大连理工 | Biotechnol Biofuels：首次从发生条件、代谢、形态和转录组等方面系统地研究了丁酸梭菌的振荡行为

2021-07-27 微生态

本文对一株新发现的以甘油为底物连续发酵生产1,3-PDO的丁酸梭菌的振荡发生条件、宏观特征和分子特征进行了研究。

编译：微科盟寒江雪，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

振荡是微生物在连续发酵过程中的一种特殊细胞行为，对生物燃料和生物化工工业生产的稳定性构成威胁。之前在连续发酵甘油生产1,3-丙二醇(1，3-PDO)的过程中，发现丁酸梭菌密集菌群的自发振荡行为导致了丁酸梭菌的振荡。在甘油浓度为88g/L，稀释倍数为0.048 h⁻¹的条件下，连续运行146小时后，丁酸梭菌有振荡行为，平均振荡周期为51小时。在振荡过程中，微生物的甘油代谢表现出明显的周期性变化，其中乳酸、甲酸和氢气的产量明显后置于生物质、1,3-PDO和丁酸等产物的产量。胞外氧化还原电位和胞内NAD⁺/NADH比值的分析表明微生物细胞在振荡过程中经历了明显的氧化还原变化，随着生长速率的降低，微生物细胞从氧化状态转变为还原状态。丁酸梭菌S3在菌体生长过程中表现出周期性的形态变化，在生物量产生的低谷处有聚集体、拉长形状、孢子或细胞碎片。转录组分析表明，当微生物细胞受到胁迫时，丙酮酸代谢、乙酰辅酶A向乙醛的转化以及胁迫反应等多个基因的表达水平上调。本研究首次从发生条件、代谢、形态和转录组等方面系统地研究了丁酸梭菌的振荡行为。根据实验结果提出了两个假说来解释这种振荡行为：丙酮酸代谢紊乱和乙醛过度积累。

论文ID

原名：Metabolism, morphology and transcriptome analysis of oscillatory behavior of Clostridium butyricum during long-term continuous fermentation for 1,3-propanediol production

译名：丁酸梭菌长期连续发酵生产1,3-丙二醇过程中的代谢、形态和转录组分析

期刊：Biotechnology for Biofuels

IF：6.040

发表时间：2020.11

通讯作者：修志龙

通讯作者单位：大连理工大学生物工程学院

实验设计

结果

1 振荡发生的条件

在以往的研究中发现丁酸梭菌密集型菌群C2-2M在甘油残留量较低的条件下，连续发酵过程中容易发生振荡行为，而在甘油充足情况下，连续发酵过程中没有振荡行为。从菌群C2-2M分离的丁酸梭菌S3在低甘油残留量条件下可发生振荡行为。在不同稀释率和甘油补料浓度下进行连续发酵，在低甘油残留浓度下确定丁酸梭菌S3产生振荡行为的培养条件。

在甘油补料浓度为88 g/L，稀释率为0.048 h⁻¹的连续发酵中，146 h后观察到振荡，并持续超过450 h（图1），这与C2-2M的振荡行为一致。而在较高的稀释速率0.144和0.096 h⁻¹下，相同的甘油浓度在200h后虽然消耗的大量的甘油，但是没有检测到振荡（图2a和b）。当稀释率从0.144-0.096 h⁻¹逐步降低到0.048 h⁻¹时，在0.048 h⁻¹的最低稀释率下连续运行超过100 h才能观察到振荡行为，并伴随着从乳酸向甲酸盐的代谢转变（图2a）。结果表明丁酸梭菌振荡的发生与培养条件密切相关。

当甘油浓度降至44 g/L时，丁酸梭菌只有在0.048 h⁻¹和0.096 h⁻¹的低稀释速率下才会出现振荡现象（图2c和d）。然而在这两种情况下的振荡行为并不持续，而是趋于减弱并最终消失。结果表明除了甘油限制条件的要求外，在一定的甘油投加量下培养是丁酸梭菌S3维持振荡的必要条件。经过长期培养，丁酸梭菌的代谢发生了显著的转变，甲酸和乳酸的积累减少。本研究以甘油浓度为88 g/L、稀释率为0.048 h⁻¹的连续发酵为例，对丁酸梭菌S3的代谢、形态和转录组等振荡行为进行了研究。

