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科研 | Microbiome：孕烷X受体驱动小鼠肝脏脂质和异生物质代谢的性别二型性变化，以响应肠道微生物群

2021

08/03

微生态

A-

A+

导读

肠道菌群-肠-肝关系正在成为多种肝脏疾病的驱动因素，但微生物的肝脏感受器和效应器尚不明确。因此本研究首先通过比较常规小鼠与无菌小鼠的肝脏转录组数据，发现了肠道微生物缺失对孕烷X受体（PXR，NR1I2）的转录活性有较大影响。其次，使用抗生素去除Pxr^+/+和Pxr^-/-C57BL/6J小鼠的微生物区系，发现大多数微生物敏感基因在雄性动物的肝脏中具有PXR依赖性，但在雌性动物中不具有PXR依赖性。通路富集分析提示了微生物群-PXR的相互作用可以控制脂肪酸和异生物质代谢。本研究证实了抗生素治疗显著降低Pxr^+/+雄性小鼠的肝脏甘油三酯含量，并阻碍了肝脏中的异生物质代谢。这些发现确定了PXR是微生物的肝脏效应因子，其调节宿主在肝脏中的性别二型性脂质和异生物质代谢。揭示了非预期药物-药物或食物-药物相互作用的潜在新机制。

论文ID

原名：The pregnane X receptor drives sexually dimorphic hepatic changes in lipid and xenobiotic metabolism in response to gutmicrobiota in mice

译名：孕烷X受体驱动小鼠肝脏脂质和异生物质代谢的性别二型性变化，以响应肠道微生物群

期刊：Microbiome

IF：14.650

发表时间：2021.04

通讯作者：Sandrine Ellero-Simatos

通讯作者单位：图卢兹大学

实验方法

结果

1.肠道菌群的缺失改变了小鼠肝脏中PXR依赖基因的表达

为了研究肝脏中受肠道微生物信号影响的生物学功能，以及可能是这些信号潜在感受器的转录因子，作者首先查询了之前已发表的微阵列和RNA-seq数据集，并比较了GF与Conv小鼠的肝脏转录组差异（图1A–G）。分别使用GF小鼠中显著上调和下调的基因进行了通路富集分析（图1B和E），结果显示在大多数研究中异生物质代谢受到肠道微生物缺失的显著影响。在同时使用了雄性和雌性GF小鼠的数据集（GSE114400）的情况下，比较雄性GF与Conv，发现与异生物质代谢相关的GO显著富集在下调基因列表中，但当比较雌性GF与Conv时，未出现显著富集（图1E）。寻找这些基因的上游调节因子时，发现了GF小鼠中其生物活性受到显著干扰的几种转录因子，其中PXR（正式名称NR1I2）是一种肝脏异生物质代谢的主要调节因子（图1C和F）。此外，GSE114400研究的结果说明存在性别差异（即性别二型性），因为与Conv雄性小鼠（上调和下调基因）相比，PXR（NR1I2）仅在GF雄性小鼠中被预测为过表达和低表达基因的显著上游调节因子，但在雌性中没有显著差异（图1C和F）。因此，在雄性动物的所有研究中，细胞色素P450（CYP）家族3 mRNA的表达均降低（图1G）。该结果与GF小鼠中PXR活性降低一致，因为PXR是众所周知的CYP3表达调节因子，使用接受PXR药理学激动剂治疗的WT与PXR-/-雄性小鼠也证实了这一点（图1H–J）。这些结果也表明肠道菌群-肝脏相互作用可能存在性别二型性，可能涉及PXR。

