科研 | Nat Commun：人类肠道微生物群中病因特异性死亡风险的分类特征

导读

粪便材料的收集和测序技术的发展使标准化和非侵入性肠道微生物组学分析成为可能。来自几个大队列的微生物组组成与各种生活方式因素和疾病存在交叉联系。尽管有这些进步，由于缺乏足够大且具有代表性的人群队列和全面的随访数据，微生物组组成与健康之间的前瞻性关联仍然没有得到明确的描述。人群水平健康调查的长期研究传统、高参与率和全面健康调查的可用性，使进一步更为广泛和可靠的关联研究成为可能。   

本研究中，作者分析了来自芬兰的具有代表性人群(n=7211)中肠道微生物组变异和死亡率之间的长期联系。经过对15年的随访数据进行分析和研究，作者发现了与Enterobacteriaceae（肠杆菌科）与死亡风险有强相关的分类学和功能性微生物群特征。该研究结果扩展了以前的横断面研究，帮助建立了检查人类肠道微生物组成和一般健康状况之间的长期联系；证明了与肠杆菌科相关的分类和功能微生物群特征与一般人群死亡率风险相关；并为研究人类肠道微生物组分、死亡和一般健康状况之间的长期相关性奠定基础。

论文ID

原名：Taxonomic signatures ofcause-specific mortality risk in human gut microbiome

译名：人类肠道微生物群中病因特异性死亡风险的分类特征

期刊：Nature Communications

IF：14.919

发表时间：2021.5.11

通讯作者：Leo Lahti

通讯作者单位：芬兰图尔库大学计算机系

实验设计

结果

1 研究目标样本和微生物组组成 

在7055名有完整数据的参与者中，总共有729人(10.2% )平均在14.8年随访期间死亡 (图1a，b)。我们调查了死亡率与微生物组成，包括alpha和beta多样性、属丰度、分类学共现网络和功能预测等关键特征之间的联系。本组共观察到51个门，1754个属(补充数据1和2)。个体间在分类组成上的差异主要归因于最普遍和最丰富的属的相对丰度的差异(图1c，图S1和补充数据2)。大多数属是罕见的，并仅在1% 以下的参与者中观察到。除了分析整体物种多样性，我们还重点分析了在样本内参与者中检测到的相对丰度>0.1% 的91个属级分类群。这些包括大多数细菌属(87个)，但也包括病毒属(1个)和古生菌属(3个)(补充数据2)，其相对丰度中位数为99.3% 。  

图1 研究样本和肠道微生物群落特征。a在基线水平上，研究样本(n=7211)具有平衡的性别比例(55% 为女性，女性为红色：男性为蓝色)，平均年龄为49岁(24-74岁；左侧面板)，平均身体质量指数(BMI)为27  kg/m2(16-57岁；中间面板)。在14.8年的中位随访时间内，7055名(10.2% )有完整数据的参与者中有721人(右侧)死亡。b在芬兰6个区随机抽取的13500名个人中共有7211人(参与率为53.4% )接受了粪便抽样和体格检查，并填写了关于健康行为、疾病史和当前健康状况的问卷。c主坐标分析(PCoA)表明样本相似性基于种级分类组成。颜色表明每个样本中的主要属(最丰富的属)。总的来说，96% 的样品以图中所示的六个属中的一个为主。  

