些结果进一步证明了牛磺酸增强定殖抗性的能力。接下来,我们评估了牛磺酸对肠道微生物生态的影响。由于牛磺酸的代谢途径在分类上是广泛存在的,我们预测不同的分类群有可能受益牛磺酸并增生。与此相一致,16S图谱显示,在分类水平上,肠道微生物群的牛磺酸重构是高度可变的(图3F;表S1)。然而,鸟枪宏基因组学显示,这种重构在功能水平上是保守的,其中最大的增长之一是编码异化亚硫酸盐还原酶(dsr)的基因(图3G;表S2)。dsr基因产物催化牛磺酸代谢的最后一步(图2E),并且与牛磺酸塑造post-DyopMwildR微生物区系一致,它们的宏基因组也富集了dsr(图2C)。在牛磺酸培养小鼠的宏基因组中,dsr的主要来源是梭状芽孢杆菌(图3H),因此,许多梭状芽孢杆菌在牛磺酸治疗后也得到了增殖(图3F)。值得注意的是,这些分类群不同于post-DyopMwildR中dsr 的主要来源Deltaproteobacteria(图2D和S3A)。因此,补充牛磺酸和既往感染都使微生物群成员富集,这些微生物群在功能上共享通过dsr代谢牛磺酸的能力。牛磺酸代谢的一个主要副产品是有毒气体硫化氢,直接由dsr活动产生。基于我们的宏基因组数据(图3G),我们预测牛磺酸处理过的微生物群将比载体处理过的微生物群产生更多的硫化物。为了验证这一点,我们采用了允许我们调节微生物群的生长环境的体外培养法证实我们基于宏基因组学的预测,牛磺酸处理小鼠的微生物群对体外增加牛磺酸高度响应,产生的硫化物明显多于载药处理小鼠的微生物群(图3I)。综上所述,这些数据支持了这样一种观点,即用牛磺酸(一种胆酸衍生代谢物,通过致病暴露而升高)来训练微生物群,可以增强微生物群产生硫化物的能力(图3J)。

图3 牛磺酸培养的微生物群增强定殖抗性
(A)牛磺酸处理方案。在Kpn感染前,小鼠被饲喂了±200 mM牛磺酸的饮用水中2-3周。(B)对照与牛磺酸处理小鼠粪便中牛磺酸和总胆汁酸的丰度。(C) Kpn感染后1天,对照小鼠和牛磺酸处理小鼠的粪便中Kpn CFU(8个联合实验,n = 58-59)。(D) 对照或牛磺处理小鼠的微生物群移植给ex-GF小鼠,在Kpn感染后1天的粪便中Kpn CFU。(E)经牛磺酸处理的小鼠在C. rodentium感染5天后粪便中C. rodentium 的CFU。(F) 10个差异最丰富的物种,它们在3对对照和牛磺酸处理的小鼠中至少有1组显著(实验A、B和/或C)。物种根据它们最低的分类命名 (G)牛磺酸处理小鼠的宏基因组中值功能丰度(EC数)。(H)代表物种对dsr相对贡献的饼图。(I)对照和牛磺酸处理的小鼠的肠道微生物释放的硫化氢(J)模型:牛磺酸富集了产生硫化物的肠道菌群。
 
