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科研 | Food Funct：低FODMAP饮食对肠易激综合征患者肠道菌群指纹的影响

2021

08/06

微生态

A-

A+

肠易激综合征（IBS）是一种以腹痛和排便习惯改变为特征的功能性胃肠道疾病。

编译：微科盟花城，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

肠易激综合征（IBS）是一种以腹痛和排便习惯改变为特征的功能性胃肠道疾病。IBS患者报告说，FODMAP(Fermentable Oligosaccharides, Disaccharides, Monosaccharides,and Polyols)（可发酵低聚糖、双糖、单糖和多元醇）饮食会诱发或加重他们的症状。据报道，低FODMAP饮食（LFD）能改善50%-80%的IBS患者的症状。本文的目的是通过测定粪便微生物组成，对16S rRNA基因V3-V4区进行测序，来确定IBS对LFD有反应和无反应的患者。32名IBS患者，其中29名为女性（90.62%）和3名为男性（9.37%），进行了为期四周的LFD干预实验，评估对IBS疾病的影响。结果显示，22名参与者为应答者（68.75%），10名参与者为无应答者（31.25%）。进行LFD干预前的扩增子序列变异（ASVs）差异丰度分析表明，应答组中存在Prevotella 9和Veillonella菌属，无应答组中存在Barnesiella、Paraprevotella、Bifidobacterium 和 Ruminococcus 1菌属。LFD干预后，仅在中应答组发现了丰富的ASVs，分别属于Veilonella、Butyrivibrio和Ruminiclostridium 6菌属的5个ASVs。采用线性判别分析（LDA）对患者进行反应性分类，考虑5个细菌属的基线丰度，LDA准确率为96.87%，对有应答组和无应答组的正确率分别为95.45%和100%。这些结果表明，细菌生物标志物有助于根据对LFD的反应性对IBS患者进行分类。

论文ID

原名：Intestinal microbiota fingerprint in subjects with irritable bowel syndrome responders to a low FODMAP diet

译名：低FODMAP饮食对肠易激综合征患者肠道菌群指纹的影响

期刊：Food & Function

IF：5.396

发表时间：2021.03.17

通讯作者：Berenice Palacios-González

通讯作者单位：墨西哥国家医学院

实验设计

结果

1、研究人群

在92名受试者中，有15人不符合ROME III IBS诊断标准；符合这些标准的人中，有14人在过去三个月内服用了抗生素。在最初招募的其余63名参与者中，有20名被排除在外，原因是自我报告在饮食治疗期间缺乏对饮食和抗生素的坚持。两名受试者在4周的随访中失踪。三名受试者停止了他们的参与。完成试验的六名参与者在基线检查时提供了不合格的粪便样本，或者不符合随后DNA扩增所需的质量标准。根据VAS-IBS自报症状，将其余32名IBS患者分为LFD应答者（R）和无应答者（NR）。68.75%的受试者被归类为R（R: n = 22），其中女性20例（90.9%），男性2例（9.09%）。31.2%的参与者为NR（NR: n = 10），其中9名女性（90%），1名男性（10%）。根据IBS亚型，R组包括IBS-C（n = 16）、IBS-D（n = 2）和IBS-M（n = 4）患者，NR组包括IBS-C（n = 6）和IBS-M（n = 4）患者。

2、研究人群的身体评估、临床和饮食特征

对32例患者的身体评估、临床和饮食数据进行了分析。LFD处理后NR组体脂率有显著性差异（NR = 32.9% ± 4.39 vs. R = 36.2% ± 5.93;p < 0.05）（表1）。R组在所有症状方面均表现出显著改善（p <0.001），而NR组仅在便秘、胀气和腹胀方面表现出改善（p < 0.05）（表2）。饮食是肠道微生物种群组成和功能的重要驱动力。此外，饮食信息可能有助于了解肠易激综合征患者肠道菌群组成调节的反应性或理解。因此，对两组患者LFD前后的饮食摄入量进行了分析（表3）。在能量、大量营养素、纤维、维生素C、叶酸、铁、钙和钠的摄入量方面，组内、组间或时间上没有显著差异。然而，两组都有低纤维消耗和高钠摄入量。LFD后R组维生素A摄入量较高。在LFD之前，R组的饮食特点是高肉类-家禽和谷类-面包/中等糖和脂肪以及低蔬菜、豆类和乳制品。LFD后，R组显著降低脂肪消耗（3.8 (2.13–6.92) vs. 1.8 (0.63–3.58); p< 0.05）。NR组LFD前的日粮以高肉禽粮面包和低豆类为主。虽然蔬菜和糖的消耗量高于R组，但没有达到统计学意义。

