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常州大学&中科院 | Environ. Res.：大陆尺度下低砷稻田土壤微生物砷解毒基因的模式

2021

08/06

微生态

A-

A+

微生物在稻田土壤中介导砷的解毒作用，决定了砷在土壤中的行为和对水稻的可利用性。

编译：微科盟清韵，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

导读

微生物在稻田土壤中介导砷的解毒作用，决定了砷在土壤中的行为和对水稻的可利用性，但对低砷稻田中功能基因的结构和丰度以及驱动力知之甚少。为了探究砷解毒功能基因的模式，从中国四个气候带的39个稻田中收集了429份土壤样品，其砷含量范围为9.76~19.74 mg kg^-1。利用GeoChip分析参与砷解毒的功能基因，共检测到三个砷解毒基因：aoxB、arxA和arsM。功能基因的多样性和丰度在不同的采样点之间都有明显的差异，并沿砷梯度下降。砷解毒基因由细菌、古细菌和真核生物携带。冗余分析（RDA）表明，土壤样品根据它们所在的气候带和大陆尺度的砷梯度进行分组聚类。土壤pH值、年平均温度（AAT）、砷、年平均降水量（AAP）和CEC是塑造功能结构的最重要因素。结构方程模型（SEM）显示AAT、pH和砷含量直接影响砷解毒基因丰度。这些发现提供了稻田土壤中参与砷解毒的微生物群落的整体情况，并揭示了气候因素在大空间尺度上塑造功能基因的重要性。

论文ID

原名：Patterns of microbial arsenic detoxification genes in low-arsenic continental paddy soils

译名：大陆尺度下低砷稻田土壤微生物砷解毒基因的模式

期刊：Environmental Research

IF：6.498

发表时间：2021.06

通讯作者：肖娴；梁玉婷

通讯作者单位：常州大学环境与安全工程学院；中国科学院南京土壤研究所

实验设计

结果

1 土壤中总砷浓度的地理差异

通过对中国主要水稻种植区的429个水稻土样本进行采样，观察到采样点土壤中总砷含量存在显著差异（p<0.05），范围从9.76±1.43 mg kg⁻¹到19.74±3.17 mg kg⁻¹（图1）。位于亚热带的ZX、CT和HY的土壤砷含量相对较低，平均为9.76～14.41 mg kg⁻¹；中温带、暖温带和亚热带的HL、YY、SY、FQ和JO的砷含量平均为15.66～17.46 mg kg⁻¹；中温带、亚热带和热带地区的QZ、CC、HK、LA和QX的砷含量较高，平均浓度为18.77～19.74 mg kg⁻¹。根据中国土壤环境质量国家标准（GB15618-2018），研究中所有土壤样品的砷含量均在风险筛选值的限度内，代表对农产品安全的低风险。也测定了其他土壤地球化学属性，包括pH、TN、TDN、NH₄⁺-N、NO₃^--N、DON、TP、AP、TK、AK、OM、DOC和CEC（表S2）。通过对土壤地球化学属性进行DCA分析，本研究发现稻田土壤样品在地理上是分组的，表明13个地区的地球化学特征存在显著差异（图S2）。

图1. 中国主要13个水稻种植区39个稻田的土壤砷浓度。

2 稻田土壤中砷解毒基因的多样性和丰度

在429份稻田土壤样品中检测到参与砷解毒的3个基因家族：aoxB、arsM和arxA。每两个土壤样品之间重叠基因的百分比从67.41%到98.39%不等，表明整个稻田土壤的基因组成具有高度相似性（图2a）。根据每个站点中独特基因的百分比，观察到沿着土壤砷梯度的独特基因比例在增加。总体而言，砷解毒基因的丰富度、Shannon-Wiener和Simpson指数在不同地点之间显示相当大的差异（图2b和图S3）。Spearman相关分析发现，稻田土壤砷解毒基因多样性与土壤砷含量呈显著负相关（表1）。水稻土中砷解毒基因的总体丰度在41万~51万之间，其中72%为与As(III)氧化相关的aoxB基因，17%为arsM砷甲基化基因，其余11%为arxA基因与As(III)厌氧氧化有关（图2c）。在不同地区的土壤中发现属于aoxB和arsM家族的基因丰度存在明显差异。然而，关于arxA基因，样本之间没有明显差异。Spearman相关分析表明，arsM的丰度与砷浓度呈负相关。