4.牛磺酸衍生物的硫化物抑制病原体的呼吸
在高浓度情况下,硫化氢可以抑制细胞色素氧化酶(有氧电子传递链的末端酶)的活性。病原体利用有氧呼吸获取不可发酵的生长底物,而牛磺酸可以增强微生物群的硫化物生产(图3I),我们提出了以下牛磺酸增强定植抗性的模型:在牛磺酸水平较低时,氧气使病原体激活获取不可发酵底物,而在牛磺酸水平高时(如在post-DyopM或牛磺酸补充小鼠中),牛磺酸来源的硫化物会限制病原体从获得这些底物(图4A)。为了测试我们的模型,我们首先采用了高通量方法,转座子测序(Tn-seq),以筛选体内适应度改变的Kpn Tn突变体。为了进行Tn-seq,我们通过对照和post-DyopM小鼠传递了12,000个Kpn Tn突变体的输入池。在这个实验设计中,如果一个特定的基因在2组小鼠中的1组中优先促进适应度,那么该基因的突变体将优先从该组的输出库中耗尽(图S5A)。为了识别这些突变体,我们扩增了与Tn插入相邻的Kpn基因组DNA,并对其进行了深度测序,从而确定了它们在输出库中的基因组位置和丰度。我们总共鉴定了125个和79个分别在对照组和post-DyopM小鼠中差异促进Kpn适应度的基因(表S5)。基于我们的模型(图4A),我们首先查询了调节无氧呼吸的Kpn基因的Tn-seq序列结果。在细菌中,呼吸作用不仅可以与氧一起进行,也可以与厌氧电子受体一起进行,如硝酸盐。虽然已证实的肠道病原体可以利用厌氧呼吸在肠道定植,但我们的模型提出,牛磺酸衍生的硫化物可特异性抑制有氧呼吸。因此,Tn-seq证实了在对照组或post-DyopM小鼠中,调节厌氧呼吸的基因无法对Kpn适应性做出差异贡献(图S5B)。接下来,我们查询了在不可发酵底物上介导生长的Kpn基因的Tn-seq结果。基于我们的模型,我们重点关注肠道病原体已被报道通过有氧呼吸在体内利用的基质,如甲酸盐(图S5B)。在我们检测的基因中,最引人注目的是,在1,2-丙二醇利用(pdu)位点的21个基因中,有4个基因促进了对照的Kpn适应性,而不是post-DyopM小鼠 (图4B和S5B)。1,2-丙二醇是微生物菌群发酵的副产物,但由于严格的呼吸性,它本身只能在电子受体存在的情况下被利用。厌氧电子受体可以促进Kpn在1,2-丙二醇上的生长,我们发现Kpn在1,2-丙二醇上与氧结合时生长最大(图4C)。基于这一发现,我们接下来进一步挖掘了我们的Tn-seq结果,即在体内1,2丙二醇上可能支持Kpn生长的末端氧化酶。事实上,Tn-seq鉴定出一种假定的氧化酶,与pdu locus一样,对对照组小鼠的Kpn适应性有贡献(图S5B)。编码该氧化酶的基因与cyxb编码的沙门氏菌细胞色素氧化酶bd-II的亚基基因同源(氨基酸序列同源性>68%)。为了证实Kpn cyxB促进1,2丙二醇的利用,我们将野生型(WT)与cyxB-突变体在以1,2-丙二醇为唯一碳源的最小培养基中培养。在空气中的氧气水平(21%),cyxB-突变体的适应度与WT相当(图4D)。另一方面,与肠道中发现的氧水平相当(<1%)时,Kpn WT显著超过突变体(图4D)。总的来说,这些数据支持了Kpn在体内通过细胞色素氧化酶bd-II清除氧来利用1,2-丙二醇的观点。作为我们模型的进一步测试(图4A),我们接下来评估了硫化物是否可以直接阻断1,2-丙二醇的利用。实际上,>250 mM硫化物可以有效地抑制Kpn在1,2-丙二醇上的生长能力(图4E)。相比之下,合成硫化物的前体,即牛磺酸结合的胆汁酸牛磺酸和牛磺酸,并不具有抑制作用,这表明这些前体转化为硫化物是抑制作用的必要条件(图4E)。我们的模型的另一个预测是,在低牛磺酸/硫化物条件下,当可以呼吸时,Kpn应该经历一个生长优势,从而能够战胜Kpn呼吸突变体。相反,在高牛磺酸/硫化物条件下,当呼吸受限时,Kpn不应该经历生长优势,因此对Kpn呼吸突变体的适合度更相等(图4A)。为了测试这些预测,我们将KpnWT和cyxB-用载体或牛磺酸处理小鼠的呼吸突变。正如我们所预测的,在对照小鼠中,WT超过了呼吸突变体,而在牛磺酸小鼠中,WT和突变体表现出相当的适应性(图4F和sue)。同样,在载体处理的小鼠中,WT比1,2-丙二醇利用突变体(pduQ-)更有竞争力,而在牛磺酸处理的小鼠中,WT和突变体再次表现出类似的适应度(图4F)。
接下来,我们用C. rodentium感染测试了我们的模型。与Kpn一样,C. rodentium利用有氧呼吸在肠道中定居。具体来说,C. rodentium利用cydAB编码的细胞色素氧化酶bd-I获取不可发酵底物,如甲酸盐 (图S5F)。正如预测的那样,>500 mM硫化物阻断了C. rodentium在含氧甲酸盐环境下的生长能力(图S5G)。此外,在对照小鼠中,C.rodentium WT最终超过了acydAB-呼吸突变,尽管与我们对Kpn的观察相似,WT在牛磺酸处理小鼠中的竞争优势被阻碍(图S5H)。总之,这些发现支持了一个总体模型,其中牛磺酸驱动的硫化物的产生增强了定植抗性,特别是通过抑制病原体的有氧呼吸能力,从而获得严格的呼吸基质(图4G)。