图1.在甘油补料浓度为88g/L，稀释率为0.048h⁻¹的条件下，丁酸梭菌S3连续发酵。

图2.连续发酵条件下丁酸梭菌S3的甘油消耗和1，3-PDO的产生。

2 丁酸梭菌S3在典型振荡阶段的代谢特征

如图1所示，在对数末期(5h)补料后，培养23 h后迅速消耗全部甘油，在29-119 h期间，丁酸梭菌S3表现出相对稳定的代谢。甘油全部消耗时，1,3-PDO产量为40.66±1.09g/L。主要副产物为丁酸，平均浓度为10.02±0.81g/L。其他副产物包括乙酸、乳酸和甲酸盐，浓度较低。在119-146h期间，虽然残余甘油浓度仍保持较低水平，但丁酸梭菌S3表现出明显的代谢变化。最明显的变化是乳酸产量的变化，浓度从4.26增加到9.07g/L，增加了一倍多。甲酸盐产量从2.60 g/L增加到3.34 g/L，生物量、1，3-PDO、丁酸和乙酸的产量均有不同程度的下降。

146 h后开始振荡并维持在450 h以上，除249-346 h外，平均振荡周期为51 h，从总体上看，450 h后发酵后期的振荡行为趋于规律性。在振荡过程中，甘油消耗量、生物量、1，3-PDO和丁酸的产量呈现出明显的规律性波动。而乳酸、甲酸盐和乙酸的浓度表现出较少的规律性振荡，且幅度不一致。振荡初期有利于乳酸的产生，350 h后抑制到较低水平，而甲酸盐和乙酸盐浓度在振荡后期显著升高。

430到600 h的三个振荡周期内底物和产物浓度的变化如图3所示。振荡周期可分为生长上升阶段(阶段I)和下降阶段(阶段II)。阶段I时间比阶段II少(20-22 h，32-41 h)。在从第I阶段到第II阶段的一个振荡周期中，甘油浓度从60 g/L左右下降到3 g/L，逐渐积累到最大值。微生物生物量、1,3-PDO、丁酸盐和乙酸酯的产量先增加到最大值后又下降到初始值。乳酸和甲酸的浓度与甘油和其他代谢产物相比表现出明显的滞后振荡，最大值出现在第II期中期，最小值出现在第I期的早期或中期。

两种主要气体H₂和CO₂表现出频率相近的规则振荡。产氢与乳酸和甲酸的波动规律相似，在第II阶段中段出现最大值，在第I阶段中段出现最低值。CO₂的积累早于所有代谢物，最大值出现在第I期中期。CO₂浓度开始有一定程度的下降，然后达到稳定，在第II阶段迅速减小到最小值。最低产氢量出现的时间点与CO₂积累量达到最大值的时间点相对应。

由于动力学分析可以实时反映代谢通量，因此在相同的振荡周期内，探索了丁酸梭菌甘油代谢的动力学模型（图4）。甘油消耗、生物量和1，3-PDO产生率最高出现在第I阶段的中期，而不是末期。丁酸和乙酸盐表现出一致的振荡，而在达到最大峰值后，乙酸盐的生成受到的抑制比丁酸更快、更彻底。结果表明，在振荡过程中，微生物细胞在宏观代谢反应之前就感觉到了压力。甘油消耗速率和生物量、1，3-PDO和丁酸的产生率在经过峰值后可能会下降到一个短期的平台期，然后完全降至最低值。

乳酸(q_HLa)和甲酸(q_For)的比产生率呈现不同的变化规律。q_HLa在三个振荡周期(430-600 h)内呈一致的M型，一个振荡周期内有两个峰值：阶段I的中期和阶段II的中期（图4f）。低谷出现在阶段I和阶段II的末期。甲酸盐产量表现出相似但更不规则的波动。在上升阶段，q_For呈上升趋势，但略有下降。随后，降落期中期速率进一步增大，最终降至下降期后期的最低值。第二次增加的时期与浓度代谢物的平台期相对应。