图1.肠道菌群的缺失显著改变了肝脏中PXR靶基因的表达。（A）选择了5个公开的基因表达数据集，比较无菌（GF）与常规（Conv.）小鼠的肝脏转录组。（B）对GF相较于Conv小鼠肝脏中过表达的基因进行通路富集分析和（C）转录因子富集分析。（D）维恩图显示GF相较于Conv雄性小鼠中过表达的基因数量。（E）对GF相较于Conv小鼠肝脏中低表达的基因进行通路富集分析和（F）转录因子富集分析。（G）维恩图显示GF相较于Conv雄性小鼠低表达的基因数量。（H-J）通过比较WT与用PCN（PXR的药理学激动剂）处理的Pxr^-/-小鼠的肝脏转录组，确认了PXR激活的转录组特征。（I）PCN处理相较于溶剂处理的WT小鼠肝脏中过表达基因的通路富集分析。（J）WT小鼠PCN处理后倍数变化最显著的肝脏基因。图中与药物和外源性物质合成相关的通路、转录因子和基因已用红色框框选。

2.PXR缺失诱导肠道菌群组成和肝脏转录组的性别二型性差异

为了进一步研究PXR和肠道菌群的关系，作者比较了源于同一母鼠（Pxr^+/-）的C57BL/6J Pxr^+/+和Pxr^-/-同窝仔鼠（断奶后按性别和基因型与母鼠和同窝仔鼠分笼）生长至6月龄时的盲肠内容物菌群差异。结果发现，PXR缺失并未改变细菌的丰富度和均匀度（α-多样性）。β-多样性分析显示，盲肠菌群在第一轴上根据性别分离聚类，在第二轴上仅雄性按照2种基因型分离聚类（图2A）。PLS-DA分析也证实了这一点，在第二个PLS-DA轴上观察到Pxr^+/+和Pxr^-/-雌性分离聚类，而在第三个轴上观察到Pxr^+/+与Pxr^-/-雄性分离聚类。作者使用LEfSe算法（图2B和C）或Mann–Whitney检验表征了分类群比例的变化。在雄性中，主要门不受PXR缺失的影响，但当使用LEfSe算法（图2B）和Mann–Whitney检验后，许多分类群的丰度出现显著差异，而这些分类群在雌性中不受PXR缺失的影响。在门水平上，与Pxr^+/+雌性相比，Pxr^-/-雌性含有更高水平的Deferribacteres和Verrucomicrobia，此外其他OTU也有差异。因此，PXR缺失诱导了肠道菌群组成的性别二型性变化。

PXR缺失也以性别二型性方式影响肝脏转录组（图2D–I），雌性小鼠比雄性小鼠更多（图2D–F）。在Pxr^-/-雄性中，53个基因的mRNA水平显著高于Pxr^+/+雄性（图2D）。这些基因参与亚油酸代谢和异生物质代谢（图2E）。与Pxr^+/+雌性相比，Pxr^-/-雌性中110个基因过表达。这些基因参与与胆汁酸、异生物质代谢（“化学致癌作用”；“外源性物质”，“胆汁分泌”），以及“脂质定位”和“分解代谢”相关的多种代谢途径（图2F）。令人惊讶的是，PXR缺失诱导基因低表达，几乎只在雌性小鼠中出现（图2G）。这些雌性特异性调节基因参与炎症和免疫相关通路（图2H），其中以下GO术语显著富集程度最高：细胞因子生成、白细胞介导的免疫和免疫应答的正调控。这些不同的通路紧密关联（图2I）。因此，这些数据揭示了PXR在维持免疫基因表达中具有强烈的雌性特异性作用。

肝脏是一种性别二型性器官。为了进一步分析PXR缺失对性别二型性基因表达的影响，作者首先定义了肝脏雌性和雄性的偏倚基因。在Pxr^+/+小鼠中发现了784个雄性特异性基因，其中很大一部分（68%）在Pxr^-/-小鼠中保持雄性特异性。相比之下，在3691个被定义为雌性特异性的基因中，只有47%在Pxr^-/-动物中仍然保持雌性特异性。在雄性和雌性Pxr^+/+和Pxr^-/-动物中显著调控的所有基因的分层聚类结果证实，尽管绝大多数性别二型性基因在PXR缺失时仍保持性别二型性（聚类2、3和5），但1419个基因的聚类（聚类1）失去了其雌性偏向性表达。而这些基因大多是参与免疫过程的基因。因此，PXR缺失导致雌性肝脏对一部分参与肝脏免疫的基因部分雄性化。

