科研 | mSphere：小学生舌头菌群组成与龋齿发生的关系

2021-07-15 微生态

在龋齿的背景下存在一个动态变化的舌微生物群。虽然龋齿无疑是由牙菌斑微生物群的菌群失调引起，但从更广阔的角度来看整个口腔作为一个微生物群落，可能会为确定龋齿的病因提供一个新的视角。

编译：微科盟R.A，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

龋齿是一种常见的慢性口腔疾病，其表型是组织脱矿和有机物质分解，导致空洞或蛀牙。这种疾病的病因涉及定居在牙齿表面的牙菌斑微生物群的产酸。成年人舌微生物群落由两个共生群组成，它们的比例与患龋牙齿的数量有关。本研究探讨了小学生舌微生物群的变化及其与龋齿经历的关系。作者检测了138名6-7岁和11-12岁儿童(分别为61名和77名儿童)的舌微生物群。通过对16S rRNA 基因 V1-V2区序列测定，确定细菌组成。共生网络分析表明，儿童舌微生物群中存在两组共生优势菌。没有龋齿病史的儿童的微生物群显示，与有龋齿病史的儿童相比，主要由Neisseria subflava, Porphyromonas pasteri和Fusobacterium periodonticum组成的共生群体的相对丰度显著增高，这与有龋齿病史的成年人的相对丰度一致。作者的研究结果描述了没有龋齿病史的小学生的舌头微生物群组成，并支持了龋齿经历伴随着舌头微生物群变化的可能性。本研究的结果预示：在龋齿的背景下存在一个动态的舌微生物群。虽然龋齿无疑是由牙菌斑微生物群的菌群失调引起，但从更广阔的角度将整个口腔作为一个微生物群落来看，可能会为确定龋齿的病因提供一个新的视角。

论文ID

原名：Tongue Microbiota Composition and Dental Caries Experience in Primary School Children

译名：小学生舌头菌群组成与龋齿发生的关系

期刊：mSphere

IF：4.389

发表时间：2021.4.28

通讯作者：Yoshihisa Yamashita

通讯作者单位：九州大学牙科学院口腔卫生，生长与发育科预防和公共卫生牙科

实验设计

结果

本研究对138名6-7岁和11-12岁的小学生(分别为61名和77名)的舌微生物群进行了测序。从这些样本测序获得了3,478,851个质量片段，与16S rRNA 基因序列的 V1-V2区相对应，随后根据97% 的序列相似性将这些序列分配给302个种水平的操作分类单元(OTUs)。其中，21个 OTU对应的口腔共生微生物是儿童舌微生物群中的主要类群(表1) ，它们在每个个体中平均相对丰度为79.0 ± 6.4% (均值±标准差)。

表1 在138名小学生舌头微生物群中平均相对丰度> 1％的21个主要的操作分类单元（OTUs）。

^aeHOMD中的所有分类单元ID在细菌名称后的括号中给出。^b在扩展的人类口腔微生物数据库（eHOMD）中未发现≥98.5%的比对相似性。

利用 FastSpar进行的共生网络分析表明，舌部微生物群中的主要共生微生物是两个不同共生群的一部分(图1A)。每个共生群体的成员列在补充材料的表 S1中所给出。第一组为细菌类群，如Prevotella histicola,Veillonella parvula, Streptococcus salivarius, Prevotella pallens 和Prevotella melaninogenica(共生组 I，图1B) ; 第二组为Neisseria subflava,Porphyromonas pasteri, Fusobacterium periodonticum, Haemophilus parainfluenzae和 S. oralis subsp. dentisani (共生组 II，图1C)。两个共生群的相对丰度呈反比关系(Spearman 相关系数 =-0.91)（图S1）。

图1 根据序列丰度间 SparCC 相关系数建立的138例儿童舌微生物群的共生网络。每个节点对应于一个独特的操作分类单位(OTU) ，当其值大于0.5和 P 值小于0.001时，用边表示相关性。每个节点的大小表示每个 OTU 的平均相对丰度。(a)所有 OTU在图中都显示为节点。属于两个主要网络(共生组I和 II)的 OTUs 分别被着红色和蓝色。(b)共生组I。每个节点上对应于每个 OTU 的细菌名称已给出。扩展的人类口腔微生物组数据库中的口腔分类群 ID 在细菌名称后面的括号中提供。细菌名称对应于较小的 OTUs (相对丰度 <0.5%)用数字表示，并在补充材料的表 S1中描述。(c)共生组II 。每个节点上对应于每个 OTU 的细菌名称被描述。扩展的人类口腔微生物组数据库中的口腔分类群 I在细菌名称后面的括号中提供。