对于两种气体，H₂的比产生率慢于1，3-PDO和丁酸盐等液体代谢物，最大值出现在第I阶段末期，最小值出现在第II阶段晚期或第I阶段开始，CO₂产生率与乳酸和甲酸盐的模式相似，在一个振荡周期内出现两个峰值。

图3.连续发酵中甘油(a)、生物量(b)、1,3-PDO(c)、丁酸(d)、乙酸(e)、乳酸(f)、甲酸盐(g)、氢气(h)和CO₂ (i)浓度在甘油补料浓度为88 g/L、稀释率为0.048 h⁻¹条件下的振荡规律。

图4.甘油补料浓度为88 g/L，稀释率为0.048 h⁻¹，连续发酵中甘油消耗率(a)和生物量(b)、1,3-PDO(c)、丁酸(d)、乙酸盐(e)、乳酸(f)、甲酸盐(g)、H₂(h)和CO₂(i)的振荡规律。

3 氧化还原状态

除了代谢产物，震荡过程中还检测了细胞内和细胞外的氧化还原状态。细胞内氧化还原状态由细胞内氧化还原辅因子NAD⁺/NADH水平决定。细胞内NAD⁺浓度表现出与生物量和1,3-PDO相似的振荡模式，而NADH在振荡过程中保持在较低水平。因此，NAD⁺/NADH比值的周期性波动表明细胞在第I阶段比第II阶段处于更强的氧化状态。在细胞外氧化还原状态下，氧化还原电位与NAD⁺/NADH比值的波动规律相似。细胞内和细胞外氧化还原状态的一致变化表明细胞和培养环境在内的整个系统的氧化还原状态在振荡过程中经历了剧烈的周期性波动，从氧化状态转变为还原状态，从阶段I转移到阶段II。

4 形态学分析

在一个振荡周期和初期(10 h)分别在5个时间点收获丁酸梭菌细胞，以跟踪长期培养过程中的形态变化（图5）。长期的培养导致了细胞形态发生显著变化，与发酵早期的均匀梭形相比，511-573 h的微生物细胞显示出更细长的杆状形状。在生物量达到最大值的511h，微生物细胞呈现出不均匀的丝状结构，其长度尺度从1-12μm不等。21h后，当生物量浓度降至最大值的一半左右时，微生物细胞的大小分布变得更加不均匀，长度范围为1-20μm。此时观察到细胞聚集和多个细胞碎片/孢子。随后，在最低生物量浓度的552 h，细胞碎片/孢子比例变大，很少有拉长和聚集的细胞。到564 h，当细胞以最高生长速率恢复到最大生物量浓度的一半左右时，微生物细胞在振荡过程中显示出最均匀的大小分布，视野中的碎片/孢子较少。到573 h菌体浓度达到最大值时，细胞形态恢复到与511 h相似的状态，几乎没有碎片或孢子，但游离细胞不均匀。

图5.丁酸梭菌S3在振荡周期中的形态变化。

5 基因组和转录组分析

为了进一步分析新分离菌的代谢模式，对丁酸梭菌S3的基因组进行了测序和注释。基因组全长4350028 bp，N50为50728bp，共214个scaffold。通过NCBI的PGAP注释共得到3738个基因。

在一个振荡周期中，选择5个连续发酵时间点（528 h, 536 h, 552 h, 561 h和567 h），对丁酸梭菌的转录本进行了分析。由于甘油代谢和形态发生明显变化，本研究重点关注甘油代谢和应激反应相关基因。图6总结了与甘油代谢相关的关键基因的表达谱。