图2. 水稻土壤中砷解毒基因的多样性和丰度。(a) 每两个土壤样品之间重叠基因比率的热图。(b) 水稻土中砷解毒基因的丰度、Shannon-Wiener指数和Simpson指数。(c) 土壤中参与砷解毒的三个基因aoxB、arsM和arxA的丰度。

表1. 土壤中砷解毒基因与环境因子的Spearman相关系数。

3 砷解毒基因微生物群落组成

土壤细菌、古菌和真核生物携带的砷解毒基因的信号强度如图3a和3b所示。总体而言，细菌携带的砷解毒基因的信号强度在不同地点之间存在明显的差异，并沿着土壤砷梯度下降。所有细菌均隶属于17个门，其中Proteobacteria是所有样品中最主要的细菌分类群，占细菌携带的总基因丰度的55.79~59.09%，其次是Actinobacteria、Chloroflexi和Firmicutes。通过进行Spearman相关性分析，观察到砷含量与Acidobacteria、Actinobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Nitrospirae、Planctomycete和Spirochaetes呈显著负相关。砷氧化细菌的主要类别为Proteobacteria和Actinobacteria，分别占细菌携带的总基因丰度的40.63~50.36%和26.27~35.43%（图3c）。Delta-proteobacteria对砷氧化Proteobacteria的贡献最大，其次是gamma-proteobacteria和beta-proteobacteria（图S4）。本研究还研究了所有样品中砷甲基化细菌的细菌群落组成（图3d）。结果表明，Proteobacteria占砷甲基化细菌的大部分，其次是Chloroflexi。Gamma-proteobacteria对砷甲基化的贡献最大，其次是alpha-proteobacteria和beta-proteobacteria。

图3. 水稻土壤中砷解毒基因微生物群落组成。(a, b) 细菌、古细菌和真核生物携带的砷解毒基因丰度。在门水平上参与砷氧化(c)和甲基化(d)的基因的细菌群落组成。

4 参与砷解毒的微生物功能结构和基因丰度与环境变量的联系

进行冗余分析（RDA）以辨别参与砷解毒的微生物功能结构与环境变量之间可能的联系（图4）。RDA第一个轴与As、pH和NO₃^--N呈正相关，但与TN、DOC和TK呈负相关。第二个轴与AAT（年平均温度）、AAP（年平均降水量）和NH₄⁺-N呈正相关，但与CEC、TP和OM呈负相关。土壤样品根据它们所在的气候带进行分组，显示出与分层聚类观察到的相似模式（图4a），样品也根据土壤砷梯度分布（图4b）。总之，在大陆尺度上，参与砷解毒的微生物功能结构的变化与pH、AAT、As、AAP和CEC密切相关。SEM用于测试重要环境预测因子与砷解毒基因丰度之间潜在的直接和间接关系（图5）。结果表明，AAT是直接影响砷解毒基因丰度的最明显参数，其次是土壤pH和As含量。AAP通过调节土壤pH和砷含量间接影响基因丰度。根据标准化的总效应，气候因素对基因丰度有积极影响，土壤pH值和砷含量对基因丰度有消极影响。本研究进一步对重要环境预测因子和aoxB、arxA和arsM基因分别进行了SEM分析（图S5）。结果表明，与As(III)厌氧氧化相关的aoxB基因丰度直接受AAT、pH和砷含量的影响。As(III)氧化基因arxA丰度仅受土壤pH直接影响，而砷甲基化基因arsM丰度仅受土壤砷含量直接影响。

图4. 砷解毒微生物群落与环境变量的冗余分析。土壤样品分别按气候带(a)和土壤砷含量(b)进行分组。

图5. 砷解毒基因丰度与重要环境变量因果关系的结构方程模型(a)以及标准化总效应(b)。

讨论

1 微生物砷解毒基因的多样性和丰度沿着土壤砷梯度下降

在本研究中，Geochip被用于探索在大空间尺度范围内低砷稻田土壤中砷解毒的功能多样性和基因潜力。该探针检测到三个参与砷解毒的基因，即aoxB、arxA和arsM。稻田间高重叠基因比例表明土壤砷解毒功能的一致性。先前的研究表明土壤中普遍存在砷生物转化基因。砷解毒基因多样性（包括丰富度、Shannon-Wiener、Simpson指数以及基因丰度）沿着土壤砷梯度下降。这些结果展示了环境对砷解毒基因的选择。在砷污染严重的土壤中，砷解毒基因的α多样性较低，这表明许多微生物物种无法应对长期的砷胁迫。一些微生物类群的相对丰度与土壤砷含量之间的负相关进一步支持了这一假设（图3）。相反，以前研究发现砷污染严重的场地具有更高的多样性和更多的与砷转化相关的功能基因，这可能是由于微生物的抗菌素耐药水平与暴露浓度和时间有关。