2 微生物组特征与死亡风险之间的联系 

我们对在15年的随访中检查微生物组特征是如何与死亡风险的关系进行了前瞻性分析。α多样性与死亡率无显著相关性(假发现率(FDR)校正p=0.17，Cox回归系数双尾Wald检验，补充表1)。然而，我们在β多样性，或者说整个群落的变化和高死亡率之间发现了一个强有力的显著联系。我们使用标准中心对数比率变换(CLR)来减少分类丰度数据中的组合性偏差，并观察到第三主成分的CLR变换的物种丰度矩阵(PC3)与所有原因死亡风险(危险比率(HR)，1.14；95% 的置信区间(CI)，1.07-1.23；FDR-corrected p=0.001，Cox双尾Wald检验的系数，图2和补充表1)紧密相关。这项观察对已知的影响微生物组成和死亡风险的因素（即：年龄、性别、体重指数、吸烟、糖尿病、抗肿瘤药物或免疫调节剂的使用、收缩压和抗高血压药物的使用等）是有效的。令人惊讶的是，PC3与死亡率的相关性甚至比收缩压更强，然而后者已被确定为全球疾病负担的主要原因(补充表2)。此外，与PC3有关的发现可以在遗传背景、生活方式和预期寿命不同的东芬兰和西芬兰人的独立样本中观察到(图S2)。PC3是由肠道Enterobacteriaceae科的某些物种驱动的，这些物种是正常肠道微生物群的一部分，但也会引起肠道和其他身体部位的传染病。健康饮食选择评分代表了健康饮食(辅助方法)，在协变量中，PC3与死亡率之间的关系没有实质性改变(HR，1.13；95% CI，1.04-1.23；p=0.005)。健康食品选择评分与同一模型中的死亡风险降低有关(HR，0.86；95%  CI，0.78-0.95；p=0.003)，显示了该评分的稳健性。此外，在重新计算基线前6个月没有使用抗生素的参与者样本的主要成分后，PC3与死亡率之间的关联仍然显著(HR，1.12；95% CI1.04-1.21；p=0.0003)。  

图2 主成分与死亡风险。死亡风险与β多样性前三个主成分的关系。黑线表示估计的危险比率与中位数PC值和蓝色区域的95% 置信区间(CI)。PC的单位方差增加与PC1-PC3的危险比(分别为0.92(95%CI，0.85-0.99；FDR-调整p=0.065；双尾Wald检验)、0.95(95%CI，0.87-1.02；FDR-调整p=0.17；双尾Wald检验)和1.14(95%CI，1.07-1.23；FDR-调整p=0.001；双尾Wald检验))有关。分析调整了年龄、体重指数、性别、吸烟、糖尿病、抗肿瘤和免疫调节剂的使用、收缩压和自我报告的抗高血压药物。虚线表示危险比率在PC值的中位数为1。HR为风险比。   

3 Enterobacteriaceae（肠杆菌科）和特定原因死亡之间的联系 

在病因特异性死亡的分析中，Enterobacteriaceae（肠杆菌科）丰度和PC3的增加与胃肠道和呼吸道原因的死亡密切相关(图3和图S5)。与第一个四分位数的参与者相比，第四个四分位数的Enterobacteriaceae（肠杆菌科）丰度和PC3的个体分别有34% (95% 可信区间)和49% (95% 可信区间)的死亡风险。几个Enterobacteriaceae的属也独自与死亡率相关(补充表3)。标准化的CLR转化的Enterobacteriaceae（肠杆菌科）总丰度与流行性肝病相关(beta，0.33；95% CI，0.027-0.64；未调整p=0.03，双尾Wald检验)。由于缺乏统计，因为这些基因在FINRISK样本中的流行率很低，因此无法对毒力基因和疾病结果的影响进行更深入的分析，(<1% ；补充数据4)。这些基因主要与Escherichia coli有关。  

图3 Enterobacteriaceae（肠杆菌科）丰富与特定原因死亡率之间的联系。考克斯风险比和95%的置信区间报告每单位方差增加的Enterobacteriaceae（肠杆菌科）丰度。盒子的大小与p值成反比。整个研究样本(n=7211)以每个死亡原因为终点进行独立检验。分析调整了年龄、体重指数、性别、吸烟、糖尿病、抗肿瘤和免疫调节剂的使用、收缩压和自我报告的抗高血压药物。HR为风险比，FDR为错误发现率。   

4 微生物分类学组成和死亡风险 

然后，我们调查了分类组成在反映死亡率升高风险方面的整体能力。我们确定了40个属的丰度与死亡率之间存在显著的线性和非线性关系(FDR校正的p<0.05；图S6a和补充表3)。此外，我们应用随机生存森林模型来确定一个与所有原因死亡率有最强联系的联合分类标记。在这个监督分析中确定的顶级分类特征还包括多个Enterobacteriaceae（肠杆菌科）属(附图6b和补充数据5)。然而，与8个协变量相比，群落组成并没有改善总死亡风险评估(协变量为0.798，群落组成为0.796；p=0.11，配对t检验，5倍交叉验证)。作为补充分析，我们在随机生存森林模型的基础上确定了东部人口中与死亡率相关的微生物群系特征，然后测试了它们在西部人口中的表现(表1)。与单独使用宿主协变量相比，结合微生物群落特征并没有显著改善随机森林的存活表现。微生物组特征提供了死亡风险的信息，但并没有带来比宿主协变量更多的性能收益。   