编码甘油吸收(途径1)、甘油还原为1,3-PDO(途径2-3)和甘油氧化为丙酮酸(途径4-10)的基因在一个振荡周期中表现出一致的表达模式：在第II阶段表达量最低，在第I阶段表达量最高，这与代谢谱相一致。在1,3-PDO的产生(途径2-3)中，编码甘油脱水酶(GND98_RS15995)及其激活蛋白(GND98_RS16000)和1，3-PDO氧化还原酶(GND98_RS16005)的3个基因在一个振荡周期中的表达变化最为显著，567 h的表达量分别是528 h的44、45和75倍。在丁酸梭菌S3中鉴定出两条平行的甘油转化为二羟丙酮磷酸酯(DHA-P)的途径：第一，甘油由甘油脱氢酶(GND98_RS15960，途径4)转化为DHA，然后由二羟丙酮激酶转化为DHA-P。第二，甘油被甘油激酶(GND98_RS14080，途径6)转化为甘油-3-磷酸(GND98_RS14080，途径6)，然后被甘油-3-磷酸脱氢酶(GND98_RS14075，途径8)转化为DHA-P。所有参与这两条途径的基因表达模式相同，528 h和552 h的表达量明显低于其他时期，567 h的表达量最高。

丁酸梭菌降解丙酮酸有三条途径。在乳酸生成(途径11)过程中，有4个基因(GND98_RS11690、GND98_RS12540、GND98_RS12925、GND98_RS14955)注释为l -乳酸脱氢酶(LDH, EC1.1.1.27)，在一个振荡周期中表现出不一致的表达模式（图6a）。丙酮酸可以被丙酮酸：甲酸裂解酶PFL(EC 2.3.1.54，途径12)或丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶PFO(EC 1.2.7.1，途径13)分别转化为乙酰辅酶A，同时产生甲酸盐和还原铁氧还蛋白(Ec 2.3.1.54，途径12)或丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶PFO(EC 1.2.7.1，途径13)。甲酸合成过程中，编码PFL和PFL激活蛋白的基因与编码途径1-10的酶的表达模式明显相反，在第II阶段的表达水平高于第I阶段。PFL编码基因(GND98_RS14935)在536h的表达量是其他振荡阶段的2倍以上。PFL激活蛋白基因(GND98_RS14940)在528h表达量最高，是561h最低表达量的2.7倍。而PFO编码基因(GND98_RS01050,pathway 13)的表达水平在振荡周期中没有明显变化，但平均表达水平远高于PFL。

丁酸梭菌中有两条还原铁还蛋白氧化催化途径，通过氢酶或通过铁氧还蛋白：NADH还原酶。氢化酶基因的位点标记为GND98_RS03195，与乙酰丁酸杆菌DSM 792(EF627973)的氢化酶基因HydA的同源性为98.67%。该基因在第II阶段中期536h表达量最高。编码氢化酶HydG(GND98_RS14165)和HydF(GND98_RS19635)的两个基因在第II阶段536h和552h的表达水平也最高。与1，3-PDO产生和甘油氧化为丙酮酸的基因表达水平相反，所有氢化酶基因的表达水平均在第II阶段达到最高水平，这一结果与产氢落后于细胞生长和1，3-PDO的代谢规律是一致的。此外，在一个振荡周期(途径15，紫色标记)中，还发现了编码固氮酶不同亚基(EC1.18.6.1)的4个基因的高表达。固氮酶能以氮为电子受体氧化还原铁还蛋白，并伴随ATP消耗和氢气的产生。这些基因的表达模式与氢化酶相似，在第II阶段表达最高(536h)，在第I阶段表达最低(561h)。铁氧还蛋白的另一种再生途径是铁氧还蛋白-NAD+还原酶(EC1.18.1.3)。但是在丁酸梭菌S3中并未鉴定到编码该酶的基因。编码铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶(EC1.18.1.2，途径16)的两个基因(GND98_RS12070，GND98_RS12075)以NADP⁺为电子辅因子，表现出较高的表达水平。这些基因在536h表达最高，与氢化酶和固氮酶的编码一致。因此，所有编码氧化还原铁氧还蛋白的酶的基因在一个振荡周期中都表现出相反的表达模式。