图4.牛磺酸衍生的硫化物抑制病原体呼吸作用
(A)牛磺酸增强定植抗性模型。(B) Kpn1,2-丙二醇利用(pdu)基因组织。上述灰色基因的数量表明对照小鼠相对于post-DyopM小鼠减少了1倍。(C) Kpn CFU在1,2-丙二醇(5mM)为唯一碳源±一个电子受体(50 mM)的条件下生长后增加了1倍。(D) Kpn WT和cyxb突变体在1,2-丙二醇±氧下生长后的竞争指数(CI,输出比除以WT的输入比)。(E)在1,2-丙二醇±硫化钠(NaHS)、牛磺胆酸盐(5mM)或牛磺酸(5mM)培养基上生长后,Kpn CFU增加的倍数。(F)在Kpn感染后1天,用牛磺酸处理的小鼠和载药小鼠的粪便中Kpn WT: cyxB- :WT: pduQ-的竞争指数。(G)模型:牛磺酸产生的肠道微生物群硫化物抑制了病原体的呼吸作用。
 
5.隔离硫化物可释放病原体的呼吸作用
鉴于微生物群产生硫化物的基线水平存在差异(图3I),我们接下来想知道稳态硫化物本身是否塑造了肠道微生物生态和定殖抗性。为了测试这一点,我们给小鼠饲喂含有硫化螯合剂次水杨酸铋的饮用水中,这种化合物通常是用于治疗胃痛的非处方药物(图5A)。铋通过形成不溶性沉淀来隔离硫化物,事实上,我们观察到,经过铋处理后,肠道微生物释放的硫化物显著减少(图5B)。基于这一观察结果,我们测试了以下模型:在铋缺乏的情况下,稳态硫化物限制呼吸机获取氧气,而在铋存在的情况下,硫化物隔离增加了氧气的可用性,促进了Kpn等病原菌的入侵(图5C)。此外,由于微生物群内在的呼吸作用,我们预测硫化物也会促进微生物群的增殖。我们发现,铋通过诱导杆菌分类单元的显著增殖,迅速改变了微生物群(图5D和5E;表S1)。该分类单元的分离显示为粪肠球菌,这是医院相关感染的常见原因(图5F)。与其他肠球菌不同,粪肠球菌可以通过有氧呼吸获得能量。与此相一致,全基因组测序证实了铋诱导的粪肠杆菌中存在细胞色素氧化酶(bd-I)(表S5)。除粪肠杆菌外,潜在致病性的γ -变形杆菌大肠杆菌在硫化物隔离后也有增殖(图5E和5F)。因为大肠杆菌能够有氧呼吸,它与粪肠杆菌的共同增殖支持了我们的模型,即稳态硫化物通过抑制低丰度、可能致病的呼吸作用来塑造肠道生态。根据我们提出的模型,硫化物不仅要限制内源性氧气呼吸作用,而且要限制侵入性氧气呼吸作用(图5C)。为了测试这一点,我们评估了硫化物隔离对定殖抗性的影响。正如我们的模型预测的那样,我们发现铋使小鼠容易被Kpn高度定植,使得Kpn的粪便负担增加了近5 log(图5G)。因此,我们的研究结果支持了这样一种观点,即通过隔离硫化物,铋可以促进潜在致病的、常驻的微生物群成员和入侵病原体的有氧呼吸。在解释这些研究时需要考虑的一个混杂因素是,除了隔绝硫化物外,铋还具有抗菌特性。然而,这些结果补充了我们的总体模型,即通过增加微生物群的硫化物产量,牛磺酸限制了病原体的呼吸,从而增强了定植抗性(图5H)。

