中科院 | Environ Pollut：环境浓度水平的氯氮平会诱导中国稀有鮈鲫脂肪毒性和肠道微生物群落失调

2021-07-12 微生态

CLZ主要通过刺激SREBP1和影响细菌次生胆酸生物合成活性来诱导Gobiocypris rarus的脂肪毒性。

编译：微科盟道友留步，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

氯氮平（Clozapine，CLZ）是一种水环境中常见的神经活性药物。尽管CLZ对水生非靶生物的心脏毒性、发育毒性和神经毒性已有报道，但其脂肪毒性及其机制尚不清楚。因此，在本研究中，将2个月大的中国稀有鮈鲫分别暴露于0，0.1，1和10 μg/L CLZ 90天。结果表明，暴露于CLZ后，雌鱼血脂明显升高（p<0.05）。此外，各暴露组肝细胞空泡化明显，肝脂滴积聚明显（p<0.05）。在1和10 μg/L CLZ暴露组中，甾醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)和脂肪酸合酶(FAS)活性显著上调(p <0.05)。各试验组肠绒毛细胞边界明显解体，粘液分泌增加（p<0.05）。此外，暴露于CLZ后，肠道菌群多样性增加，其中Proteobacteria, Firmicutes和 Bacteroidetes的相对丰度显著增加（p<0.05）。此外，暴露于1 μg/L的CLZ后，中国稀有鮈鲫内细菌次生胆汁酸生物合成活性显著提高（p<0.05）。因此，我们的研究结果证实了CLZ通过刺激SREBP1和影响细菌次生胆汁酸生物合成活性来诱导中国珍稀鲦鱼的脂肪毒性。

论文ID

原名：Environmentally relevant concentrations of clozapine induced lipotoxicity and gut microbiota dysbiosis in Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus)

译名：环境浓度水平的氯氮平诱导中国稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)脂肪毒性和肠道微生物群落失调

期刊：Environmental Pollution

IF：8.071

发表时间：2021.5

通讯作者：查金苗

通讯作者单位：中国科学院生态环境科学研究中心饮用水科学技术重点实验室；中国科学院生态环境科学研究中心工业废水处理与回用北京重点实验室；中国科学院大学

实验方法

选择2个月大的Gobiocypris rarus作为实验对象，并在适宜的环境条件下进行培养。进行暴露实验时，氯氮平（Clozapine，CLZ）浓度分别设置为0.1，1和10 μg/L，并持续暴露90天，对照组只含有丙酮溶剂（＜0.01%）。所有处理含有三个重复组，每个重复组包含30条鱼。暴露实验结束后，将所有鱼麻醉并宰杀。根据性腺来区别雌鱼和雄鱼；采用肝素化微柱（3~4 μL）按性别采血，将血液样本混合（每5条鱼），并离心获得血浆；取鱼肝并称重，随后对鱼肝进行病理学分析，同时，取一定量的鱼肝用于酶活性，另取一定量的鱼肝通过PCR分析基因表达；在无菌条件下，取鱼肠，用于组织学分析及肠道微生物群落分析。

实验过程中通过高效液相色谱分析CLZ的浓度。三个暴露组，测得的实际浓度分别为0.087 ± 0.003 (87%)，0.84 ± 0.04 (84%) 以及 8.02 ± 0.27 (80%) μg/L。测试了血浆甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-HCO）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，以衡量脂质水平；测试了SREBP1、FAS、乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR），以衡量酶活性；对鱼肝及肠道样本进行处理，用以进行组织学分析；采用实时PCR分析了鱼肝中的基因表达，引物信息见表S1；采用16S rRNA，对肠道菌群进行了分析，并采用QIIME平台及R语言对测序结果进行分析处理。

采用方差分析（ANOVA）和Dunnet多重比较试验，测定体细胞指标、脂质水平、酶活性、RT-PCR、油红O染色面积和粘液覆盖率的差异。所有统计分析均采用SPSS17.0软件进行，所有数据以三个重复的平均值±标准差来表示。p小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