图S1 舌部微生物群中两个共栖类群的相对丰度。

表S1 与共生类群相对应的OTUs细菌类群。

^a 图1中OTUs的编号。^b在扩展的人类口腔微生物数据库（eHOMD）中未发现≥98.5%的比对相似性。

不同性别、年龄和牙列阶段（ dentition stages）的儿童舌微生物群的相对丰度随牙齿健康状况的不同而不同，但无显著差异(图2)。共生组 II 在没有龋齿经历的儿童和口腔卫生状况较好的儿童中明显占优势。在唾液中变形链球菌水平较低的儿童的微生物群中也观察到该共生组较高的相对丰度(Dentocult SM 得分较低)。另外，共生组 I 在 Dentocult SM 和 DI-S 分数较高的儿童的微生物群中占优势。没有龋齿经历的儿童和Dentocult SM 和 DI-S分数较低的儿童中，II 组共栖分数与 I 组共栖分数的比值明显升高。

图2 不同条件下小学儿童舌微生物群中两个共栖类群的相对丰度和第 II 组共栖类与第 I 组共栖类的比值(已用log2- 转换)。点表示平均值，误差条表示95% 的置信区间。Student’st 检验 ***，p < 0.001; *，p < 0.05。

除了在 DI-S 评分较高的儿童中观察到较高的微生物丰富度(图S2)，这些临床参数与舌微生物群的 α 多样性指数之间没有显著的关系。与此相反，基于 unweighted UniFrac 指标的主坐标分析(PCoA)图表显示，有龋齿经历和无龋齿经历的儿童在主坐标1方向上存在差异，6-7岁和11-12岁儿童在主坐标2方向上存在差异(图3)。与舌微生物总体组成的显著相关性通过方差多变量分析(PERMANOVA F = 2.92和 P = 0.001; F = 2.04和 P = 0.02)得到证实，而与性别、齿期、 DI-S 或龋齿无显著相关性。根据年龄和龋齿经历分为4组，各组之间链球菌和Neisseria的相对丰度存在显著差异(图S3)。在 UniFrac 图中，根据唾液中主坐标1方向的变形链球菌水平(PERMANOVA F = 2.72和 P < 0.001) ，也可以对儿童进行鉴别（图S4）。

图S2 不同条件下小学生舌头微生物区系的Alpha多样性指数。点表示平均值，误差条表示95% CI。

图3 利用 unweighted UniFrac 距离度量方法绘制了138名小学生舌微生物群相似关系的主坐标分析图。使用不同的颜色描绘出不同类别龋齿经历(左)和年龄组(右)的儿童对应的点。两个坐标轴分别解释了20.7% 和10.6% 的方差。

图S3 儿童舌微生物膜中主要细菌属（平均相对丰度）的相对丰度。孩子们以年龄组（6至7到11至12岁）和龋齿经历（CE，龋齿; CF，无龋齿）进行了分组。使用方差分析结果*，P <0.05。

图S4 主坐标分析图，展示了138名小学生使用未加速的Unifrac距离度量的舌微生物群相似关系。唾液中含有不同水平的Streptococci的儿童的点被不同的颜色着色。两个轴分别解释了20.7％和10.6％的方差。

虽然6-7岁和11-12岁儿童的舌微生物总体组成有所不同，但共生组 II 在无龋儿童中显著多于有龋齿经历的儿童(6-7岁和11-12岁)(图4)。经过线性效应大小判别分析 (LEfSe)进一步发现，6至7岁和11至12岁的儿童中，分别有10个和6个类群与龋齿的存在或缺失有关(表2和表3)。其中，S. oralis subsp. dentisani属于共生组 II，是与两个年龄组无龋齿经历有关的分类单元。相比之下，Streptococcus parasanguinis，一个共生组的成员，分辨出了在两个年龄组的儿童的牙齿龋齿舌微生物群。

图4 在6ー7岁和11ー12岁有龋齿经历和无龋齿经历的小学生舌微生物群中共生组 II 的相对丰度，Student’s t检验，*，P < 0.05。

表2 在6ー7岁有无龋齿儿童舌微生物群中细菌类群对应的丰富有差异的 OTUs。

表3 在11ー12岁有无龋齿儿童舌微生物群中细菌类群对应的丰富有差异的 OTUs。

讨论

本研究的结果表明，小学儿童舌微生物群主要由共同的口腔共生微生物组成，包括N. subflava和P. melaninogenica (表1) ，并由两个相互竞争的共生群体组成(图1)。这两个共生群体大多与先前研究中在老年人舌头微生物群中发现的微生物群的组成结构一致; 我们的研究结果表明，由特定的土著微生物群组成的舌头微生物群是在儿童期初级牙齿和永久牙齿之间的过渡阶段建立起来的。