乙酰辅酶A是进一步合成主要副产物丁酸酯和乙酸酯的分支点中间体。对于丁酸合成(途径17)，所有相关基因在一个振荡周期中表现出相对一致的变化模式，在阶段I(567 h)表达量最高，在阶段II(528/552h)表达量最低，与途径1-10相似。编码磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8，GND98_RS01915，途径18)和乙酸激酶(EC 2.7.2.1，GND98_RS01920，反应19)的基因在528-536 h显著上调，随后在536-567 h逐渐下调。这种表达模式与乙酸动力学不一致，在528-550h期间，乙酸盐的产生被完全抑制，而在561-567 h期间，乙酸盐的产生被高度激活（图4）。此外，乙醛-辅酶A/醇脱氢酶(EC1.2.1.10，1.1.1.1)可将乙酰辅酶A转化为乙醛，并有可能转化为乙醇。该基因(GND98_RS12095)在一个振荡周期中高表达，在第Ⅱ阶段的表达量明显高于第Ⅰ阶段。这种模式与途径1-10正好相反，在整个发酵过程中没有检测到乙醇。乙醛还可以被乙醛脱氢酶进一步转化为乙酸酯(EC1.2.1.3)。该酶基因虽然在丁酸梭菌S3(GND98_RS02310)中发现，但其平均表达量比乙醛-辅酶A/醇脱氢酶低235倍。因此，没有足够的证据表明乙醛在发酵过程中进一步转化为乙酸或积累。此外，在丁酸梭菌中还发现了编码丙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)的基因(GND98_RS14095)，该基因能够催化乙酰辅酶A转化为乙酸酯(途径22)，其表达趋势与途径1-10相似。

振荡行为可以看作是相对于长期基质不足的应激反应。热休克蛋白(HSP)是帮助细胞修复和降解被温度、盐、溶剂或其他胁迫损坏的蛋白质的分子伴侣。图6b显示了一个振荡周期内热休克蛋白的表达。编码I类热应激蛋白GrpE、DhaK、DhaJ和GroES、GroEL的基因及其抑制因子HrcA在细胞特异性生长速率下降的528、536和567 h表达量显著高于细胞特异性生长速率增加的552-561 h（图4）。对于II类热应激蛋白，在丁酸梭菌S3基因组中发现了编码sigma因子SigI和抗sigma因子RsgI的基因(GND98_RS03420,GND98_RS03415)。与振荡的其他阶段相比，这两个基因在536h显著上调，尤其是在567h上调最显著。在丁酸梭菌S3中发现了多个编码Ⅲ类热休克蛋白(HtpG、CSTR、ClpC、ClpX、ClpP、Tig)的基因，并在536h有较高水平的表达，没有发现编码Ⅳ类热休克蛋白(HtrA)的基因(HtrA)，但有两个编码DNA修复蛋白RADA(GND98_RS14600)和RecF(GND98_RS11345)的基因在GND98_RS11345中有较高水平的表达。LexA抑制子和RecA激活子是参与微生物细胞SOS反应的两个核心蛋白。两个基因在536h和567h的表达量均高于其他时期。由于细菌SOS反应是对DNA损伤的整体反应，SOS相关基因的表达趋势表明，在振荡过程中，微生物细胞可能遭受DNA损伤。在产孢方面，在丁酸梭菌S3的基因组中发现了许多与孢子形成有关的基因。其中三个基因在一个振荡周期中的表达水平显著高于其他基因。编码RNA聚合酶产孢σ因子SigH(GND98_RS14650)、内孢子形成主控蛋白Spo0A(GND98_RS02685)和分离蛋白SpoVG(GND98_RS02835)的基因。这三个基因在536h和567h的表达量均显著高于其他振荡时期（图6b）。

图6.丁酸梭菌S3在一个振荡周期中的5个时间点(从左到右分别为528h、536h、552h、561h和567h)甘油代谢相关基因(a)和胁迫反应相关基因(b)的表达水平。

讨论

丁酸梭菌是一种很有前途的生物化工原料，也是人体肠道的重要寄主。丁酸梭菌S3是一种竞争性的1,3-PDO生产菌，在长期连续发酵中表现出不稳定的性能，这是在底物甘油补料充足或有限的所有条件下表现出不稳定的表现。因此，代谢变化有可能是对来自长期连续操作的特定压力的反应。本研究选择了振荡行为来探索这一生理背后的潜在机制，这是首次系统研究丁酸梭菌振荡行为的报道。

