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导读
氨和热胁迫会对水生动物产生有害影响，然而虾在氨和热共同胁迫下的生理反应机制尚不清楚。在该实验中，研究者探究了凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）在单独和联合氨和热胁迫下的肠道微生物菌群以及转录组和代谢组变化。研究结果发现两类胁迫下对虾肠道菌群发生明显变化，厚壁菌门相对丰度增加，而拟杆菌门和浮霉菌门丰度减少。几种有益菌（Demequina、Weissella和Bacteroides）在两类胁迫下的丰度上升，而Formosa、Kriegella、Ruegeria、Rhodopirellula和Lutimonas丰度下降；单一氨或热胁迫下弧菌属表达丰度上升，但是联合胁迫下弧菌属表达丰度下降。此外，研究者还通过对对虾肠道转录组测序表征了几种与免疫相关的差异表达基因（DEGs），这些DEGs主要与围食膜和抗菌过程有关。通过对对虾血淋巴代谢组学分析，研究者还发现氨和热胁迫扰乱了对虾的代谢过程，尤其是氨基酸代谢。同时该工作还确定了10种与氨和热胁迫下相关的代谢标志物，包括L-乳酸、古洛糖酸、二十二碳六烯酸等。该研究使用微生物组、转录组和代谢组的综合分析研究了氨和热胁迫对对虾的毒性作用，并分析了肠道微生物的变化与宿主免疫因子和代谢物的相关性，能够在分子和基因表达水平上揭示氨和热联合胁迫对凡纳滨对虾的生理毒性影响。
原名：Toxic effects of ammonia and thermal stress on the intestinal microbiota and transcriptomic and metabolomic responses of Litopenaeus vannamei
译名：氨和热胁迫对凡纳滨对虾肠道菌群及转录组和代谢组学的毒性影响
期刊：Science of the Total Environment
IF：7.963
发表时间：2020.08
第一作者：段亚飞
通讯作者及单位：张家松，中国水产科学研究院南海水产研究所
凡纳滨对虾肠道微生物测序总共获得772,926条clean reads。与对照组（CG）相比，氨胁迫（AG）、热胁迫（TG）以及联合胁迫（ATG）3个实验组的Chao1指数增加，TG和AG的Simpson指数也增加，但Shannon指数变化不显著（表1）；三个实验组独有的OTU数量增加，但ATG的OTU低于TG和AG（图1A）。此外，基于加权和未加权UniFrac距离的PCoA分析表明CG和三个实验组中的肠道细菌分布存在显著差异（图1B、C）。表1. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾肠道微生物的α多样性
三个实验组中优势细菌的分类群相似，但表达丰度存在差异。在门水平上，与CG相比，变形杆菌的相对丰度在TG中降低，而在ATG中则增加；三个胁迫组中拟杆菌的相对丰度降低，但厚壁菌门的丰度增加（图1D）。在纲水平上，三个应激组中Alphaproteobacteria、Flavobacteriia、Betaproteobacteria和Planctomycetacia的相对丰度下降，但Gammaproteobacteria、Bacteroidia和Bacilli的丰度增加（图1E）。在属水平上Bacteroides、Demequina和Weissella在三个胁迫组中增加，但Formosa、Kriegella、Lutimonas、Muricauda、Pandoraea、Rhodopirellula和Ruegeria减少。此外，弧菌（Vibrio）在TG和AG中增加，但在ATG中减少（图1F）。
图1. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾肠道微生物多样性和群落组成。（A）不同处理组之间唯一和共有的OTUs。基于加权UniFrac（B）和未加权UniFrac（C）分析下的PCoA图。不同处理下肠道优势菌门（D）、纲（E）、属（F）的平均相对丰度。研究者还利用LEfSe来分析四组样本中的细菌差异丰度。结果表明：Rickettsiales主要归属于CG，而Lactobacillaceae归属于AG（图2A）。