编译：微科盟橙，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
地球表面的大片区域被远古海洋蒸发的盐层所覆盖，并被极端嗜盐微生物所占据。其中一些嗜盐生物可能在地质时间尺度上保存在高盐流体包裹体中，但水的侵入或人为活动可能会形成新的替代栖息环境，包括NaCl钟乳石或其他洞穴岩。虽然人们已经对古代蒸发岩的微生物学进行了成熟的研究，但对这些最近形成的结构的生态学却知之甚少。作者以三叠纪盐岩中盐钟乳石的微观生物学为研究目标，通过确定液体夹杂物的存在与否，进而明确盐池的微生物结构与附近的含盐环境和表层土壤样品的微生物学差异，并表征这种独特生态系统的微生物生态学机制。盐钟乳石中含有流体夹杂物，其中的微生物组主要由广古菌和其他微生物组成，相对于土壤微生物组中表现出更过的涉及厌氧呼吸、紫外线抗性、氧化应激和应激蛋白质合成的大量基因。通过研究盐分的潜在影响，发现作为封闭的盐饱和栖息地，这些栖息地能够免受电离辐射并具有稳定的水活性。
原名：Microbiology of a NaCl stalactite ‘salticle’ in Triassic halite
译名：三叠纪盐岩中盐钟乳石的微观生物学
期刊：Environmental Microbiology
IF：5.491
发表时间：2021.4.13
通讯作者：Brendan F. Gilmore
通讯作者单位：英国贝尔法斯特女王大学药学院
爱尔兰盐矿勘探有限公司在盐矿中发现三叠纪盐岩沉积物距今约2.5亿年，其中包含液体夹杂物，以及盐湖水的遗留残余物。此外还保留着三叠纪时期的气泡、硫酸盐矿物质和微生物。通过对岩体元素进行元素测定及定性和定量分析，确定盐池的元素组成。此外进行样品收集和DNA提取进行微生物组学分析。进一步评估了盐池微生物的独特代谢潜力。
实验设计流程
盐池具有薄、尖的形态，具有补充盐水的结构，从而促进盐池的生长（图1A）。通常，由饱和盐水的水滴形成薄层，即使在低温环境下，缓慢移动的饱和盐水也能够保持液体状态，并保持活性，从而能够提供一种生物物质稳定的栖息环境。这些微环境在矿区内形成了一个低于地面的深度，通过对盐池以及附近的样品进行了元素分析，以确定盐池是否由接近纯NaCl组成。该分析证实，盐池的嗜盐微生物大于99%，此外具有少量其他微生物（表1）。表1. 组装的基因组（MAG）完整度大于90%、污染度小于5%。
如图1所示盐池中存在流体夹杂物，所有这些包含在晶体结构的初始生长期间被捕获的盐水，并且这种高盐环境支持生物质密集型的生物多样性生态系统。
图1. “盐池”的图像。（a）盐池（白色）在盐矿的下表面约130米深度，直径约为10厘米，高度为45厘米。（b-d）盐池中的主要流体夹杂物。作者采取了一种三管齐下的方法来研究盐池的微生物学机制。首先，确定在液体夹杂物中存在的微生物群落；其次，将盐池微生物与附近可比较的栖息地（盐水库）和附近的非盐水土壤进行比较；第三，进行了功能分析，以寻求碳源代谢的证据。选择的栖息地是同一盐矿内的饱和盐水库。
Megaw等人已经描述了盐矿中包含的微生物多样性。因此，作者采取的下一步研究是表征较高级别的分类群和物种级别的分类群，从而全面研究盐池的微生物生态学机制。盐池、盐水库和土壤的微生物均显示出明显的差异（图2a-c）。对于盐池样品，10.15%是细菌，89.33%是古菌。对于盐水池，24.70%是细菌，76.40%是古菌。对于盐池和盐水库，古菌比细菌更丰富，但古菌在盐池中占比较大，这表明古菌更适应盐池流体夹杂物。在土壤中，99.12%为细菌，只有0.59%是古菌。分类学分析和重建的基因组（MAGS）（表2）证实了盐池和盐水库样品中嗜盐古菌的高回收率。通常，高质量的MAG可以从最丰富的环境中成功地组装。本研究中确定的两种细菌来源被归类为Anaeromyxobacter dehalogenans和Marinobacter sp.。一些属Marinobacter物种的菌群可以降解烷烃物质，而A. dehalogenans可以利用广谱的电子受体用于厌氧呼吸。