丁酸梭菌振荡的发生与培养条件有关。只有在低稀释率时才能观察到自发振荡，振荡前残留的甘油浓度仍然很低。在不同的甘油补料浓度下，仅仅增加稀释率就会导致丁酸梭菌S3或丁酸菌密集型微生物联合体C2-2M的振荡消失。在甘油补料浓度为88 g/L的丁酸梭菌S3的连续发酵中，尽管在该条件下也消耗了大部分甘油，但是当稀释率从0.048增加到0.096 h⁻¹时没有观察到振荡（图2b）。由此可见，甘油限制条件似乎是丁酸梭菌发生振荡行为的先决条件。当通过将甘油进料浓度降低到44 g/L来进一步限制底物供应时，可以触发振荡行为，但在0.048或0.096 h⁻¹的低稀释速率下不能维持振荡行为（图2c和d）。结果表明，除了甘油的限制外，丁酸梭菌S3维持振荡的最低甘油浓度(本研究中为88g/L)也是必需的。根据结果排除了振荡发生的一个常见原因：已知最终产物的毒性，因为在甘油供应充足的连续发酵中，1，3-PDO、丁酸、醋酸、乳酸和甲酸盐的产量与之相当，但没有观察到振荡。

丁酸梭菌S3的典型振荡行为与肺炎克雷伯菌、乙酰丁酸克雷伯氏菌和巴氏克雷伯氏菌等原核微生物的典型振荡行为不同。首先，它不是由环境扰动触发的，而是自发发生的;其次，不是像巴氏梭菌那样在培养初期出现连续振荡，而是在超过100 h后细胞表现出相对稳定的生长和代谢（图1）;第三，丁酸梭菌S3的振荡幅度远大于上述几种微生物。在振荡过程中，丁酸梭菌S3可能比生长率为零甚至负 (图4)，出现异常的细胞团和碎片/孢子(图5)以及在振荡低谷过表达与胁迫相关的基因(图6b)。

在振荡过程中，丁酸梭菌S3表现出一个总的代谢周期，其中甘油和所有代谢物的浓度呈现周期性波动（图1）。乳酸和甲酸盐的产量落后于微生物的生长，其他代谢物包括1,3-PDO和丁酸盐的产量也落后于微生物的生长。动力学分析表明，在一个周期内，乳酸和甲酸的比产率出现两个峰值。第一个峰值出现在上升期中段，与其他代谢物的峰值一致。另一个峰值出现在下降期中期，其他产物的合成受到抑制。因为乳酸和甲酸盐都是丙酮酸代谢的直接产物(图6A，途径11和12)。这两种酸的异常模式直接指向了振荡过程中丙酮酸代谢的紊乱。在丁酸梭菌中，丙酮酸主要通过丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶转化为乙酰辅酶A，而不是途径11和12。综合各种因素推测乳酸和甲酸产生的异常模式是对受阻的丙酮酸降解途径(途径13)的响应，导致细胞在应激状态下激活替代途径。事实上，乳酸和甲酸不是丁酸甘油代谢的主要副产物。当丁酸梭菌处于胁迫状态时，乳酸倾向于积累，表明甘油代谢向乳酸积累转变可能是丁酸梭菌在胁迫下的普遍现象和第一反应。由于丁酸梭菌S3在振荡后期表现出从乳酸生产到甲酸生产的显著代谢转变（图1）推测甲酸途径的激活是丁酸梭菌S3在甘油限制条件下长期连续作用后的第二反应。对于连续发酵后期代谢由乳酸转向甲酸的原因，提出了两个假设。首先，丁酸梭菌S3可能在甘油限制条件下进行代谢自我优化。虽然乳酸和甲酸都是丙酮酸代谢的产物，但乳酸的生产需要NADH作为还原力，而不需要产生ATP。相反，甲酸盐的生产伴随着乙酰辅酶A的形成，而乙酰辅酶A会进一步转化为副产品，如丁酸盐和乙酸盐，以产生能量和降低动力（图6）。长期甘油不足培养，代谢途径由乳酸转化为甲酸，从而产生更多的能量和还原能量，支持细胞生长和1,3-PDO的产生。第二，代谢的显著变化可能是由于长期甘油限制操作过程中某些有毒中间体/产物的积累所致。