表1 身体评估、生化参数与IBS亚型

表2 LFD前后的视觉模拟评分表（VAS-IBS）值（cm）

表3 LFD干预前后有应答者与无应答者的饮食分析

3、IBS受试者和非受试者的粪便微生物群

因为干预前各组肠道微生物群的分类差异可能会影响对LFD的反应性。两组的基础肠道微生物群均具有特征性。生物信息学分析通过从32名参与者获得的序列进行。在质量控制和嵌合体去除后，使用DADA2工具，获得1795 602个序列，平均每个样本有27 206个读数。通过对单个样本的单个读数进行分组，确定了6469个ASVs。通过计算物种积累图来鉴定大多数属，并捕获微生物多样性和遗传丰富度。随后，每个样本的读数被稀释到最小总样本深度的90%（每个样本7374个读数），足以解决微生物多样性问题。

4、LFD应答者和IBS非应答者的α和β多样性相似

关于α多样性指标（观察到的OTUs、Shannon和Simpson），发现了非组内或组间显著差异（图1A）。根据加权和非加权UniFrac距离，发现非组内或组间显著差异（图1B）。在门水平上，LFD前后两组的细菌群落均以Firmicutes、Bacteroidetes、Tenericutes和Proteobacteria为主。Verrucomicrobia、Cyanobacteria、 Fusobacteria和Actinobacteria数量较少（图2A）。在类水平上，主要表现为Clostridia、Bacteroidia、 Mollicutes、Negativicutes、 Gammaproteobacteria, Verrucomicrobiae和Alphaproteobacteria（图2B）；在目水平上，主要表现为Clostridiales、Bacteroidales、Anaeroplasmatales、Verrucomicrobiales、Pasteuralles、Selenomonadales、 Rhodospirillales、Enterobacteriales、 Betaproteobacteriales、Ganastraerophilales、Lactobacillales、 Mollicutes RF39和Erysipelotrichales（图2C）。

图 1 低FODMAP饮食（RB）前应答组、低FODMAP饮食（RA）后应答组、低FODMAP饮食（NRB）前无应答组和低FODMAP饮食（NRA）后无应答组的α和β多样性(A）；观察OTUs、Shannon和Simpson指标(B）。左边，未加权UniFrac；右边，加权UniFrac。使用Wilcoxon秩和检验的α多样性成对比较。β多样性置换方差分析（PERMANOVA）。P <0.05。

图2 低FODMAP饮食前反应组粪便微生物组、低FODMAP饮食消耗（RA）后反应组、低FODMAP饮食消耗前无应答组和低FODMAP饮食消耗（NRA）后无应答组(A）门级（B）类级（C）目级。

5、IBS受试者和非受试者共有的前50 个含量丰度的ASVs

随后，过滤和去除具有未分配分类法的ASVs，并根据丰度对产生的ASVs进行排序。在两组患者中，分别在LFD前后获得了50种最常见的ASVs及其丰度分布。在LFD之前，前50个ASVs被鉴定为5个细菌科7个细菌属的成员。

在科水平上，ASVs被划分为类水平Bacteroidaceae、Prevotellaceae、 Ruminococcaceae、Rickenellacea和 Lachnospiraceae的成员；在属水平上，ASVs被划分为Bacteroides、Prevotella 9、 Ruminococcus 2、 Alistipes、Lachnospiraceae NK4A136 group、 Ruminococcaceae UCG-002的成员（图3A和B）。经LFD鉴定，前50名ASVs为6个菌科8个菌属的成员。在科水平上，ASV可分为Bacteroidaceae、Prevotellaceae、 Anaeroplasmataceae、Ruminococcaceae、 Rickenellacea和Lachnospiraceae；属水平分类为Bacteroides、Prevotella 9、Anaeroplasma、 Alistipes、Subdoligranulum、 Faecalibacterium、[Eubacterium] eligens group和Roseburia（图3C和D）。