细菌分类群和肝脏mRNA之间的双向相关性也具有性别特异性（图2J–M）。在雄性中，来自OTU“Cluster 413”（Ruminococcaceae UCG-005）的细菌与Cyp2c55的mRNA水平呈强正相关，Cyp2c55是一个被详细描述的PXR靶基因（图1J和K）。总之，上述数据显示了肠道微生物和肝脏PXR之间的双向关系，并以性别二型性的方式相互影响。

图2.PXR缺失诱导肠道菌群组成和肝脏转录组的性别二型性。（A）基于OTU（β-多样性）的未加权UniFrac多维度（MDS）点图。（B&C）LEfSe分析生成的圆形分支图显示Pxr^+/+（绿色）或Pxr^-/-（红色）雄性（B）或雌性（C）微生物群中显著富集且差异显著的属。（D）维恩图代表Pxr^-/-相较于Pxr^+/+小鼠肝脏中过表达的基因数量。（E）Pxr^-/-相较于Pxr^+/+雄性中过表达的15个基因的通路富集分析。（F） Pxr^-/-相较于Pxr^+/+雌性中过表达的94个基因的通路富集分析。（G）维恩图代表Pxr^-/-相较于Pxr^+/+小鼠肝脏中低表达的基因数量。（H） Pxr^-/-相较于Pxr^+/+雌性中过表达的743个基因的通路富集分析。（I）用（H）中ClusterID颜色进行着色的富集网络图。（J&L）Circos图代表雄性（J）和雌性（L）盲肠细菌OTU（蓝色侧象限）和肝脏mRNA（绿色侧象限）变量之间的相关性。正相关和负相关分别用橙色和黑色线条连接。（K&M）雄性（K）和雌性（M）细菌OTU和肝脏转录本的相关性网络。

3.PXR缺失影响了肝脏对肠道菌群耗竭的转录反应

作者通过抗生素（ATB）治疗耗尽Pxr^+/+和Pxr^-/-小鼠的肠道菌群。抗生素治疗显著增加了盲肠内容物的重量，降低了粪便菌落数目，并完全消除了盲肠内容物中的短链脂肪酸，这足以证明所有动物的肠道微生物均成功耗竭。微生物区系耗竭影响Pxr^+/+雄性的基因数量远高于Pxr^+/+雌性（图3B和C）。通过重新分析比较GF与Conv雄性和雌性小鼠mRNA表达的公开数据，证实了这种性别偏倚的相互作用。GF和Conv雄性之间显著差异表达基因的数量几乎是GF和Conv雌性之间差异基因数目的两倍。

接下来作者使用先前定义的肝脏雌性和雄性偏倚基因列表研究了微生物群耗竭对性别二型性表达的影响。在ATB处理的Pxr^+/+小鼠中，很大比例的雄性特异性基因（70%）仍然具有雄性特异性。相比之下，在ATB处理的小鼠中，只有49%的雌性特异性基因仍然存在雌性偏倚。分层聚类进一步揭示了ATB处理后仅在雄性小鼠（聚类4）或大部分在雄性小鼠（聚类5）中表达增加的两个雌性特异性基因簇，从而削弱了这些基因的性别二型性表达，并解释了在ATB处理小鼠中观察到的雌性特异性基因丢失。令人惊讶的是，与 Pxr ^+/+ 雄性相比， Pxr ^-/- 雄性中因ATB处理影响的基因数量非常少（图3B–D和G）。这些PXR依赖基因主要参与脂质和异生物质代谢。在ATB处理的雄性上调的基因中，“类固醇生物合成”途径显著富集（图3E），而化学致癌作用、视黄醇代谢、类固醇激素生物合成和异生物质代谢是ATB处理雄性下调基因的主要调节的途径（图3H）。相反，在 Pxr ^-/- 雌性中，与 Pxr ^+/+ 雌性相比，ATB处理影响了更多的基因（图3B、C、F和I）。这166个基因包括57个性别偏倚基因，但这并不代表性别偏倚基因的显著富集。而且，通路富集分析未能揭示影响雌性微生物群耗竭的生物学通路（PXR依赖性）（图3F和I）。