LDA分析进一步证实了微生物群落在四组样本中的差异：Rickettsiales在CG中显著富集，Butyricicoccus在TG中显著富集，Lactobacillus和Alloprevotella在AG中显著富集，而Tenacibaculum和Propionigenium在ATG中显著富集（图2B）。此外，基于门丰度的Cytoscape网络分析发现，最主要的OTU：OTU2和OTU3，都属于变形杆菌，而拟杆菌与厚壁菌门的相关性最高（图2C）。同时研究者利用Cytoscape网络分支图进一步分析四组微生物群的差异，发现只有Lactobacillus在AG中显著优势（图2D）。KEGG信号注释表明：与CG相比，三个胁迫组中“致病性大肠杆菌感染”和“肌动蛋白细胞骨架的调节”的表达丰度显著上调，而“次生代谢物的生物合成和生物降解”、“百日咳”和“膀胱癌”的表达丰度显著下调（图2E）。
图2. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾肠道微生物群间变异、网络和代谢分析。（A）LEfSe分枝图。（B）基于LEfSe-PICRUSt的LDA分析。（C）基于门水平的关联网络分析。节点代表OTUs的门分类，节点大小代表各分类单元的相对丰度。相同颜色的节点代表同一门。两个OTU之间的线表示相关性。（D）差异网络分析。黑色表示差异不显著，其余颜色表示对应组差异显著。给出了丰度在1%以上的类群名称。（E）基于KEGG通路分析的微生物代谢预测。*表示显著差异。凡纳滨对虾在不同胁迫下的肠道转录组进行测序共得到515,505,124条clean reads。与CG相比，三个胁迫组的肠道中共鉴定出334条差异表达基因（DEGs）。此外，通过Venn图分析发现，有13条基因在三个实验组中都存在差异表达（表S2）。在和对照组进行DEGs分析发现：TG组包含74条上调基因和78条下调基因，AG组包含74条上调基因和55条下调基因，ATG组包含66条上调基因和79条下调基因（图3）。
图3. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾肠道DEGs的散点图和火山图。（A）TG vs CG。（B）AG vs CG。（C）ATG vs CG。随后，研究者利用GO注释和KEGG通路对DEGs进行功能富集分析。其中注释到生物学过程的GO条目包括：“单组织过程”、“代谢过程”和“细胞过程”；注释到细胞组分的GO条目包括：“细胞”、“细胞部分”和“细胞器”；注释到分子功能的GO条目包括：“催化活性”和“结合”（图4A-C）。KEGG通路分析发现：与CG相比，“ABC转运蛋白”、“咖啡因代谢”和“维生素消化吸收”在TG中显著富集（图4D）；“DNA复制”、“组氨酸代谢”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”以及“抗坏血酸和醛糖酸盐代谢”在AG中显著富集（图4E）；“朊病毒病”、“亚油酸代谢”和“ABC转运蛋白”则在ATG中显著富集（图4F）。
图4. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾肠道DEGs显著富集的GO条目和KEGG通路。（A）TG vs CG的GO条目。（B）AG vs CG的GO条目。（C）ATG vs CG的GO条目。（D）TG vs CG的KEGG通路。（E）AG vs CG的KEGG通路。（F）ATG vs CG的KEGG通路。为了更好地理解由氨和热应激引起的对虾肠道的免疫反应，本研究还基于NR数据库注释鉴定了几种与免疫相关DEGs。在得到的13条免疫相关的DEGs中，4条DEGs如FKBP、MBP、PT-1和Chit-4p在TG vs CG、AG vs CG和ATG vs CG的三个比较中都存在；4条DEGs包括酚氧化酶激活酶2α（PPAE-2α），α2巨球蛋白（α2M），血细胞稳态相关蛋白（HHAP）和氨基肽酶N（APN）在TG vs CG和ATG vs T中存在；5条DEGs包括血淋巴可凝结蛋白（HCP）、peritrophin-55 （PT-55）、几丁质酶（Chit）、粘蛋白-3A（Muc-3A）和丝氨酸蛋白酶抑制剂8（SPI8）则存在于AG vs CG和ATG vs CG比较组中（表2）。表2. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾肠道免疫相关DEGs转录谱