图3 反应性（R）和非反应性（NR）受试者中最丰富ASVs的分类。在科和属水平上进行分类的50个最丰富的ASV（A）；低FODMAP饮食消耗前的科水平（B）；低FODMAP饮食消耗前的属水平（C）；低FODMAP饮食摄入后的科水平（D）；低FODMAP饮食消耗后的属水平。

6、在LFD前后，有应答者和无应答者个体具有不同丰富的ASVs特征

特定的类群可能会影响LFD的反应性并区分R组和NR组。DeSeq2差异丰度分析用于鉴定类群间差异丰度的分类群。在LFD之前，在R中发现了3个显著更丰富的ASVs，2个属于Prevotella 9，1个属于Veillonella属（分别为26.4、26.4和23.4倍富集），而在NR中显著更丰富的ASV属于Baesiella、Pararrevotella、Bifidobacterium和Ruminocococus属（25.2、17.8，分别为16.8倍和14.5倍富集（图4A和B）。LFD后，仅在R中鉴定出显著更丰富的分类群，反映出属于Veillonella和Butyrivibrio的2个ASVs（分别为21.7和21.3倍富集）和属于Ruminiclostridium 6属的5个ASVs（20.6-22.2倍富集）的过度代表性（图4C和D）

图4 低FODMAP饮食摄入（LFD）前后应答组（R）和无应答组（NR）受试者 ASVs 的差异丰度分析（ A）；LFD前ASVs标准化计数的倍数变化，FDR-Benjamin-Hochberg校正p <0.05用红三角表示（B）；LFD前差异丰富的ASVs在门和科水平上的分类学分配，有色ASVs与其在科水平上的分类学分配相对应（C）；LFD后ASVs标准化计数的倍数变化，FDR-Benjamin-Hochberg校正p <0.05用红三角表示（D）；LFD后差异丰富的ASVs在门和科水平上的分类学分配，有色ASVs对应于厚壁菌门，它们在科水平上的分类学分配。

7、基于PCA的肠道微生物属线性判别分析通过LFD反应性对IBS患者进行了准确的鉴别

为了研究细菌标志物区分应答者和无应答者的辨别能力，在LFD前后，R和NR中鉴定的294个细菌属的标准化计数被考虑用于主成分分析（PCA）构建（图5A）。未观察到组间分离。LFD前，主成分1（PC1）占9%，PC2占总数据变异的8.30%，LFD后，PC1占11.8%，PC2占总数据变异的7.40%（图5B）。本文考虑PCA的前5个PC1变量及其标准化细菌属计数作为线性判别分析（LDA）的输入变量，以区分饮食治疗前对LFD有反应和无反应的IBS患者。共有22名R和10名NR个体，21名和10名个体根据反应性进行了正确分类，反映出LDA准确率为96.87%（图5C和D）

图5 低FODMAP饮食摄入（LFD）前后反应性（R）和非反应性（NR）受试者的维度缩减和判别功能构建。在LFD前后使用总ASV构建PCA。采用特征向量最小的五个主成分1（PC1）变量构造线性判别函数并进行后验预测（A）；LFD消耗前的主成分分析（PCA）图（B）；LFD消耗后的PCA图（C）；线性判别分析（D）；LFD应答者和无应答者的LDA预测及预测精度。

结论

饮食干预是治疗肠易激综合征的一种方法。随机对照试验表明，低含量可发酵低聚糖、双糖、单糖和多元醇的饮食可改善IBS症状，饮食指南建议采用这种方法治疗某些IBS患者的症状。因此，新的证据表明，由于IBS的细菌发酵受损，其复杂的病因包括肠道微生物群失调，以及多种环境因素，主要是饮食成分，因此，对所有IBS患者的胃肠道症状进行独特的饮食干预是不可行的，确定肠道微生物组成和症状数据与阐明肠道微生物群可能介导IBS中LFD有效性的机制相关。在本研究中，根据摄入低FODMAP饮食后VAS-IBS记录的数值，将患者分为有反应者（R）和无反应者（NR）。在本研究中，68.7%的受试者为R，31.2%的受试者为NR；这与先前报道的LFD对IBS症状学的影响一致。