以前报道过PXR以性别依赖的方式受昼夜节律调节，但本研究证实PXR及其2个主要靶基因（Cyp3a11和Cyp2c55）的表达在雄性和雌性处死时没有显著差异。因此，PXR表达或活性的差异不太可能导致观察到的性别二型性微生物和PXR依赖性反应。

图3.与微生物群耗竭相关的肝脏基因表达的性别二型性变化依赖于PXR。（A）实验设计。ATB：抗生素。（B）ATB处理小鼠与对照小鼠中被调控的基因数量差异。（C）维恩图代表ATB中被调控的基因数量和对照小鼠的差异。（D）维恩图代表ATB处理相较于对照雄性中过表达的基因数量。（E）在ATB处理的Pxr^+/+雄性中过表达的303个肝脏基因的通路富集分析。（F）维恩图代表ATB处理相较于对照雌性中过表达的基因数量。（G）维恩图代表ATB处理相较于对照雄性低表达的基因数量。（H）ATB处理的Pxr^+/+雄性中低表达的111个肝脏基因的通路富集分析。（I）维恩图代表ATB处理相较于对照雌性动物中低表达的基因数量。

4.PXR参与肠道微生物依赖的肝脏脂肪酸代谢

本研究数据还表明肠道菌群的PXR传感可能参与脂肪酸代谢。作者发现ATB治疗或PXR缺失对循环脂质水平无显著影响。然而，与各自的对照雄性相比，ATB处理的Pxr^+/+（而非Pxr^-/-）雄性动物中参与脂肪酸合成（Fasn）和延长（Elovl2、3和5）的几种肝脏基因的mRNA水平降低（图4A）。ATB处理的Pxr^+/+雄性与Pxr^+/+对照雄性相比，三种肝脏中最丰富的脂肪酸（C16:0、C16:1n-7和C18:1n-9）的相对丰度显著降低（图4B），而且肝脏甘油三酯的含量也显著降低（图4C）。

在雌性动物中，脂肪酸相关基因的表达和肝脏甘油三酯水平均无PXR依赖性差异。总体而言，肠道菌群耗竭以PXR依赖性方式诱导雄性肝脏脂质的显著重塑。

图4.在雄性小鼠中，肝脏脂质和异生物质代谢的肠道微生物依赖性变化由PXR控制。（A）通过qPCR评估肝脏基因表达。（B）肝脏脂肪酸的相对丰度。（C）肝脏中性脂质定量。（D）通过qPCR评估肝脏基因表达。（E）14 C-睾酮与肝微粒体孵育得到的[14C]-睾酮羟基化代谢物（n=5只/组）。（F）在肝胞质组分中评估谷胱甘肽S-转移酶比活度（n=5只/组）。

5.肠道菌群-PXR相互作用控制宿主的肝脏异生物质代谢

微阵列数据的另一个有趣的发现是与异生物质代谢相关基因的显著富集。ATB处理的Pxr^+/+雄性表现出参与I期异生物质代谢的基因在肝脏中表达较低（图4D）。为检测这些CYP基因下调的影响，使用肝微粒体亚细胞组分测定雄性中[14C]睾酮的区域选择性氧化代谢。ATB处理组保留时间为10.5和14.7 min的睾酮代谢物峰值显著低于对照组Pxr^+/+雄性（图4E）。10.5 min峰鉴别为6β-羟基睾酮，其为在小鼠中主要由CYP3A11产生的6β-羟化酶活性产物。最后，观察到ATB处理雄性小鼠后谷胱甘肽转移酶活性的PXR依赖性降低（图4F）。