为了探究氨和热胁迫下凡纳滨对虾的代谢谱变化，研究者利用LC-MS技术对对虾的血淋巴进行代谢组分析。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）评分图和排列测试结果表明四组样本在正负电离模式下都存在显著差异（图5），说明氨和热胁迫会导致对虾血淋巴的代谢表型改变。
图5. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾血淋巴代谢产物的LC-MS谱。（A）正离子PLS-DA评分图。（B）正离子排列测试。（C）负离子PLS-DA评分图。（D）负离子排列测试。
随后，该研究进一步筛选了在单一胁迫和联合胁迫下对虾血淋巴中的差异表达代谢物（DMs）。与CG相比，TG包含42条上调和20条下调的DMs，AG包含44条上调和31条下调的DMs，而ATG包含34条上调和35条下调的DMs（图6B，6D，6F）。为了说明得到的DMs可能参与的代谢途径，研究者进一步将DMs进行KEGG注释分析。与CG相比，TG中显著富集的途径包括“苯丙氨酸代谢”等通路（图6A）；AG中显著富集的途径包括“组氨酸代谢”等通路（图6C）；ATG中显著富集的途径包括“D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢”等通路（图6E）。
图6. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾血淋巴DMs显著富集的KEGG通路和层次聚类图。TG vs CG（A和B）。AG vs CG（C和D）。ATG vs CG（E和F）。该研究还特异性地筛选了与机体健康相关的DMs，包括γ-氨基丁酸（GABA）、L-乳酸、古洛糖酸和二十二碳六烯酸。同时，研究者还发现这些DMs在三个实验组中均显著上调。另外，TG中反式肉桂酸酯含量增加，而AG和ATG中反式肉桂酸酯含量降低；AG和ATG中β-谷甾醇增加，但麦角钙化醇、L-组氨酸和磷酸胆碱减少；TG和ATG中花生四烯酸和甘油酸增加；TG和AG中对苯二酚、L-异亮氨酸和DL-多巴增加，但吡哆醇减少；而硬脂酸仅在TG中减少（表3）。表3. 氨和热胁迫下凡纳滨对虾血淋巴中的差异表达代谢物
研究者随后采用Cytoscape中的coNet插件，通过Pearson相关分析分别探讨了肠道细菌与宿主肠道免疫相关DEGs和血淋巴DMs之间的相关性。在肠道细菌与宿主免疫DEGs的相关性中：Maribacter、Kriegella、Formosa、Muricauda和Lutimonas与PT-1、PPAE-2α和MBP基因的变化呈正相关；Mycobacterium和Demequina与Muc-3A、FKBP和SPI8基因的变化呈正相关；Ruegeria与PT-1和MBP基因的变化呈正相关；Bacteroides与HHAP基因的变化呈正相关；Pseudoxanthomonas与APN、HCP和Chit-4p基因的变化呈正相关（图7A）。在肠道细菌和宿主代谢物的相关性分析中：Demequina与甘油酸和L-乳酸的变化呈正相关；拟杆菌与花生四烯酸的变化呈正相关；Lutimonas、Muricauda、Rhodopirellula和Ruegeria与甲基丙二酸的变化呈正相关，但与β-谷甾醇的变化呈负相关（图7B）。
图7. 属水平的肠道菌群与DEGs和DMs之间的相关性。（A）肠道细菌与免疫相关DEGs的相关性。（B）肠道细菌与DMs的相关性。相关系数用不同颜色表示（红色表示正相关；蓝色表示负相关）。*表示显著性（*P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001）。
本项研究发现氨和热胁迫改变了凡纳滨对虾的肠道微生物组成，其中变形杆菌、拟杆菌和厚壁菌成为凡纳滨对虾的优势肠道细菌。变形杆菌在虾的肠道微生物组中经常占主导地位，并参与碳和氮降解。因此，变形杆菌丰度的变化表明氨和热胁迫会对变形杆菌稳态产生一定程度的影响。此外，拟杆菌和厚壁菌都能够参与发酵过程并为宿主提供营养。厚壁菌门丰度增加和拟杆菌丰度减少表明氨和热胁迫可能影响凡纳滨对虾肠道细菌代谢营养物质的能力。