代谢谱的另一个值得注意的现象是H₂产生模式的变化。与以1,3-PDO为代表的细胞生长和主要产物的合成相比，H₂的产生速率呈延迟模式。对于H₂产生途径，首先排除了甲酸裂解产生H₂的可能性，因为基因组中既不存在编码甲酸脱氢酶的基因，也没有观察到该酶的活性。因此，H₂只能通过途径14(氢酶)和途径15(固氮酶)产生，这两个途径都与还原铁氧还蛋白的再氧化作用相耦合。铁氧还蛋白是丙酮酸的辅酶：丙酮酸代谢的铁氧还蛋白氧化还原酶。同样，相反的产氢趋势也表明丙酮酸代谢紊乱，特别是铁氧还蛋白循环的紊乱。

氧化还原平衡是甘油异化的关键，而甘油异化与微生物细胞的代谢通量密切相关。细胞外氧化还原电位会显著影响细胞内氧化还原状态，反之亦然。胞内(NAD⁺/NADH)和胞外(ORP)氧化还原状态的持续波动表明，在振荡过程中，微生物细胞经历了从氧化态到还原态的明显氧化还原交替，与生物量和1，3-PDO产生的动力学特征相对应。此外，NAD⁺/NADH被认为是甘油代谢的主要氧化还原对，因为1，3-PDO的产生需要NADH作为还原力，而NADH是通过甘油氧化产生的。但在本研究中，NADP⁺/NADPH也参与了丁酸梭菌的甘油代谢，特别是铁氧还蛋白的再生(途径16)。振荡过程中细胞内NADP⁺/NADPH水平的变化需要进一步研究，以全面评估细胞内的氧化还原状态。

多项研究表明，微生物细胞在不同的应激条件下会变得细长，形成长丝，这是种群过度应激、生病和死亡的信号。在低pH值(pH<4.3)下，丁酸梭菌变成细丝/长棒状，而在pH4.7培养时，细胞恢复到正常的杆状。丁酸单胞菌DSP1在渗透胁迫条件下(初始甘油浓度为170g/L)表现出相似的伸长形态。这种丝状形态表明，微生物细胞在甘油限制条件下长期工作后处于应激状态。在工业长期连续发酵过程中，形态变化可以作为评价细胞状况的一个指标，因此研究丁酸梭菌S3在长期不稳定运行过程中的形态变化是很有价值的。然而，在一个振荡周期内，细胞形态发生了明显的周期性变化，这与微生物的生长动力学一致：在细胞生长速率下降的532 h和552 h，丁酸梭菌的长度分布与聚集体和细胞碎片/孢子高度不均匀，而在细胞生长速率达到最大时的564 h表现出最均匀的长度分布，而在细胞生长速率最低的532 h和552 h，丁酸梭菌的长度分布最均匀，在细胞生长速率最大的564h表现出最均匀的长度分布。乙酰丁酸梭菌的振荡行为也观察到类似的周期性形态变化。这种振荡是由于产酸细胞和产溶剂细胞在连续发酵过程中种群比例的周期性变化引起的。在本研究中，这种振荡行为也可能与丁酸梭菌在培养过程中的不同生长阶段有关。尽管没有证据确定532-564 h出现的颗粒是细胞碎片还是孢子，但微生物细胞在代谢、氧化还原和形态等振荡过程中，在下降阶段遭受了严重的损害。