图2. 鉴定（a）盐池（b）盐水和（c）土壤的微生物组。桑基图（左）显示了从分类树的根源到更具体的水平的读取流程，基于Kraken 2；Krona图（右）基于Kaiju注释。
关于嗜盐生物的适应策略，已有大量的研究。关于流体包裹体中盐古菌（Haloarchaea）的生存，已知H. volcanii通过利用活性物质和由Microcoleus chthonoplastes分泌的甘油作为碳源。Haloarchaea具有许多生活史策略，它们能够在多种压力源存在的环境下生存，包括高渗透压、盐分和温度波动、厌氧环境以及高剂量的电离和紫外线辐射等，它们具有许多应激相关蛋白质保护基因。盐池中的液体夹杂物的存在使我们可以对在此环境生存的微生物进行研究，并与盐水库和土壤微生物相比较，使用功能分析来量化盐池中多种抗性相关的基因。Halophiles能够在高盐、高渗透压、缺水、冻融循环和干燥等多种环境下存活。通过两种途径来调节渗透压（图3），从而适应高渗透压力。第一种被称为“盐积累”的方法，主要通过增加内部盐分浓度，主要是K+的积累，从而防止水分流出。第二种方法是“盐析出”策略，通过生物合成溶质以增加内部渗透压。大多数细菌产生的最常用的有机相溶质包括海藻糖、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、葡萄糖基甘油和二甲基磺基丙酸酯。有证据表明，一些细菌也可通过甘油用于渗透调节和应对其他环境胁迫。
图3. 基于与盐池、盐水库和土壤的渗透压调整相关的基因相对丰度的热图表示。颜色表示相对丰度高低，白色表示低丰度，深蓝色表示高丰度。
在高渗透压期间，通常通过细菌磷脂或厌氧呼吸来排出Na+和K+积累的能量源。Haloarchaea不依赖于用于ATP合成的细菌，而是通过硝酸盐还原酶呼吸获得所需的细胞能量。根据基因丰度的分析结果，在盐池和盐水库中观察到与钾摄取蛋白和电压门控钾通道有关的大量基因，表明“盐积累”策略在该环境下的微生物组内是常见的。这些基因的相对丰度在盐池比盐水库微生物组高，可能由于前者中的Haloarchaea的比例较高。宏基因组分析还揭示了盐池和盐水库样品中的较高丰度的H+/K+相关的基因，这些基因在钾离子渗透的过程中发挥作用。对于“盐析出”策略，与脯氨酸和胞外代谢相关的基因，只有在盐水库中的丰度较高。有趣的是参与甘氨酸甜菜碱生物合成途径的基因在土壤生物群中的丰度最高。在如此高浓度的盐环境下，钾可以防止在低温下胞质溶液被冻结。高盐环境中的新陈代谢，或者在任何类型的压力下都需要相当大的能量供生物有机体生存。Haloarchaea通常随着氧气含量的增加而增加，但氧气在盐水中的溶解度有限。一些物种，例如haloferax mediterranei，已经开发出新的生活史策略，即便在没有氧气的情况下也能够生存和生长。其他嗜氧物种也可以使用替代电子受体用于厌氧呼吸，包括硝酸盐、亚硝酸盐、富马酸胍、二甲基亚砜和三甲胺氧化物。在目前的研究中，使用盐池、盐水库和土壤的功能基因分析来确定与厌氧呼吸有关的基因，其中许多属于铁硫钼醛家族（图4a）。这些分析表明，所有三种生态系统中的厌氧呼吸的主要模式是通过硝酸盐到氮气。所涉及编码硝酸盐还原酶，亚硝酸盐还原酶，一氧化氮还原酶和氮化亚氮还原酶的基因比砷酸盐还原酶、DMSO还原酶和TMAO还原酶的基因丰度高。对于硝酸盐还原酶的基因丰度在盐池和盐水库的丰度中高于土壤。虽然在土壤中通常发生氮固定过程，但盐池和盐水库中的存在较高丰度的卤素物代谢多功能性时，可以在需要时使用替代终端电子获得者。