这项研究还表征了没有龋齿的历史的小学生的舌微生物群。在没有龋齿经历的儿童的微生物群中，两个主要共生的微生物群中主要由N. subflava, H. parainfluenzae, P. pasteri和F. periodonticum组成，并且这几个物种是显著地占优势(图2) ，这与龋齿经历较少的老年人的微生物群组成一致。最近受龋齿影响的6ー7岁和11ー12岁儿童的微生物群中共生组的相对丰度存在显著差异(图2，图4)。这些结果支持了龋齿伴随着舌头微生物群变化的可能性。

近年来，利用鸟枪法宏基因组学分析研究发现，Neisseria, Haemophilus和Rothia属与口腔健康密切相关，而Prevotella菌属(主要存在于共生组I中)和Streptococcus mutans与龋病密切相关。另一宏基因组学研究表明，龋齿患儿龈上微生物群中的 Prevotella属、 Veillonella属和 Atopobium属(本研究属于共生I类)比无龋齿患儿更为丰富。此外，考虑到在以前的几个研中口腔 Prevotella物种已被作为龋齿相关分类群，我们的结果与以前的研究结果是一致的。然而，一项大规模的双胞胎研究表明，Prevotella pallens 和 Veillonella spp.是与无龋齿相关的遗传类群，这与我们的研究结果不一致。因此，需要进一步深入研究，以阐明主要口腔共生微生物丰度比值与龋齿之间的关系。

这项横向研究无法确定动态的舌头微生物群是龋齿的原因还是龋齿发展的结果。尽管如此，考虑到唾液Streptococci mutans的水平与舌微生物群中两个共生菌的比例有明显的相关性(图2) ，而牙齿修复体，如树脂和金属，不太可能导致舌微生物群的变化。在易患龋齿的口腔环境中，变形链球菌在菌斑微生物群中的过度生长与舌微生物群的变化是相一致的。未来的纵向和微生物学研究将有助于澄清舌头微生物群与龋齿易感性之间的关系。

在共生组 II 的成员中，S. oralis subsp. dentisani被确定为两个年龄组(6-7岁和11-12岁)无龋齿史儿童的关键鉴别种(表2和表3)。S. oralis subsp. dentisani是从21例无龋患者的牙菌斑中首次分离出来的菌种。据进一步报道，该物种通过产生有效的细菌素，抑制包括变形链球菌在内的口腔病原体的生长，并通过精氨酸分解途径缓冲 pH 值，从而有望成为具有抗龋潜力的口服益生菌。我们的结果进一步支持这一分类群作为一个有益于口腔健康的物种的潜力，虽然它在降低龋齿易感性方面的作用还不清楚。

在这项研究中另一个值得注意的物种是S. parasanguinis，是适用于有龋齿经历的儿童(表2和表3) 的一个鉴别分类单元，以前曾涉及严重幼儿龋齿的儿童的菌斑微生物群。然而，这些共生链球菌也被报道在亚硝酸盐的存在下限制变形链球菌的生长和生物膜的形成。因此，寄生虫与龋病的关系应引起重视。

本研究根据小学生整个一年的牙科检查结果，评估了没有龋齿经历的小学生的舌头微生物群组成。然而，在第一次牙齿检查之前的龋齿乳牙丢失没有被计算在内。尽管如此，所有儿童在第一次牙齿检查时都不到7岁零3个月，除了偶尔缺失一些门牙外，几乎都有了完整的乳牙系统。龋齿经历的细节，包括在乳牙也被包括在这项研究中。相比之下，缺乏基于牙釉质龋病观察的龋病诊断是本研究的一个主要限制。在学校进行的牙齿检查中，龋齿是通过目视检查来评估的，因此，在龋齿诊断中，只有明显的牙齿腐蚀被诊断到。要准确评估龋齿的经历，需要更严谨的诊断，例如根据国际龋齿检测和评估系统(ICDAS)的标准进行诊断。另一个限制是这项研究无法阻止孩子们在采集样本前清洁他们的舌头。虽然随着时间的推移，舌头的微生物群组成相对稳定，但有可能一些儿童的舌头微生物群不同于通常的组成。

我们的结果提示，在龋齿的背景下存在一个动态变化的舌微生物群。虽然龋齿无疑是由牙菌斑微生物群的菌群失调引起，但从更广阔的角度来看整个口腔作为一个微生物群落，可能会为确定龋齿的病因提供一个新的视角。