讨论

在发育早期，肝脏直接从前肠出芽。一旦分化，这两个器官是相互依赖的，多重证据表明，肠-肝轴的紊乱参与了许多与肥胖相关的代谢性疾病，包括NAFLD。在肝脏中，来自核受体超家族的转录因子可以感知通过门静脉输送的营养物质和外源性物质的波动水平，并通过调节基因表达及时适应肝脏代谢。因此，其中一些核受体可能是微生物信号的关键中间体。本研究以性别二型性方式将核受体PXR和肠道菌群联系起来，并强调了之前忽略的肠道-肝脏串扰的多个方面，这些方面可能在基于性别的医学中产生重大影响。

首先，转录组学分析确实揭示了PXR缺失对性别二型性肝脏的强烈影响。PXR在哺乳动物的肝脏和肠道中高度表达，并首先被描述为一种外源性传感器，可调节异生物质代谢酶和转运蛋白的表达，从而促进外源性物质和内源性有毒化学物质（如胆汁酸）的消除。PXR激活已被证明以性别二型性方式影响异生物质和糖脂代谢。本研究发现PXR对参与免疫的肝脏基因具有广泛的、雌性特异性的抑制作用。有趣的是，在PPARα缺失的小鼠中，观察到了相似的效应，并归因于雌性肝脏中该受体的类泛素化。PXR可被多种转录后修饰所修饰，包括类泛素化，但迄今为止尚不清楚这些修饰在体内是否具有性别特异性。而且，分析也表明PXR缺失改变了性别二型性基因的表达，导致雌性小鼠肝脏基因模式的部分雄性化。这证实了之前的研究结果。肝脏疾病表现出明显的性别差异，雄性小鼠和人类对NAFLD、NASH、纤维化、肝细胞癌和化学诱导的肝癌发生更敏感。这些性别偏倚表型差异的基础是数百个性别二型性肝脏基因。有大量文献阐述了雌激素在肝脏中的保护作用，认为女性的肝脏炎症反应较弱，这至少部分解释了女性不易发生肝病进展的原因。PXR是炎症的关键因素。然而，PXR缺失的雌性小鼠是否更容易发生免疫衍生的肝病仍有待确定。本研究目前的数据表明，与PPARα相似，PXR在女性肝脏中的抑制作用可能被忽视。

本研究转录组分析的另一个有趣发现是肠道菌群耗竭的高度性别二型性。ATB处理后，仅5-10%的肝脏基因在雄性和雌性中共同调节。通过重新分析GF小鼠的先前数据得到进一步证实。此外，已经证明微生物群耗竭导致肝脏性别二型性基因表达改变，主要是由于仅在雄性小鼠中ATB治疗后表达增加的基因簇。尽管在研究中使用的2周ATB治疗过程中，受这种雌性化表达模式影响的基因数量仍然有限，这证实了之前发表的结果，即与ConvR雄性小鼠相比，接受普通饲料或高脂饲料的GF雄性小鼠显示出广泛的雌性肝脏基因表达。因此肠道菌群对于维持性别偏倚的肝脏基因表达至关重要，这些发现强调了PXR在菌群和性别偏倚信号通路之间相互作用中的潜在作用。大多数关于肠道微生物-肝脏串扰中基因表达的研究使用了雄性动物，并观察到异生物质代谢、类固醇生物合成和脂质代谢是GF小鼠肝脏中下调最多的途径。因此，目前的发现提出了一个问题：“目前关于肠道微生物对宿主肝脏和代谢影响的知识在雌性中有多少成立？”有趣的是，最近在人类中观察到肠道微生物和脂肪分布之间存在性别特异性关联。

本研究发现，在缺乏PXR的情况下，与Pxr^+/+雌性相比，雌性肝脏对肠道菌群缺失的反应增强。其原因尚不清楚，因为分析中未出现这些新的微生物敏感基因的明显生物学途径或上游调节因子。此外，这些基因没有富集性别二型性基因。然而，PXR的激活可通过调节CYP和磺基转移酶（SULTs，其对雄激素和雌激素代谢失活很重要）干扰性激素稳态。因此，可以推测PXR缺失也影响类固醇激素平衡和性成熟，从而影响基因表达的性二态性。这种复杂的肠道菌群-PXR-性激素稳态仍有待研究。相反，在没有PXR的情况下，雄性小鼠对微生物群耗竭的肝脏转录反应几乎完全消失。相比之下，由肠道菌群缺失诱导的结肠基因表达的变化中，仅有不到5%需要MyD88信号（Toll样受体信号的主要适配器）。因此，本研究结果证明PXR至少在数量上是雄性小鼠肝脏肠道微生物信号的主要效应因子。由于PXR也在肠道中高表达，并且已知在微生物配体结合后增加肠道通透性，因此比较肝脏特异性缺失PXR后肝脏中微生物调节的PXR控制基因的比例将更加有意义。