饮食方式的临床有效性应与其对足够营养摄入的影响进行比较。低FODMAP饮食排除了许多食物，调节微量营养素的摄入，如钙、铁、锌、叶酸、维生素B和D、抗氧化剂和膳食纤维。这种调节强调了限制FODMAP限制持续时间的重要性，从而避免长期微量营养素缺乏。低纤维饮食限制发酵细菌产生的肠道短链脂肪酸（SCFA），这对肠道健康和适当的免疫功能至关重要。相反，高脂肪饮食与粪便中花生四烯酸和脂多糖（LPS）的富集以及血浆促炎症介质的增加有关。因此，我们不能排除脂肪摄入量的减少通过影响肠道微生物群和炎症反应部分促进这些个体症状改善的可能性。

另一方面，在本研究中，两组的能量和大量营养素的摄入量均不受低FODMAP饮食一个月的影响。然而，两组都报告低能耗；这可能是由于用于评估习惯性饮食摄入的工具（24小时饮食回顾）。这些工具包含饮食报告中固有的错误；因此，大多数受试者无法解释他们摄入的所有食物，也无法准确估计大多数食物的份量。

群体内和群体间差异不显著；这与IBS患者对LFD反应无差异和多样性的研究一致。相反，LFD后的多样性较低。尽管存在争议，但研究中观察到的这些差异可能共同表明，LFD对IBS个体肠道微生物多样性具有不同的影响，并且可能在营养可用性发生变化时具有不同的适应能力，以及将低FODMAP食物引入受试者饮食而导致的饮食多样化。然而，这需要进一步研究。

在本研究中，在基线检查时排名前几位的ASVs被鉴定为Bacteroidacea、Prevotellaceae、Ruminococcaceae、Rickenellacea和Lachnospiraceae的成员。即使这些分类群在所有患者中都是一致的，R组的这些细菌分类群的丰度也更高，这意味着粘蛋白的利用和替换以及次级代谢物和丁酸盐的运输。这些分类群产生的代谢活性和代谢物在LFD受试者中可能具有生理优势，使他们最有可能经历与结肠扩张和内脏过敏有关的症状缓解，这些症状主要是由气体产生和短链碳水化合物的渗透效应引起的腔内压力升高引起和加重的。

有趣的是，在LFD之后，本文在所有个体中发现了最丰富的ASVs中的粪杆菌成员。已知 Faecalibacterium 可抑制IL-12和刺激IL-10的分泌。这种细菌的大量移位似乎与先前报道的在饮食限制FODMAP后Faecalibacterium种类减少相反，尽管它不一定反映出增加的丰度；取而代之的是，它的位移表明它的位置不同于微生物的结构，以响应饮食的变化。本文还观察到最丰富的ASVs中存在着Anaeroplasma。Anaeroplasma的减少与粪便硬度的增加有关。因此，增加这些分类群的丰度可能意味着减轻R和NR个体的便秘。

Firmicutes菌属，属于真杆菌属。直肠上调寡糖转运蛋白的存在。在这项研究中，Eubacterium eligens和 Roseburia是LFD后最丰富的ASVs之一，反映了易受这些分类群限制饮食中FODMAP的细菌群的置换，具有潜在的抗炎作用，可能有利于宿主微生物形成免疫机制。然而，这些分类群的丰度在R和NR类群之间高度相似，R类群的丰度略高。

之前研究分析随机分配的具有中度严重IBS症状的患者的数据，这些患者接受了为期四周的传统IBS或低FODMAP饮食。还进行了与健康对照组相关的多变量判别分析，以描述患者细菌谱，使用GA-map™干预前后粪便样本16S rRNA 异常检测。虽然有助于区分LFD的反应，影响和参与肠道微生物群不能完全阐明从班纳特的研究。这部分是因为GA-map™ 16S rRNA 失调试验不能提供肠道微生物群落结构的组成数据，如丰富度和多样性，这与提供微生物生态学的见解高度相关；它也不能识别或量化其他分类群，除了这些相关的测试方法，最初是为了提供一个临床工具，以测试粪便中的失调。因此，本文通过16S rRNA测序对低FODMAP饮食前后的粪便微生物群组成进行了表征，以确定对LFD-IBS有反应和无反应的个体中差异丰富的分类群。