1 鱼类死亡率和生长率

在90天的暴露期内，对照组及所有暴露组均未观察到死鱼。暴露组雌鱼体重分别增加8%、20%和11%（p<0.05）；表1），而雄鱼的体重没有明显变化（表1）。雄鱼的HSI在第1和第10天分别显著增加了5.55%（1 μg/L暴露组）和10.49% （10 μg/L暴露组）（p<0.05；表1），而在所有暴露组中未观察到雌鱼的显著变化（表1）。雌鱼的条件因子（K）在仅在1 μg/L时显著增加5.55%（p<0.05；表1）。然而，所有暴露组的雌鱼和雄鱼的体长与对照组没有显著差异（表1）。

表1 暴露于CLZ（0.1，1和10 μg/L，90天）后， Gobiocypris rarus的躯体指标。

数值以平均值± 标准差表示（n=3）。组间具有显著差异（p<0.05，ANOVA），其差异以右上角字母表示。

2 血脂水平

雌鱼血浆甘油三酯（TG）水平在1 μg/L和10 μg/L暴露组中，分别显著升高69%和60%（p<0.05；表2）。总胆固醇（T-CHO）水平在0.1、1、10 μg/L暴露组中，分别下降58%、54%和54%（p<0.05；表2）。暴露于0.1、1、10 μg/L后，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平分别下降27%、25%和25%，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平分别下降29%、48%和23%（p<0.05；表2）。

在雄鱼中，TG水平在1 μg/L和10 μg/L暴露组中，显著升高41%和83% μg/L（p<0.05；表2）。T-CHO水平在0.1、1、10 μg/L暴露组中，分别显著升高21%、67%和23%，而HDL-C水平在0.1、1、10 μg/L暴露组中，分别显著降低23%、17%和21%（p<0.05；表2）。另外，10 μg/L暴露后LDL-C水平显著升高35%（p<0.05；表2）。

表2 暴露于CLZ（0.1，1和10 μg/L，90天）后，Gobiocypris rarus脂质水平。

数值以平均值± 标准差表示（n=3）。*表示组间具有显著差异（p<0.05，ANOVA）。

3 肝酶活性

在经0.1、1和10 μg/L CLZ暴露后，Gobiocyprisrarus的肝酶活性出现显著变化。雄鱼的FAS活性分别显著上调19%、19%和13%，而雌鱼的FAS活性分别显著上调17%和21%（p<0.05；表3）。然而，CLZ暴露后，雌性ACC1活性（分别下调13%、18%和16%）和雄性（分别下调10%、17%和14%）明显下降（p<0.05；表3）。此外，雌鱼的SREBP1活性显著上调10%、11%和24%，雄鱼SREBP1活性分别显著上调6%和8%（p<0.05；表3）。有趣的是，10 μg/L CLZ暴露后，雄鱼的HMGCR活性明显下调了18%（p<0.05；表3），而在雌鱼中未观察到显著变化（表3）。

表3 暴露于CLZ（0.1，1和10μg/L，90天）后，Gobiocyprisrarus的肝脏酶活性。

数值以平均值± 标准差表示（n=3）。*表示组间具有显著差异（p<0.05，ANOVA）。

4 肝脏组织病理学

在正常肝细胞中，观察到保存完好的细胞质、球形细胞核和明显的细胞间隙（图1A和B）。然而，在所有暴露组均观察到肝细胞空泡化、细胞间隙疏松、细胞核固缩和变形（图1）。此外，暴露于1和10 μg/L CLZ后，在雌鱼中观察到不同大小的脂滴（图1A和B），而在所有暴露于CLZ的雄鱼中均观察到了这一现象。对于雌鱼，在1 μg/L暴露组中油红O染色覆盖率（脂滴）显著增加；对于雄鱼，所有暴露组中，油红O染色覆盖率（脂滴）均显著增加（p<0.05；图1C和D）。

图1 暴露于CLZ（0.1，1和10 μg/L，90天）后，雌性（A）和雄性（B）Gobiocypris rarus的肝脏组织病理学。雌性（C）和雄性（D）肝细胞油红O染色面积；数据以平均值±标准差的形式表达。*表示实验组与对照组存在显著差异（p<0.05，ANOVA）。V表示空泡化；DN表示细胞核变形；PN：核固缩。LD：脂滴。