表1 不同特征集的死因特定c-统计量。

生存随机森林在东部人口进行训练，然后在西部人口上进行测试。0.5的c-统计量对应于一个随机的期望值，更高的值表明性能得到了改善。结合核心微生物组特征并没有显著改善宿主协变量的c-统计量。   

5 分类学共现网络与死亡风险 

为了确定可能与死亡风险相关的具体分类标记，我们将重点转向更精确的次级群落分析，以此补充群落一级的分析。我们根据分类共现网络分析确定了紧密聚集的属的种群。所有四个最强的网络模块，或子网络(图4，附图7和补充数据6)，包括与所有原因死亡率相关的属。我们观察了主要由Enterobacteriaceae（肠杆菌科）属组成的亚网络中最强的网络内相关性和死亡率关联性。这个亚网络在西芬兰和东芬兰人群中都观察到(图S8)。该亚网络的总丰度与死亡风险增加有关(HR=1.16，95% CI ， 1.08-1.24；p=0.0002)。  

图4 与死亡风险增加有关的分类学亚网络。a在整个研究人群中，表现出最强烈死亡关联的子网络的丰度变化(CLR转化的丰度集中于零并按单位方差进行调整)。样品按子网络的总相对丰度排序。b观察到的子网络结构和死亡风险。总亚网络丰度与高死亡率相关，风险比为1.155(95% 置信区间[CI]，1.08-1.24；p=0.0002，WaldCox回归双尾检验统计量，4.07)；风险比为1.17(95% CI，1.07-1.27；p=0.001，Wald统计量为3.66)；风险比为1.14(95% CI，1.001-1.31；p=0.15，Wald统计量为2.02)。这些分析是在剔除了稀有类群后进行的，并根据年龄、体重指数、性别、吸烟、糖尿病、使用抗肿瘤药物和免疫调节剂、收缩压和自我报告的抗高血压药物进行调整；p值经FDR-调整。

6 微生物组功能特征与死亡风险 

使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)的基因组(KO)，我们评估了死亡风险升高的个体中潜在的微生物功能作用(图S9和补充数据7)。许多与死亡率相关的标记涉及KEGG类别的药物生物降解，糖代谢，脂质代谢和传染病。这些关联既有正关联也有负关联(图S9和补充数据7)。许多先前的研究表明，肠道微生物可以影响脂质和葡萄糖的新陈代谢及其循环水平，进而可能影响心血管代谢疾病的风险。此外，已有研究表明，肠道微生物群能够直接影响药物代谢，通过药效和毒性影响疾病风险。另一方面，几种常用的药物已经与肠道微生物分类学、代谢潜能和耐药性的广泛变化有关。与死亡率负相关的功能途径还包括与神经系统相关的生物过程(图S9)。虽然这些功能性预测表明，肠道药物相互作用、肠道微生物组-代谢组相互作用以及肠道-脑轴可能在疾病的发展中发挥作用，但还需要进一步的研究来确认已确定的相关因素。

讨论

我们的分析为人类粪便微生物组的长期健康关联提供了一个系统的量化分析，可以确定在15年随访期间与全因死亡率相关的特定肠道微生物组学特征。这些联系可以在具有不同遗传背景、生活方式和死亡率的东芬兰人和西芬兰人身上观察到。我们的研究结果扩展了以前报道的横断面关联。然而，尽管是一个异质性的结果，全因死亡率也是一个强有力的终点，因为它几乎没有错误分类或后续损失。虽然PC3第四分位数的个体比第一分位数的个体的全因死亡率相对风险高49%，但微生物组特征并没有改善模型辨别能力。然而， c -统计量是评估模型拟合变化的保守方法。即使普遍接受的疾病危险因素，如高血压和吸烟，单独对c-统计量的影响也很小，但可以更准确地将大部分患者分为高危或低危类别。主成分分析特征被优化以发现种群中个体之间的最大差异，因此它们可能受到环境和宿主因素的影响，这可能会限制显著性估计。无监督主成分分析分析(PCA)已经被普遍用于揭示微生物群变异的广泛模式、健康和环境因素之间的联系，它提供了了解潜在原因的第一步。此外，我们关于肠道微生物组与特定原因死亡率之间关系的研究结果表明，尽管发生的事件数量较少，因此统计能力较低，但肠道微生物组与某些致命后果之间的关系要比与其他致命后果之间的关系强得多。观察到的相关性表明，人类肠道微生物组的特定分类结构可能反映与死亡率增加有关的健康相关变化，或可能在维护健康和发展突发疾病方面发挥独特作用。 