本文假设特定的分类群可能会影响LFD的反应性，并在食用LFD之前将R与NR区分开来。通过对ASVs的差异丰度分析，本文发现在R个体中Prevotella 9成员的变化 > 20对数倍。因此认为这些分类群的富集可能有助于产生潜在的抗炎性SCFAs，主要是丙酸；这种对比也反映了NR免疫调节作用的潜在降低。有趣的是，在R个体中，本文还观察到促炎性细脉菌类群的富集度高达20倍，据报道，在肝脏疾病（如肝细胞癌）的肠道中也增加了。在NR中观察到双歧杆菌成员的富集度高达16对数倍。不同种类的双歧杆菌是有助于维持肠道健康的重要益生菌微生物内稳态和肠道上皮屏障完整性。然而，要了解细菌种群的生态作用及其对宿主生理的影响，本文必须将其视为复杂微生物生态系统中积极相互作用的成员。最近在大肠腺瘤或癌患者中发现双歧杆菌的丰度较高，最近，共生假长双歧杆菌与胰腺癌的发生有关。本文认为，双歧杆菌成员的不规则扩张反映了其作为致病菌在NR个体肠道微生物生态系统中的可能共生相互作用。然而，这一观察结果需要进一步的研究来阐明其与人体宿主在功能性胃肠疾病中的共生相互作用。我们还观察到促炎性巴氏杆菌的富集度高达20倍，据报道，在肝细胞癌患者的粪便中也增加了这种富集度。因此，R和NR个体中促炎性和抗炎性分类群的丰度可能增加，尽管微生物结构不同，可以反映细菌群落对保存抗炎类群的适应，以抵消对有害细菌增强的免疫反应性。

LFD后，仅在R个体（相对于NR）中观察到在所有不同丰度的ASVs中高达20对数倍的富集。潜在的促炎性细脉内拉ASVs仍然高度代表，但LFD后Butyribrio属成员的比例过高。Butyrivibrio属成员主要来自Clostridiumcluster XIVa，据报道IBS增加。丁酸酯是丙酮酸发酵的主要产物。肠道微生物群、CO₂和H₂产生的许多产品是主要的终末细菌发酵产物。这些产物可能有利于内脏过敏引起的结肠气体含量增加和腹痛，表明这些分类群的过度表达可能会加重LFD后IBS患者的胃肠道症状。这些发现共同表明，在LFD后，IBS受试者最有可能在某些分类群的丰度上经历巨大的变化，如果高FODMAP食物重新引入到饮食中是不充分的或没有营养学家的监督，可能会加重IBS症状。

最后，本文利用PCA前5个PC1变量（具有较低特征向量）的标准化细菌属计数进行线性判别分析（LDA），探讨了在属水平上区分IBS应答者和LFD无应答者的细菌标记鉴别能力。反应性分类正确率分别为95.45%和100%，LDA准确率为96.87%。这些数据证明肠道微生物生物标志物在分类IBS患者对FODMAP饮食的反应性方面的有用性，并提供可能的机制性见解，暗示饮食的临床有效性，由细菌-宿主相互作用和肠道微生物组的功能能力介导。

本文的研究有一些局限性，但也有一些优势。本文的样本量很小，主要由女性组成，部分原因是男性参与者放弃了这项研究。从这项研究中无法推断微生物群组成和LFD反应性的性别差异。然而，IBS的全球流行病学背景反映出男性和女性IBS的估计发病率。因此，在女性中更常见。IBS主要影响墨西哥的妇女。然而，两性的肠道微生物组成数据可以帮助研究人员更好地理解IBS患者性别驱动的机制和病理生理因素。IBS应答者和非应答者肠道微生物群的观察差异可能影响与细菌代谢、肠道免疫系统或肠上皮完整性相关的病理生理机制，本研究无法推断其功能。然而，考虑到上述发现，这些不同的分类群可能与宿主的免疫反应性和/或肠上皮屏障损伤有关，这意味着这些分类群在IBS个体中的生态作用和功能能力不同，这需要进一步研究。

本研究探讨了细菌标志物在属水平上的鉴别能力，以便在饮食治疗前鉴别IBS应答者和LFD无应答者。对R和NR之间的ASVs进行差异丰度分析，可能与饮食反应性有关。细菌属计数的线性判别分析（LDA）准确率为96.87%，表明肠道微生物生物标志物在排除FODMAP饮食前根据反应性对IBS个体进行分类的有效性。