图5 (A)铋处理方案。在Kpn感染前,小鼠被饲喂±20 mM的水杨酸铋饮用水12小时。(B)在离体培养过程中,经载体和铋处理的小鼠肠道菌群释放的硫化氢。(C)硫化物对肠道生态的影响模型。(D)在铋处理后0、20和36 h,小鼠16S谱之间的非加权的UniFrac距离的PCoA图。(E和F) 铋处理后0和36 h小鼠肠道菌群中的分类纲(E)以及粪肠杆菌和大肠杆菌(γ -变形菌门) (F)的相对丰度。(G)Kpn感染24 h后,在对照和铋处理小鼠的粪便中检测KpnCFU。(H)模型:感染暴露增加了牛磺酸的利用菌属,肠道微生物群将牛磺酸转化为硫化物,用于抑制病原体呼吸和调节微生物群。

讨论

 
我们正在进入后抗生素时代的“黑暗时代”,在那里,由于抗生素耐药性的蔓延,曾经可治愈的疾病可能成为威胁生命的疾病。目前,基于微生物的治疗的一个障碍是微生物群个体间异质性过大。在本研究中,我们发现短暂性感染建立了长期的“元机体记忆”。与传统的免疫记忆不同,元生物体记忆依赖于宿主和微生物群相互依赖的功能。感染后,宿主放大其胆汁酸的生产/运输,反过来,微生物群将胆汁酸衍生的代谢物牛磺酸转化为抗菌硫化物。因此,只有这些功能结合在一起,才能增强后机体对继发感染的抵抗力。由于微生物区系的功能,即牛磺酸的代谢分布广泛,克服了微生物区系组成中个体间异质性的障碍。此外,硫化物的目标,有氧呼吸,是一个广泛分布的毒力因子。虽然我们的工作重点是感染引发的牛磺酸如何功能性地重塑微生物群,但我们的发现并没有完全排除免疫系统的作用。事实上,牛磺酸的细胞运输对于免疫记忆的建立是至关重要的,而且,除了牛磺酸,我们的数据表明肠道感染还会引起先天免疫效应黄嘌呤氧化酶和微生物代谢物甲萘喹酮,其前体可诱导抗菌肽。因此,免疫系统可能与微生物群协同工作,促进感染后的定殖抗性。我们的研究表明,胆汁酸衍生的牛磺酸有助于抗定殖,但如果情况属实,这就提出了一个问题:为什么胆汁酸并不总是维持在高水平。最有可能的答案是,过多的胆汁酸与各种炎症性疾病和癌症有关。尽管如此,胆汁酸会因肠道感染而上调,最有可能的原因是胆汁酸具有抗菌作用并有助于病原体清除。总之,我们的工作强调了牛磺酸和硫化物对肠道菌群抗感染的可训练性的关键贡献。通过探究病原接触对定殖抗性的影响,我们发现宿主的超微生物通过用牛磺酸滋养其肠道微生物群来适应感染,这是一种促进微生物群产生硫化物的策略,并确保其增强对未来病原体入侵的抵抗力。


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关键词:
微生物群,宏基因组,病原体,抵抗力,牛磺酸,硫化物,胆汁酸,肠道

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