对微生物驱动的PXR依赖性肝功能的通路富集分析突出了脂质代谢通路。肠道菌群通过控制脂肪酸去饱和和延长促进小鼠肝脏脂质蓄积。源自膳食纤维微生物降解的醋酸盐是肝脏合成C16和C18脂肪酸的前体。在本研究实验中，短期ATB处理足以降低雄性动物肝脏脂肪酸延长酶的表达、肝脏甘油三酯含量和C16脂肪酸的相对丰度。有趣的是，研究强调了PXR在这些过程中的潜在作用。

最后，在GF和ATB处理的雄性动物中，异生物质代谢受到肠道菌群的强烈影响，这与之前的研究一致，其中Cyp3a11是GF雄性小鼠中下调最多的基因和蛋白之一。在这里，已经证明PXR是这些变化的关键介质。近年来，已证明肠道微生物代谢可影响口服给药药物和食物污染物的疗效和毒性。然而，本研究揭示了食物-药物或药物-药物相互作用的另一种潜在机制。在人体中，PXR的典型靶基因CYP3A4代谢绝大多数临床给药的药物，诱导或抑制其活性被认为是药物相互作用的主要风险因素。本研究结果表明，肠道微生物通过PXR，可能部分控制个体对药物和异生物质物质代谢。至于治疗指数较窄的药物或潜在危及生命的毒性，或发现扰乱肠道菌群组成及其代谢的食物污染物对宿主产生的毒理学后果，仍有待确定这是否具有临床相关性。

最近关于将机体微生物群落与代谢联系起来的机制的研究指出，微生物来源的代谢物是关键因素。目前研究最多的参与微生物群-宿主串扰的3类代谢物是：（i）微生物发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸，（ii）肠道微生物产生的色氨酸代谢物和（iii）肝脏产生并由微生物群转化的胆汁酸；（i）对短链脂肪酸和PXR之间的相互作用知之甚少。然而，丁酸盐在CaCo-2肠上皮细胞分化后可诱导PXR表达。（ii）肠道微生物可将色氨酸转化为吲哚衍生物，如吲哚-3-丙酸（IPA），其在体外可激活小鼠和人的PXR，并在体内以PXR依赖性方式降低肠道通透性。在远端器官中，IPA已被证明在体内可调节内皮依赖性血管舒张。吲哚，特别是IPA，可能是调节PXR的微生物配体。然而，尚不清楚它们在足够浓度下是否可以到达肝脏激活受体。（iii）胆汁酸直接或通过调节法尼醇X受体间接与PXR相互作用[79]。相反，PXR诱导参与胆汁酸合成、结合和转运的基因，从而促进它们的消除。因此，胆汁酸可能在微生物群-PXR串扰中发挥作用。对ATB处理和对照小鼠门静脉中循环的小分子进行深入的代谢组学分析，然后使用报告细胞系体外筛选差异代谢物，可以鉴定激活肝脏PXR的微生物信号。

结论

总之，本研究首先确定PXR是雌性肝脏免疫功能的潜在抑制因子。而且，证实PXR是肠道微生物来源的信号的感受器，并证明微生物-PXR相互作用以性别二型性方式控制宿主的肝脏脂质和异生物质代谢，可能与肝脏疾病有关。本研究结果为药代动力学和对环境毒性敏感性的性别二型性和个体间差异开辟了一个新的宏基因组视角，并强调了微生物靶向与宿主靶向药物相互作用的潜在新机制。