2 稻田土壤中砷解毒微生物群落的组成

砷生物转化基因在系统发育上具有多样性，并且在原核生物和真核生物中均被检测到。结果发现，砷解毒基因由细菌、古细菌和真核生物携带。As(III)可以通过氧化和甲基化实现砷的解毒过程。在这项研究中，Actinobacteria、delta-proteobacteria、gamma-proteobacteria和beta-proteobacteria是砷氧化的主要类群。 beta-proteobacteria中含有aoxB的Variovorax是水稻根际典型的砷氧化微生物。在环境微生物多样性调查中发现，alpha-proteobacteria、beta-proteobacteria和 gamma-proteobacteria携带aoxB，证明它们在砷污染的土壤中普遍存在。有毒的As(III)可以通过arsM转化为毒性较小的DMA(V)和挥发性的TMA(III)，从而完成解毒过程。本研究发现含有arsM的alpha-proteobacteria和beta-proteobacteria是As-甲基化微生物中的优势物种，它们之前已被确定为水稻根际甲基化微生物群落。此外，来自Aquificae、Chlorobi和Chloroflexi的细菌对天然砷解毒至关重要。综上，即使砷浓度较低，稻田土壤中仍存在多种砷解毒物种。

3 环境变量对微生物砷解毒功能基因的影响

了解影响微生物砷解毒功能基因的环境因素，对于进一步进行生物修复具有重要意义。根据RDA结果，将稻田土壤样品基于气候带进行了聚类，结果表明气候因素对微生物砷解毒功能基因结构的重要影响。基于SEM分析发现，AAT对解毒功能基因丰度有明显的直接影响。较高的环境温度将导致携带aoxB和arsM基因的砷解毒微生物的生长和代谢增加。AAP对砷解毒功能基因的结构和丰度也有明显影响。RDA结果发现，稻田土壤样品也根据土壤砷含量进行分组，表明砷对微生物砷解毒功能基因的选择压力。土壤pH值也是影响砷解毒基因功能结构的关键因素，是基因丰度变化的主要驱动因素。这可以解释为微生物最佳生长条件的pH值范围很窄。研究还发现，土壤pH值与As(III)氧化微生物群落的组成和arsM基因拷贝数显著相关。其他土壤特性，如土壤养分、有机质和CEC也影响水稻土壤中参与砷解毒的微生物功能结构，因为它们是土壤中微生物的重要生长因子。

4 缺陷

在本研究中，要提及使用GeoChip探索砷解毒基因潜力和相关群落组成的注意事项。首先，从GeoChip导出的信号强度没有常规单位。结果只允许限制在本研究或使用GeoChip的研究中检查的样本之间的比较。因此，它不利于与其他研究进行简单的交叉比较。其次，尽管GeoChip在检测各种环境中的功能基因方面具有有效性和敏感性，但鉴于快速扩展这些数据库中的序列信息，GeoChip上的大多数探针都来自公开可用数据库中的基因/序列，不一定完全代表相关微生物群落的多样性。

结论

本研究沿大空间尺度内稻田中的砷梯度分析了微生物砷解毒功能基因，包括aoxB、arxA和arsM。土壤微生物砷解毒基因的多样性和丰度在各采样点之间有明显的差异。与古细菌和真核生物相比，细菌是稻田土壤中含有砷解毒功能基因的主要群体。参与砷解毒的微生物功能结构受pH、AAT、砷、AAP和CEC的影响。AAT直接对砷解毒基因丰度产生正向影响，而土壤pH值和砷含量对基因丰度产生负向影响。本研究不仅对砷解毒微生物群落的理解具有重要意义，而且还提供了潜在的信息，并有助于设计适当的策略，通过调节影响相关微生物的环境因素来刺激微生物进行场地砷的生物修复。