图4. 基于UNIREF 90和UNIREF50的KO和EC号进行功能基因注释。（a）厌氧呼吸（b）UV保护（c）氧化应激（d）应激蛋白。盐池用深蓝色表示，盐水库为浅蓝色，土壤为棕色。Cyanobacteria作为主要的生产者，可以在地下的黑暗环境中生存。相反，盐池微生物组具有相当大的抵抗高能辐射损伤的能力。Haloarchaea通过合成类胡萝卜素以及其基因组本身的高GC含量，来保护它们的DNA免受激烈的紫外线辐射和电离辐射。作者的分析（图4b）揭示了高氧化碱环境（盐池和盐水池）中包含较高的抗性基因，相比于土壤环境。鉴于地下没有紫外线辐射，很可能是相关作用的酶是高渗透压胁迫的产物。细胞代谢可以产生大量的反应性氧物质（ROS），并且胁迫（包括渗透压）加剧。因此，我们评估了参与ROS的基因。在所有三个微生物体中，参与氧化应激反应的基因是明显的（图4c）。存在相当高丰度的过氧化氢酶，超氧化物歧化酶将超氧化物催化到盐池和盐水库环境的分子氧中。盐池中的过氧化酶基因的相对丰度高于比土壤和盐水库微生物群。超氧化物歧化酶Cu-Zn家族和Fe-Mn家族在盐池最高。编码耐受性的基因使得Haloarchaea能够在盐水中实现生存和增殖。在盐池、盐水库和土壤微生物中鉴定的相关基因如图4d所示。编码不同类型的休克反应蛋白的基因丰度大幅增加。噬菌体休克蛋白的生理作用更广泛，包括内膜渗透率的调节。盐池中编码热休克蛋白和冷冲击蛋白的高丰度基因表明，即使盐矿中存在稳定的温度（约17℃），盐池的微生物组的成员也可以耐受生物物理的挑战。色氨酸合成酶与细菌中的生物膜形成有关，根据H. Volcanii的研究，生物膜提供能量来源，水合细胞外聚合物物质（EPS）可防止干燥并保护免受其他胁迫。此外，生长速率和耐受性存在空间异质性。通过在盐池和盐水库（图4d）中编码的古菌蛋白和趋化性响应的高丰度基因进一步证实了这一点。甘油可以在微生物应对外界环境压力的耐受性和寿命中发挥关键作用（见上文）。已知参与甘油代谢的基因是根据Williams等人进行的基因组调查存在于Haloarchaea中。在Haloarchaea中，通过甘油-3-磷酸途径（G3P）或二羟基丙酮（DHA）途径代谢甘油。因此，作者对参与能量代谢的基因进行了功能分析，重点是甘油利用率（图5）。
图5. 基于UNIREF 90和UNIREF50的KO和EC号进行功能基因注释。基因与甘油利用和其他蛋白质有关。盐池用深蓝色表示，盐水库为浅蓝色，土壤为棕色。结果表明G3P代谢途径对于盐池内的微生物来说是重要的。这与盐池、盐水库和土壤中甘油脱氢酶的基因的低丰度一致，这是DHA途径中使用的初级酶，它将甘油氧化给DHA然后由DHA激酶磷酸化至二羟基丙酮磷酸酯（DHAP）。在G3P途径内，甘油通过甘油激酶磷酸化至甘油3-磷酸盐，然后通过G3PDH氧化至DHAP。代谢中间DHAP在其中产生糖酵解循环，并通过果糖比磷酸羟烷基酶可逆地代谢为果糖1,6-双磷酸盐。果糖二磷酸醛糖酶参与糖酵解、葡萄糖生成，其下游能够产生ATP。值得注意的是，甘油是唯一具有足够低分子量和高溶解度的唯一相容的溶质之一，以将水活性降低到饱和NaCl或低于饱和NaCl的水平。有趣的是，图5还揭示了与土壤、盐池和盐水库之间的不同之处。虽然两个系统利用丙酮酸激酶，其催化丙酮酸对磷酸丙酮酸的不可逆转化。与盐池和盐水库微生物组相比，在土壤中，丙酮酸磷酸二基酶有更高的丰富度。而在盐池和盐水库微生物组中，与土壤相比，丙酮酸含量大得多，从而减轻渗透胁迫的一些影响。在几种陨石中检测少量宿主，其中一些源自火星，支持了微生物仍然存在于火星上的概念，因为地球和火星有类似的地质过去。莱科等人提议，在火星上寻找生命，应该涉及寻找充满卤素的环境。Haloarchaea在流体包裹体内生存无限期时间的能力使它们成为天体学的模型。火星存在地下盐水的可能性提高了有关推定火星生命的可能栖息地类型的方向。目前的研究为NaCl盐的夹杂物中的微生物组提供了见解，并且功能分析表明，许多基因，例如与甘油代谢相关的基因，可以在这些夹杂物内高度存在。在这些流体夹杂物内的微生物是无活性的，并且在泄漏状态它们是否保持活性尚未得到解决。值得注意的是，盐池的微生物学不同于附近的盐水库的微生物。本研究表明，盐池结构可以提供超越地球的推定生活方式的栖息地，包括火星地下环境。火星2020研究计划有四个主要目标：评估火星天体的栖息地，寻找潜在的生物和古代微生物生活的迹象，以及来自地下的环境样本，并为人类勘探做好准备。我们期待着这些调查结果以及旨在获得和评估火星地下环境的居住地的未来任务。
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