此外，研究者主要对宿主健康相关的肠道菌进行分析。弧菌是一种主要病原体，弧菌丰度的增加表明氨和热胁迫在虾肠中诱导产生了一定比例的病原菌，从而可能增加疾病的风险。鲁杰氏菌属（Ruegeria）可以降解磷酸三酯，而红小梨形菌属（Rhodopirellula）可以分解大量有机物质，因此能够促进全球碳和氮循环。Lutimonas是一种严格需氧的异养硝化细菌，可降解氨。Ruegeria、Rhodopirellula和Lutimonas丰度的减少表明氨和热胁迫可能会影响对虾肠道内有机物、氨和磷脂的代谢。放线菌Demequina可以产生α-淀粉酶，将淀粉降解为葡萄糖和糊精。乳酸菌Weissella可以合成有益物质，例如菌苗、低聚糖和胞外多糖。拟杆菌Bacteroides可以产生与碳水化合物代谢相关的酶、维生素、聚糖和辅酶，以促进食物消化。因此，该研究还认为对虾肠道中Demequina、Weissella和Bacteroides的表达丰度上调，可能会为宿主提供更多营养和有益物质，以适应氨和热胁迫。转录组分析也表明单一和联合氨和热胁迫会对肠道基因产生影响。KEGG通路分析发现：热胁迫主要影响ABC转运蛋白、咖啡因代谢和维生素的消化吸收；氨胁迫主要影响氨基酸（组氨酸，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸）、抗坏血酸盐和藻酸盐的代谢；热和氨联合胁迫主要影响ABC转运蛋白和亚油酸代谢。维生素是维持正常生理功能的微量物质，氨基酸和脂质是生物体的重要成分和能源。ABC转运蛋白是一种多功能跨膜蛋白，在调节细胞渗透压、解毒代谢和免疫响应中发挥重要作用。因此，转录组测序数据表明，热和氨胁迫会导致虾肠道代谢功能障碍，这可能会影响其在宿主免疫反应中的重要作用。肠道免疫是生物体抵御外来入侵者的重要防线。围食膜（PM）是虾肠上皮所特有的一种半透性膜状结构，可防止异物侵入。围食膜因子（peritrophin，PT）是PM的重要组成部分。Muc-3A是肠道粘液的一种糖蛋白成分，可以抵抗病原体的附着和入侵。本研究中PT-1和PT-55的表达下调，而Muc-3A的表达上调，表明氨和热胁迫可能影响PM的完整性，并在生物体内诱导粘液以维持肠道稳态。血淋巴代谢组学分析证明了氨和热胁迫影响了凡纳滨对虾的代谢功能，特别是氨基酸代谢。在显著富集的KEGG通路中，热胁迫主要影响“苯丙氨酸代谢”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”，氨胁迫主要影响“组氨酸代谢”和“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成”，而联合胁迫主要影响“D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢”。因此，研究人员推测生物体对不同的压力采用不同的代谢适应策略。此外，花生四烯酸和二十二碳六烯酸都是长链多不饱和脂肪酸，对水生动物的免疫力具有有益作用。因此，脂肪酸水平的增加也可能是虾应对压力的一种适应策略。肠道微生物变化会引起宿主免疫和代谢紊乱。在这项研究中，Formosa、Kriegella、Ruegeria、Muricauda和Lutimonas的水平降低与虾肠免疫相关基因（PT-1，PPAE-2α和MBP）以及甲基丙二酸的变化呈正相关，表明这些细菌可能影响南美白对虾的免疫和柠檬酸循环过程。Formosa参与海藻多糖的解聚，Kriegella能够从半乳糖、乳糖和蜜二糖中产生酸。因此，Formosa和Kriegella水平的降低表明氨和热应激可能影响肠道细菌的碳水化合物代谢。拟杆菌作为有益物质产生菌，其水平升高与HHAP基因和花生四烯酸的变化呈正相关，表明拟杆菌参与了南美白对虾对氨和热应激的免疫反应和花生四烯酸代谢。因此，在这项研究中选择的几种高度相关的细菌、基因和代谢物可以用作虾对氨和热应激的生物标志物。本研究利用微生物组、转录组和代谢组的综合分析研究了氨和热胁迫对凡纳滨对虾的毒性作用。氨和热胁迫导致肠道细菌群落发生变化，其中厚壁菌门增加，拟杆菌门减少。一些有益物质产生菌的丰度下降，例如Formosa、Kriegella、Ruegeria、Rhodopirellula和Lutimonas；弧菌属病原菌在单一氨和热胁迫下丰度上升，但是在联合胁迫下降低。同时，本文还鉴定出了与ABC转运蛋白、氨基酸、亚油酸、抗坏血酸和醛糖酸代谢相关的DEGs，并发现部分免疫相关基因与围食膜和抗菌过程有关。通过对10个代谢标志物的分析，本研究还发现氨和热胁迫会对对虾的血淋巴代谢功能产生不利障碍。该研究不仅单独研究了氨和热胁迫下的微生物、基因和代谢物的变化，并筛选出了具有显著相关性的菌群及差异基因和差异代谢物，但它们之间的相互作用机制仍有待探索。
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