5 CLZ暴露对脂质代谢相关基因表达的影响

与对照组相比，在所有暴露组中，雌鱼的srebp1、fasn、acc1和plin1的转录水平均显著上调（变化倍数>2）（p<0.05；图2），而hmgcs1、fdft1、idi1和plin2的转录水平仅在1 μg/L暴露组显著上调（p<0.05；图2）。此外，srebp2、dgat1a和dgat1β 转录水平在1和10 μg/L暴露组中显著上调（变化倍数>1.5）（p<0.05；图2）。

在雄鱼中，CLZ暴露后，fasn、acc1、hmgcr1和plin1的转录水平显著下调（变化倍数<−1.5）（p<0.05；图2）。10 μg/L CLZ 处理后，srebp2和idi1的转录水平显著上调（变化倍数>1.5），而hmgcs1在1和10 μg/L CLZ处理后显著上调（倍数变化>1.5）（p<0.05；图2）。此外，10 μg/L CLZ处理后，cyp7a1的转录水平在两种性别中都明显下调（变化倍数<−2） p<0.05；图2）。

图2 暴露于CLZ（0.1，1和10μg/L，90天）后， Gobiocypris rarus肝脏脂质代谢相关基因转录水平的热图。数值以平均值±标准差表示（n=3）。

6 肠道组织病理学

在正常肠道中，肠粘膜显示许多排列整齐的绒毛和致密的肠上皮（图3A和B）。CLZ暴露后，小肠绒毛细胞边界明显解体（p<0.05）；图3A和B）。此外，CLZ暴露后，观察到AB-PAS染色覆盖率（粘液分泌）增加（p<0.05；图3C和D）。

图3 暴露于CLZ（0.1，1和10μg/L，90天）后，Gobiocypris rarus肠道H&E染色和AB-PAS染色的代表性横切面。A和C，雌性的代表性切片和粘液覆盖率。B和D，雄性的代表性切片和粘液覆盖率。从每组9个切片收集C和D的数据，并以平均值±标准差的形式表示（n=3）。*表示实验组与对照组存在显著差异（p<0.05，ANOVA）。白色箭头表示肠绒毛细胞边界解体。黑色箭头表示杯状细胞的粘液室。

7 肠道微生物群失调

在对照组中，Proteobacteria，Firmicutes，Bacteroidetes和 Fusobacteria是Gobiocyprisrarus肠道中4个优势菌门（图4A（a）和图4B（a））。雌鱼肠道中Proteobacteria的相对丰度远高于雄性，而雌鱼肠道中Fusobacteria的相对丰度较低（图4A（a）和图4B（a））。CLZ暴露后，Firmicutes 和 Bacteroidetes的相对丰度显著增加，而Proteobacteria丰度显著降低（p<0.05；图4A（a）和图4B（a））。雌鱼肠道Fusobacteria的丰度在10 μg/L暴露组中显著增加，而各暴露组中，雄性肠道Fusobacteria丰度显著降低（p<0.05；图4A（a）和图4B（a））。此外，雌鱼的Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值显著升高（p<0.05；图4A（c））。然而，未观察到雄鱼的F/B比率有显著变化（图4B（c））。在雌鱼中，经1 μg/LCLZ处理后，Shannon指数和Chao1指数显著升高（p<0.05；图4A（d）和4B（d））。此外，雄鱼的Chao1指数在0.1 μg/LCLZ处理后显著增加，而Shannon指数在0.1和1 μg/L CLZ处理后显增加（p<0.05；图4A（e）和B（e））。此外，在PC1轴上（55.77%），雌鱼经1 μg/LCLZ处理后与对照组区别明显；在PC1轴（36.33%）和PC2轴（24.6%）上，雄鱼经0.1和1 μg/L CLZ处理后与对照组区别明显（图4A（b）和4B（b））。暴露于1 μg/L CLZ后，雌、雄鱼肠道内细菌次生胆汁酸生物合成活性均显著高于对照组（p<0.05；图4A（f）和B（f））。