我们的研究结果推动了目前的胃肠道和呼吸道疾病与肠道微生物之间的研究，在一个长期随访的普通人群队列研究中，证明了Enterobacteriaceae（肠杆菌科）成员与死于胃肠道和呼吸道疾病之间存在着特别强烈的联系。在之前的横断面人体研究中，已经观察到Enterobacteriaceae（肠杆菌科）在炎症性肠病和结直肠癌患者中丰度高。据推测，由于腹泻这种许多胃肠疾病的症状，大便传输时间更快，通常上半身占据的Enterobacteriaceae（肠杆菌科）丰度更高。宿主介导的炎症也被证明能破坏肠道微生物组并促进肠杆菌的过度生长。另一方面，肠道E. coli的流行率增加和毒力增强都与泌尿道感染有关。事实上，肠外E. coli菌株通常存在于肠道内，但是不会引起任何疾病，但有能力传播和殖民其他宿主生态位，包括血液、中枢神经系统和泌尿道，导致疾病。从皮肤或血液样本中培养出的多药耐性Enterobacteriaceae（肠杆菌科），也与重症监护病房患者经过数周至数月的短期随访后的较差预后相关。我们的研究结果提高了对一般人群中Enterobacteriaceae（肠杆菌科与-死亡率关系的理解。也就是说，经过15年随访，我们在随机人群样本中证明了肠道Enterobacteriaceae（肠杆菌科）和死亡之间的密切联系，这使得我们的研究结果和肠道微生物长期健康关联的证据具有更高的普遍性。 

我们分析的一个特别的优势是：可以获得一个随机的、具有代表性的人口样本，其中包括来自北欧人口的数千名成年人，并且可以获得全面的电子健康登记册。此外，我们的发现在东芬兰和西芬兰的人群中都能得到验证。因此，这可以补充以前的不同区域人口研究的结果，这些研究的代表性较为有限，因为它们侧重于特定人口、缺乏随机抽样或参与率较低。尽管我们的测序深度受到资金限制，但以前已经证明，鸟枪测序提供的数据与超深测序（ultradeep-sequenced）数据密切相关。我们的数据包含了许多稀有的属和种。为了减少近缘物种之间分类概况和潜在的错误分类的噪音，特别是影响低丰富的分类群和集中于群体水平的变异，我们从大多数分析中排除了最少流行（least prevalent）的属(补充表2)，并突出Enterobacteriaceae（肠杆菌科）作为一个与高死亡风险有关的科的作用。此外，我们的数据缺乏某些最近与微生物组成联系在一起的协变量，例如粪便浓度和粪便色素颗粒蛋白A。因此，我们的分析结果需要在长期跟踪健康状况的独立组群中进一步重复。尽管目前缺乏可以用于在外部复制我们预期结果的群组，但我们的研究结果对今后设计以绘制长期微生物组健康关联图为目的的研究具有一定的参考作用。 

直到现在，将微生物组成与死亡联系起来的前瞻性长期数据尚未获得。我们的数据为微生物组用来评估死亡率风险以及潜在的疾病风险的概念提供了证据。为了评估哪些疾病状态可以通过微生物组分析得到最有效的预测还需要进行更多的研究。此外，我们的研究结果可以帮助建立一个框架，招募易患疾病的个人参加随机试验，以评估肠道微生物组变异对健康结果的因果影响。然而，在正常菌群基因测序用于疾病的预测、预防和靶向治疗之前，仍然需要进行广泛的研究。 ----------微科盟更多推荐----------

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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