从丁酸梭菌S3的基因组信息中，有关甘油代谢的几个发现引起了人们的关注。首先，在丁酸梭菌S3中，甘油脱水酶及其激活蛋白(基因位点标签：GND98_RS15995、GND98_RS16000)分别与丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶激活酶的同源性最高。基于先前的研究，丁酸梭菌S3中的甘油脱水酶很可能与丁酸杆菌VPI1718中的甘油脱水酶一样不依赖维生素B12。这一特点使得丁酸梭S3在工业应用中更具竞争力，不需要额外的营养来补充维生素B12。第二，对于甘油氧化为DHA-P，在丁酸梭菌S3中发现了两条平行的代谢途径(途径4-5，6-7)，两条代谢途径的相关基因在一个振荡周期内都有相当程度的表达。这一结果不同于以往对丁酸链霉菌VPI 3266的研究，后者仅依赖途径4-5来实现甘油氧化。第三，对于丙酮酸代谢的关键电子载体蛋白铁氧还蛋白的再生，没有发现编码铁氧还蛋白：NAD⁺还原酶的基因。相反，发现一个利用NADP⁺作为铁还蛋白再生辅酶的编码铁还蛋白NADP⁺还原酶的基因，并且在一个振荡周期中表现出周期性的表达水平。这是首次报道依赖NADP⁺的铁氧还蛋白再生途径参与丁酸甘油代谢。还发现了催化铁氧还蛋白再生、产氢和固氮的固氮酶基因，并在一个振荡周期(第15号途径)中高水平表达，这也是首次报道固氮酶参与丁酸甘油代谢。

在这些基因中通常在一个振荡周期内有两种相反的表达模式（图6）：类型I在上升阶段表达最高，在下降阶段表达最低，类型II反之亦然。I类基因的转录模式与生长和动力学特征一致，而II型基因在微生物细胞凋亡的下降阶段表现出高表达，编码II型热休克蛋白和DNA修复蛋白的多个应激反应相关基因。II型基因的反向变化模式表明，相关的通路可能是振荡行为的触发或反应。参与甘油代谢的II型基因的转录水平与甲酸和H₂的代谢谱相一致。对于乳酸途径，需要进一步研究以确定乳酸脱氢酶(LDH)活性在振荡过程中的变化规律。转录组分析进一步证实了振荡过程中丙酮酸代谢的紊乱，这可能与长期底物不足引起的铁氧还蛋白循环受阻有关。编码PFO(途径13)的基因没有表现出周期性表达，需要围绕该酶及其相关途径进行广泛的研究。丙酮酸代谢紊乱也是另一株肺炎克雷伯菌1,3-PDO产生菌振荡行为的潜在原因。丁酸梭菌S3振荡行为的原因明显不同，因为它是自发发生的，而且编码丙酮酸脱氢酶的基因在丁酸梭菌S3基因组中不存在。

产物反馈抑制是微生物细胞振荡行为最常见的原因之一。在本研究中，考虑到与胁迫反应和孢子形成相关的基因在下降阶段的抑制、形态异常以及与胁迫反应和孢子形成相关的基因的高表达，丁酸梭菌S3的振荡行为也可能是由于有毒产物的过度积累造成的。结合仅在甘油限制条件下发生振荡的结果，推测长期缺乏以甘油为代表的生长因子可能导致丁酸菌S3代谢偏移，有毒中间产物积累，最终导致振荡行为。首先，中间体3-HPA的积累首先被排除在外，因为在整个振荡过程中，浓度一直保持在较低的水平。乙醛，通过途径20产生的剧毒中间体，可能会在振荡过程中积累。乙醛是原核生物和真核生物的一种剧毒中间体，是一种广泛的酶反应抑制剂，当细胞处于应激状态时，乙醛会积聚。细胞内和胞外乙醛浓度的确定还需要进一步的研究。这两种振荡相关现象的潜在机制：丙酮酸代谢紊乱和乙醛蓄积过多也可能是相互关联的。

结论

本文对一株新发现的以甘油为底物连续发酵生产1,3-PDO的丁酸梭菌的振荡发生条件、宏观特征和分子特征进行了研究。这种振荡行为似乎只发生在甘油受限的低稀释率条件下。在一个振荡周期中，代谢和动力学分析表明，乳酸、甲酸和氢气的产量明显落后于其他代谢物。扫描电镜照片显示振荡谷处有多个聚集体和多个细胞碎片/孢子。转录组分析表明，编码甲酸生成、铁氧还蛋白氢化氧化、固氮酶和铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶、部分乙酰辅酶A降解以及多个胁迫反应相关基因的表达水平与代谢谱相反。根据已有的研究结果，推测长期底物限制引发了丁酸梭菌S3的两个振荡相关现象：胞内丙酮酸代谢紊乱和乙醛过量积累。