图4 对照组和CLZ处理组雌鱼（A）和雄鱼（B）肠道菌群组成和多样性的变化。（a）前10个优势菌门的相对丰度；（b）基于加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）；（c） F/B（Firmicutes/Bacteroidetes）比率；（d） Shannon指数与Wilcox test；（e）采用Wilcox test的chao 1指数；（f）肠道次生胆汁酸生物合成的细菌活性。*，p<0.05；**，p<0.01。

讨论

由于在水生环境中的相对浓度较高及其对水生生物的危害，CLZ对水生生物的心脏毒性、发育毒性和神经毒性已经被许多研究者所报道。然而，CLZ的脂肪毒性及其潜在机制尚不清楚。在本研究中，在暴露于CLZ（环境浓度水平） 90天后，观察到Gobiocypris rarus体重增加、血脂异常、肝脂滴积聚和肠道菌群失调，表明环境浓度水平的CLZ引起了Gobiocypris rarus脂肪毒性和肠道菌群失调。

肥胖是脂质代谢紊乱最直接的指标。在本研究中，观察到雌鱼体重明显增加（p<0.05；表1）。此外，雌鱼的条件因子在1 μg/L CLZ处理后显著增加（p<0.05；表1）。同样，曾有报道表明抗精神病药物奥氮平诱导斑马鱼体重增加。然而，在这项研究中，雄鱼的体重没有明显变化（表1）。同样，在人类中，CLZ处理后，女性比男性更容易体重增加。此外，抗精神病药物，包括奥氮平和舒必利，可诱导雌鱼体重增加，但不诱导雄鱼体重增加。有趣的是，先前的研究表明，男性的CLZ代谢率（约36.7 L/h）高于女性（约27.1 L/h）。因此，体重增加对性别特异性反应可能是CLZ药物代谢动力学存在差异。

血脂异常是导致脂质代谢紊乱的重要因素。在这项研究中，在暴露于1和10 μg/L CLZ的雌鱼体内和所有暴露组的雄鱼体内，观察到TG水平升高，HDL-C水平降低（p<0.05；表2）。同样，曾有研究表明，15 mg/kg/天CLZ暴露4周后，大鼠血清TG水平显著升高。此外，CLZ还可诱发精神分裂症患者的高胆固醇血症和高甘油三酯血症。此外，各暴露组雌鱼T-CHO水平均显著降低（p<0.05；表2）。胆固醇除了与组装的HDL-C一起分泌到血液中并部分转化为胆固醇酯和胆汁酸外，还可以分泌到性腺中用于类固醇激素的合成。因此，在本研究中，雌鱼T-CHO的减少可能是由于性成熟阶段（5个月大）性腺分泌雌激素合成所致。同样，Feng等人也报道了氟西汀极有可能诱发血脂异常。此外，在Gobiocyprisrarus肝细胞中还发现肝细胞空泡化和明显的脂滴积聚。这也表明了对Gobiocypris rarus的脂肪毒性作用。这与Wang等人的研究结果一致，他们发现暴露于12.5、25和50 mg/kg CLZ的大鼠肝脏中有脂质积聚。此外，在本研究中，雄鱼的油红O染色覆盖率（脂滴累积）大于雌鱼。Pan和Fallon在一项以人群为基础的研究中发现，CLZ治疗后，男性的非酒精性脂肪肝发病率高于女性，这可能解释了脂质积聚的性别差异反应。因此，我们的研究结果表明，环境相关浓度的CLZ引起了Gobiocypris rarus的脂肪毒性。

甾醇调节元件结合蛋白1（SREB1）是调节鱼类脂肪合成的关键转录因子。在本研究中，在所有暴露组的雄鱼以及1和10 μg/L暴露组的雌鱼，SREBP1活性显著上调（p<0.05；表3）。同样，报道表明CLZ刺激培养的人脑胶质瘤细胞和小鼠细胞的SREBP转录。SREBP1通过刺激其下游基因脂肪酸合成酶（FAS）来调节脂肪生成。FAS调节脂肪酸从头合成。在本研究中，在所有暴露组的雄鱼中以及1和10 μg/L暴露组的雌鱼，FAS活性显著增加（p<0.05；表3），而雌鱼fasn转录水平显著升高（p<0.05；图2）。这些结果表明，经CLZ暴露后，脂肪酸合成明显上调。位于细胞质中的ACC1向FAS提供丙二酸辅酶A，并参与新的脂肪生成。本研究中，CLZ暴露后，ACC1活性明显降低（p<0.05；表3）。奇怪的是，CLZ显著增加OLN-93少突胶质细胞中ACC1蛋白的表达，而急性CLZ给药后，大鼠肝脏中ACC1蛋白表达没有显著变化。这种差异可能是由于物种差异和暴露时间所致。HMGCR是胆固醇合成的限速酶。本研究中，雄鱼HMGCR活性显著降低，雌性和雄鱼的ACC1活性降低可能是由于肝脏中脂质积累过多（脂肪酸和胆固醇）引起的负反馈效应所致。基因dgat1α 和dgat1β参与TG合成，plin1是调节脂滴形成的关键蛋白。dgat1α，dgat1β，plin1转录水平的提高，可能是肝内脂滴积累的主要原因。虽然CLZ诱导水生生物脂质代谢紊乱的分子机制尚不清楚，但SREBP1下游基因SREBP1活性升高、mRNA表达水平的改变，表明刺激SREBP1及其下游基因的表达，是诱发稀有Gobiocypris rarus肝脏脂肪合成的重要机制。

肠道微生物群是进一步发现脂肪毒性机制的潜在靶点。本实验观察到CLZ暴露后，小肠绒毛细胞边界解体，粘液分泌覆盖率增加（p<0.05；图3）。肠绒毛表面的粘液层可分泌粘液以维持肠道微生物群的结构稳定性。粘液分泌覆盖率的增加表明肠粘膜屏障的结构和功能被破坏，从而导致肠道微生物群失调。同样，肠道的生理变化也与肠道微生物群的失调有关。α多样性反映了肠道微生物群的整体变化。Shannon指数和Chao1指数的增加表明，CLZ暴露后Gobiocypris rarus肠道微生物群的多样性和丰富度增加。PCoA图显示1 μg/L暴露组的雌鱼，0.1和1 μg/L暴露组的雄鱼与对照组差异明显（图4A（b）），表明CLZ改变了细菌群落。同样，最近的体外研究表明，第一代和第二代抗精神病药物对肠道微生物群具有直接活性。此外，在门水平上，雌、雄鱼肠道的Firmicutes和Bacteroidetes，在1 μg/L暴露组中均显著增加（p<0.05）；图4A（a）和4B（a））。Semova等人发现，Firmicutes可以增加肠上皮中的脂质，并影响斑马鱼的脂质吸收。此外，Li等人发现转基因肥胖鲤的F/B（Firmicutes/Bacteroidetes）比率高于野生对照组。本研究中，雌鱼的F/B比值增加（p<0.05）；图4A（c）），表明CLZ暴露可诱发雌鱼肥胖，这与雌鱼体重增加的结果一致。同时，我们的数据表明，细菌代谢途径相对丰富性的改变也证实了CLZ引起的肠道微生物群失调。一系列细菌生理活动，包括碳水化合物、氨基酸、甘氨酸、脂质、外源性物质、辅因子和维生素的代谢，在雌、雄鱼经1 μg/L暴露后均遭到破坏（p<0.05）；图S1和图S2）。其中，CLZ暴露能显著提高雌、雄鱼肠道此生胆汁酸合成菌的活性（p<0.05）；图4A（f）和4B（f））。胆汁酸代谢相关细菌属的相对丰度，包括Bacteroides, Lactobacillus，Fusobacterium和Bifidobacterium等，经CLZ处理后均显著增加（p<0.05）；图S3）。胆汁酸是由肝脏中的胆固醇合成的，并由肠道微生物进一步代谢为次级胆汁酸。总之，CLZ损伤肠粘膜，引起肠道菌群失调，增加细菌次生胆汁酸生物合成活性，导致胆固醇代谢异常。

结论

在本研究中，我们发现环境浓度水平的CLZ对中国稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）存在脂肪毒性。此外，环境浓度水平的CLZ会诱导Gobiocypris rarus肠道微生物群失调。并且，我们的研究结果证实，CLZ主要通过刺激SREBP1和影响细菌次生胆酸生物合成活性来诱导Gobiocypris rarus的脂肪毒性。